Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Resumen

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Resumen

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Introducción

El sistema nervioso de los vertebrados emerge de la placa neural como una capa homogénea de células neuroepiteliales. La comprensión de cómo se inducen los programas de desarrollo, codificados, y establecieron durante la regionalización de la placa neural es, en la actualidad, una meta importante en la biología del desarrollo. En comparación con otros sistemas, el embrión Xenopus experimentalmente susceptible es un modelo de elección para el análisis de los primeros pasos de ^1,2 desarrollo neural. Es fácil de obtener un gran número de embriones, y el desarrollo externo da acceso a los primeros pasos de neurulation ^3. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) el desarrollo embrionario. Micro-inyección de ARNm o morfolinos (MO), incluyendo OMs inducibles, junto con herramientas bioquímicas y farmacológicas, permite ganancia de función (GOF) y pérdida de función (LOF) y la alteración específica de las vías de señalización ^4,5 controlada. El blastocoel techo ectodermo, situado alrededor del polo animal de una blástula, o un embrión gástrula muy temprano, y se refiere como el "Cap Animal '(AC), es una fuente de células pluripotentes que puede ser programado por la manipulación de la expresión génica antes de la explantes preparación. En este manuscrito son protocolos detallados para utilizar X. explantes laevis AC para poner a prueba in vitro e in vivo mecanismos moleculares y procesos celulares desarrollo neuronal subyacente.

Una técnica se presenta, lo que permite la observación multa de patrones de expresión génica en un tubo neural renacuajo Xenopus, un paso preliminar en la identificación de señales de determinación de destino. Considerando que la observación de los tejidos planos montado se utiliza comúnmente en el estudio de embriones de pollo ^6, no ha sido descrito adecuadamente en Xenopus. La manipulación de la expresión génica mediante la inyección de ARNm sintético o MO en los blastómeros de 2 o 4 embriones en fase celular permite la programación de ACexplantes ^4. Por ejemplo inhibición de la vía proteína morfogenética ósea (BMP) por la expresión del anti-factor de BMP Noggin, da una identidad neural a las células ^de CA 3. El protocolo se detalla para llevar a cabo la exposición local y controlada en el tiempo de los explantes de corriente alterna a las señales extrínsecas a través de contacto directo con una perla de resina de intercambio aniónico. Finalmente se describe una técnica para el ensayo de características de desarrollo de los progenitores neurales in vivo mediante trasplante de explantes mixtos preparados a partir de células distintas programado disociados y re-asociados.

El embrión de rana es un poderoso modelo para estudiar el desarrollo neuronal temprana de los vertebrados. La combinación de la manipulación de la expresión génica con la explantación cultivos in vitro proporciona información importante en el estudio de la regionalización neuroepitelio, la proliferación, y la morfogénesis ^7-12. La programación de los explantes de CA permitido el desarrollo de un corazón funcional ex vivo ^13,14. El usoexplante de injerto ¹⁵ condujo a la identificación del interruptor transcripcional mínimo inducir el programa de diferenciación de la cresta neural ^16. La zona limitante intratalámica (ZLI) es un centro de señalización que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar el crecimiento y la regionalización del prosencéfalo caudal. Cuando se expone continuamente a Shh, las células neuroepiteliales coexpressing los genes del factor de tres de transcripción - BARH-como homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) y iroquois-3 (Irx3) - adquieren dos características del compartimento ZLI: la competencia para expresar shh, y la capacidad para segregar a partir de células de la placa neural anterior. Como un sistema modelo, la inducción de un destino ZLI en células neuroepiteliales será presentado ^8.

Estos protocolos tienen por objeto proporcionar y herramientas eficientes simples, baratas para los biólogos del desarrollo y otros investigadores para explorar el mec fundamentalhanisms de comportamientos clave de células neuronales. Estos protocolos son muy versátiles y permiten la investigación de una amplia gama de señales de determinación neuronales intrínsecos y extrínsecos. Permite a largo plazo en el análisis in vivo de compromiso de linaje neuronal, interacciones inductivas y comportamientos celulares.

Protocolo

Los experimentos cumplen con la regulación nacional y europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento.

1.-montaje plana de Xenopus laevis renacuajos anterior Tubo Neural Después de todo el montaje hibridación in situ

1. Obtener X. laevis embriones según los procedimientos estándar ^{de 4} y los años hasta que alcancen neurula etapa 26 y más años (según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo ^17.
2. Fix X. laevis renacuajos mediante su incubación en una solución de 4% de paraformaldehído (PFA). Roca y rotar los embriones en un vial de vidrio de 2 ml, de 1 a 1.5 hr a RT durante la etapa 26 a la etapa 38 embriones, 2 horas a RT para los embriones en etapas posteriores.
   PRECAUCIÓN: PFA es tóxico por contacto y un posible carcinógeno. Debe ser manipulado bajo una campana.
   NOTA: Uno X. laevis cría espor lo general fijado en un vial de vidrio de 2 ml, pero un vial de vidrio más grande puede ser utilizado.
3. Lavar los embriones en el mismo vial utilizando 1x PBS con 0,1% de Tween (PBT), 3 min a RT, dos veces.
   NOTA: A menos que de otro modo especificar el PBS utilizado es con o sin calcio y magnesio.
4. Deshidratar los embriones en 100% de metanol (MeOH) durante al menos 12 horas a RT en el mismo vial. Cambie el MeOH 100% al menos dos veces bajo el capó con una micropipeta de plástico.
   NOTA: El MeOH se vuelve ligeramente amarillo como lípidos disueltos en ella. Precaución al MeOH es tóxico por inhalación y debe manipularse bajo una campana.
5. Rehidratar los embriones utilizando el mismo vial a través de una serie graduada de baños de MeOH: MeOH 75% en PBS, MeOH 50% en PBS, MeOH 25% en PBS, PBS dos veces, cada baño de 5-10 minutos a TA. Las soluciones de MeOH se cambian bajo el capó con una micropipeta de plástico.
6. Usando una pipeta de plástico, la transferencia del embrión a ser disecado en una placa de Petri de 60 mm lleno hasta el tope con PBT. El uso de dos pinzas finas cuidadoeliminar totalmente los ojos mediante la inserción de uno pinzas finas entre los ojos y el tubo neural, a nivel del tallo óptico. Separe los ojos del tubo neural. Introducir con cuidado la pinza por debajo del ectodermo que recubren el tubo neural. Con cuidado, retire el ectodermo partiendo de detrás de la cabeza y lo descarta.
7. Realice una ISH doble o individual utilizando digoxigenina-etiquetados o sondas marcadas con fluoresceína como anteriormente descritos ^18,19.
8. Después de la ISH transferir los embriones de un nuevo 60 mm placa de Petri llena hasta el tope con PBT con una pipeta de plástico.
9. Usando unas pinzas finas separar cuidadosamente el tubo neural del resto del embrión. En esta etapa, el tubo neural anterior se separa del tubo neural posterior. Separar cuidadosamente restantes partes del ectodermo que recubren el tubo neural, la notocorda que se adjunta suelta debajo del tubo neural, las vesículas óticas y restantes partes del mesodermo. Asegúrese de que el tubo neural está desprovisto de cualquier apéndiceen este punto.
   NOTA: Para evitar daños en el tubo neural realizar todas las transferencias de tubo / embrión neuronal con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta si es necesario con un corte de punta en su extremo. El diámetro del extremo de la punta se ajusta al tamaño del tubo neural.
10. Transferir el tubo neural diseccionado (ver nota paso 1,9) en un tubo de 1,5 ml lleno con 50% de glicerol diluido en PBS. Espere hasta que los tubos neurales han caído a la parte inferior de la solución de glicerol, por lo general O / N a 4 ° C.
11. Retirar la solución de 50% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000 y añadir en el mismo tubo de 1,5 ml de una solución de 90% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000. Espere hasta que los tubos neurales caen hacia el fondo de la solución de 90% de glicerol / PBS, por lo general O / N a 4 ° C.
    NOTA: para almacenamiento a largo plazo, utilizar 90% de glicerol / PBS más antibióticos para prevenir el desarrollo de bacterias.
12. Transferir los tubos neurales en una placa de vidrio, o un portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia de plástico.
13. Dissecta de los tubos neurales a lo largo de la dorsal y ventral líneas medias utilizando agujas de tungsteno. Durante ese paso de los tubos neurales se mantienen en 90% de glicerol / PBS.
14. Montar los dos lados del tubo neural en 90% de glicerol / PBS utilizando anillos de refuerzo cubiertos con un cubreobjetos de vidrio.
15. Fijar los cubreobjetos con barniz y mantener a 4 ° C.

2. Cap Animal explantes de inducción usando perlas de resina de intercambio de aniones

1. Transferir 100 l de perlas de resina de intercambio aniónico en un tubo de 2 ml utilizando una micropipeta P1000. Lavar las perlas por lo menos cinco veces consecutivas con agua destilada estéril. Permitir que las perlas se sedimentan en la parte inferior del tubo y reemplazar el agua destilada estéril utilizando una micropipeta P1000. No toque las bolas.
2. Deje que los granos en remojo O / N en un tubo de 2 ml llena de agua destilada estéril con albúmina de suero bovino (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C.
3. Dos horas antes de la recogida de las CCAA, coloque la mitad de los granos en un nuevo 1,5 mltubo usando una micropipeta P1000. Reemplazar el agua destilada estéril con 500 l de medio que contiene la molécula a ensayar por su potencial inductivo, o sabe que inducen un destino específico. Mantenga la otra mitad de las perlas, ya que se pueden utilizar como un control negativo.
4. Incubar las perlas a 4 ° C durante al menos 2 hr.
5. Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico y realizar todas las transferencias de CA con una micropipeta.
6. Transferencia de embriones o blástula gástrula muy tempranas en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
   NOTA: Los embriones en desarrollo a los 12 ° C blástula y gástrula etapas alcance de 20 a 24 horas.
7. Retirar membrana vitelina del embrión utilizando pinzas ²⁰ como se describió anteriormente. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana, lentamente despegarlo del embrión. Realice este procedimiento en la venlado del embrión tral (vegetal). No dañe el lado animal del embrión.
8. Aislar pequeñas CCAA como se describió anteriormente ^21. El polo animal es parte pigmentada del embrión. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC contiene sólo las células ectodérmicas. Asegúrese de que el tejido es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis.
9. Coloque cada CA en unos Terasaki placas de múltiples pocillos en 0.5x modificados de Barth salinos (MBS) ^4. Coloque el AC en el pozo con su lado animal pigmentada abajo, en contacto con el fondo redondo del pozo.
   NOTA: pipetas de recubrimiento con una solución de BSA 0,1% impide la adherencia de pequeños trozos de tejido adhesivo para el plástico.
10. Coloque una perla en cada tapa usando una micropipeta P20. Si es necesario, el uso de fórceps para colocar cuidadosamente la perla en el centro de la tapa.
    NOTA: Cuando empapado en un medio acondicionado, las perlas son de color de rosa. Seleccione la mayor cantidad de coperlas lored.
11. Se incuba a RT (18 a 22 ° C) durante 6 horas sin mover la placa de múltiples pocillos Terasaki. El cordón se adhiere a la AC en menos de 2 hr.
12. Coloque la placa de múltiples pocillos Terasaki en la parte superior de papeles empapados en agua. Cubra la placa con un recipiente de plástico.
    NOTA: Este 'cámara de humedad' evita la evaporación prematura de los pozos.
13. Cultura de la CCAA en 0.5x MBS o 3.4 NAM (véase el paso 4.1) en la cámara de humedad a 15-20 ° C hasta que los embriones hermanos han llegado a la etapa correcta para probar el efecto de su factor.
14. Fijar las CCAA durante 1 hora en el recién preparada PFA al 4%. Deshidratar las CCAA en 100% MeOH como se ha descrito previamente (Paso 1.4).

3. Animal Cap Disociación Celular y reagregación antes del injerto en un Xenopus laevis neurula

1. Escudo placas de Petri (60 mm) o 12 pozos placas con 3% de agarosa en agua estéril o en PBS sin calcio y magnesio. Agregar suficiente agarosa para cubrir la bottom de la placa de Petri o el pozo. Pre-calentar las placas a temperatura ambiente (18-22 ° C). Opcionalmente, almacenado las placas durante dos días a 4 ° C para evitar la deshidratación.
2. Preparar libre de calcio solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) y solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl _2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) ^5. NOTA: la solución de CaCl ₂ no puede esterilizarse en autoclave.
3. Llene la agarosa recubiertas de bien en la parte superior con solución salina libre de calcio de Holtfreter.
4. Prepare blástula o embriones gástrula muy tempranas para aislar sus CCAA como se describió anteriormente (pasos 2,5 a 2,7).
5. Aislar al menos 15 o hasta 30, pequeña CCAA ^21. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC sólo contiene células ectodérmicas y por lo tanto es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis.
   NOTA: El polo animal es la Embryparte pigmentada del o.
6. Transferencia de las CCAA en una agarosa recubiertas de bien lleno hasta el tope con-calcio libre de solución salina de Holtfreter. Coloque las CCAA con el frente de su lado pigmentado hacia arriba.
   NOTA: El proceso de disociación comienza rápidamente en libre de calcio salina de Holtfreter.
7. Espere unos minutos para que las células empiezan a disociar. Observar esto a través de la desagregación de los tejidos. Usando unas pinzas finas, separar la capa pigmentada desde el resto de la AC y desecharlos con una micropipeta P20. Completar el proceso de disociación celular indica separación de las células entre sí.
   NOTA: Uno o dos capas pigmentadas se pueden dejar en el explante re-agregado para ayudar a la visualización durante el injerto.
8. Centrar las células usando movimientos circulares de la placa. Usando una micropipeta P1000 retire con cuidado todo medio posible. Tenga cuidado de no tocar las células.
9. Añadir 1 ml de solución salina de Holtfreter con el calcio para el pozo. Transfiera las CCAA disociadasen un tubo de 1,5 ml.
   NOTA: 2 ml tubos no se pueden utilizar debido a su fondo redondo.
10. Sedimentar las células por centrifugación, 5 min a una velocidad máxima de 2000 rpm para una centrífuga de mesa (500 xg). Retire con cuidado el sobrenadante con una micropipeta P1000.
11. Añadir a las células disociadas 20 l de solución salina de Holtfreter con calcio (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl _2, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) ^5.
12. Mantenga las CCAA disociado, de 3 a 6 horas a temperatura ambiente (18-22 ° C).
    NOTA: Este es tiempo necesario para que las células se re-agregado. El re-agregación es visible como las células forman una pequeña bola en la parte inferior del tubo.
13. Separar el explante cuidadosamente de la parte inferior del tubo mediante la adición de 1 ml de 0.5X MBS o de 1 ml de 3/4 NAM (véase el paso 4.1). Transferir el explante en una placa de un-revestido con una pipeta de transferencia de plástico.
14. Etapa los explantes utilizando sus hermanos de control. Para utilizar la cultura antibióticos a largo plazo: kanamycin (50 g / ml), ampicilina (50 mg / ml) y gentamicina (50 mg / ml).

4. Injerto de Animal Caps explantes en la placa neural de X. laevis Embriones

1. Preparar 3 cuartos NAM (NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO _{3) 2,} 1 mM MgSO _4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO _3, 0,2x PBS, 50 mg / ml de gentamicina). No mantener durante más de 1 semana para la disección y se almacena a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo).
2. Placas de Petri Escudo (60 mm) con un 3% de agarosa en 3.4 NAM en la que los pequeños agujeros se han realizado utilizando un molde de silicona, o la tapa de una raqueta de tenis de mesa.
   NOTA: La agarosa cubre la parte inferior de la placa de Petri. Deje algo de espacio para que la placa de Petri se llene de 3/4 NAM. Alternativamente hacer platos de disección con la no-sequedad plastilina. Dentro de la arcilla, apretar los embriones ligeramente durante el procedimiento de disección. Dig pequeños agujeros en elagarosa utilizando pinzas redondeadas Este 'plato de disección' ayuda a mantener los embriones durante el procedimiento de disección.
3. Recoger herramientas de disección: pipetas de transferencia de plástico, un "cuchillo de la ceja '(hecho con pelo de las cejas embebidos en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio) ^22, dos pinzas de disección finas, micropipeta P1000 y consejos, un stereosmicroscope con magnificación 8-40X, una fuente de luz brillante con guías de fibra óptica. Mantenga todas las herramientas de disección limpia; después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez con etanol al 100% y deje secar. Almacene lejos del polvo y si autoclave necesarias las herramientas de disección metal.
4. Deje que la disociada y re-agregado CCAA (protocolo 3), y sus hermanos X. embriones laevis desarrollan hasta alcanzar la etapa 13 (neurula) según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo ^17. Para el trasplante dentro de la etapa placa neural 13 a la etapa 15 embriones se utilizan.
5. Llevar a cabo todasetapas subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico.
6. Usando una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA. Retirar membrana vitelina del embrión a lo descrito previamente ^20. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana con firmeza, lentamente despegarlo del embrión.
   NOTA: Realice este procedimiento en la parte ventral (vegetal) del embrión. No dañe los embriones placa neural. Si los embriones han sido dañados durante la etapa de eliminación de la membrana vitelina, la transferencia de los embriones en una placa de Petri de 60 mm que contiene 3/4 NAM utilizando una pipeta de transferencia de plástico y esperar 15 minutos, un tiempo suficiente para el proceso de curación que se produzca.
7. Rellene el plato de la disección a la cima con frescos 3.4 NAM.
8. Con una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones sin su membrana vitelina en el plato de la disección. Coloca los embriones lado dorsal arriba enlos pozos. Durante el proceso de transferencia no permita que el embrión para entrar en contacto con la interfase aire-líquido desde X. laevis se lisan por la tensión superficial.
9. Transferir el explante de CA para ser injertado en la placa de disección con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta P1000. Una vez que la pipeta está dentro del líquido, permitir que los explantes a hundirse lentamente hacia abajo por la gravedad, o empujar con mucha suavidad.
10. Mantener los embriones con fórceps redondeadas. Con el cuchillo de la ceja hacer una incisión en la placa neural donde va a injertar pieza de su explante.
    NOTA: En la etapa 14 la curvatura anterior de la placa neural se puede utilizar como punto de referencia, que marca el territorio diencéfalo (Figura 4).
11. Corte un pequeño trozo de neuroepitelio, utilizando pinzas redondeadas y un knive ceja. Corte un pequeño trozo del explante con el cuchillo de la ceja.
    NOTA: La pieza de explante debe ser aproximadamente del mismo tamaño y forma que la zona de ablación neuroepitelio.
12. Coloque la pieza de explante en la incisión neuroepitelio usando el cuchillo ceja y unas pinzas finas. Asegúrese de que el explante se une rápidamente al embrión.
13. Alternativamente coloque un pedazo de cubreobjetos de vidrio en el embrión injertada para mantener el injerto en su lugar. Para ello, cortar un cubreobjetos de vidrio fino en pedazos muy pequeños utilizando pinzas gruesas. Asegúrese de que el tamaño es de aproximadamente 1,5 mm ^2. Sumerja las piezas en una placa de Petri que contiene 3/4 NAM o PBS utilizando fórceps. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarlo. El embrión será un poco aplanada.
14. Espere al menos 30 minutos sin moverse o sólo mover la placa de disección con suavidad. Deje el embrión recuperar durante 30 min a 2 hr y retire con cuidado el cubreobjetos si es necesario. Pipetear con cuidado los embriones injertadas en un plato limpio lleno de 03.04 NAM, usando la pipeta de transferencia de plástico.
    NOTA: Injertado embriones tienden a desarrollar bacterias o contaminación de hongos. Para largo plazo cULTURA usar antibióticos: kanamicina (50 mg / ml), ampicilina (50 g / ml) y gentamicina (50 mg / ml).

Resultados

En base a consideraciones morfológicas en diferentes especies, las manipulaciones embriológicas, y el patrón de expresión de genes reguladores, un modelo conceptual sostiene que la placa neural se divide en segmentos transversales y longitudinales que definen una rejilla de desarrollo generar campos histogenic distintas. En la placa neural, los primordios del prosencéfalo, mesencéfalo, cerebelo y la médula espinal están todos ya establecidos a lo largo del eje antero-posterior (A...

Discusión

Desarrollo neuronal es orquestada por una compleja interacción entre los programas de desarrollo celulares y señales de los tejidos circundantes (revisado en ^3,31,32). Aquí se describe un conjunto de protocolos que se puede utilizar en X. laevis embriones para explorar factores extrínsecos e intrínsecos que intervienen en la determinación del destino neural y la morfogénesis neuronal in vitro e in vivo. Estos protocolos pueden ser utilizados como tales en X. embrione...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	VWR	20909.290	Toxic
anion exchange resin beads	Biorad	140- 1231
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A-7888	For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine	GIBCO	15751-045	antibiotic
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A7906	for bead preparation