JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة الطرق لفحص الجينات السيطرة على نفاذية plasmodesmal والتدرج بالتالي أوكسين خلال استجابة مدار. وهذا يشمل قياس درجة استجابة استوائية في التحتفلقي من thaliana نبات الأرابيدوبسيس وفحص النفاذية plasmodesmal بواسطة حامض 8 hydroxypyrene-1،3،6-trisulfonic (HPTS) التحميل وتقييم مستوى callose أخيرا.

Abstract

وأوكسين هرمون النبات يلعب دورا هاما في كثير من عمليات النمو والتنموية، بما في ذلك ردود استوائية للضوء والجاذبية. إنشاء التدرج أوكسين هو الحدث الرئيسي مما أدى إلى توجه ضوئي وانتحاء أرضي. سابقا، وقد أظهرت النقل أوكسين القطبي (PAT) لإنشاء التدرج أوكسين في المجالات الخلوية المختلفة من النباتات. ومع ذلك، هان آخرون في الآونة الأخيرة أظهرت أن لتشكيل أوكسين التدرج السليم، plasmodesmal بوساطة callose الاتصال symplasmic بين الخلايا المجاورة هو أيضا عاملا حاسما. في هذه المخطوطة، واستراتيجية لإلقاء الضوء على دور جينات معينة، والتي يمكن أن تؤثر على توجه ضوئي وانتحاء أرضي عن طريق تغيير الربط symplasmic من خلال تحوير تركيب callose plasmodesmal، ومناقشتها. الخطوة الأولى هي لفحص ردود مدار الشاذة من الشتلات etiolated عمرها 3 أيام من المسوخ أو خطوط الإفراط في التعبير عن الجينات جنبا إلى جنب مع نوع البرية. هذا الفرز الأولييمكن أن يؤدي إلى تحديد مجموعة من الجينات تعمل في PAT أو السيطرة على الربط symplasmic. ويشمل الفحص الثاني في فرز المرشحين التي تظهر استجابات استوائية المتغيرة التي تؤثر على الربط symplasmic. للتصدي لهؤلاء المرشحين، تم فحص حركة التتبع symplasmic وترسب callose plasmodesmal. ان هذه الاستراتيجية أن تكون مفيدة لاستكشاف الجينات المرشحة الجديدة التي يمكن أن تنظم الربط symplasmic مباشرة أو بشكل غير مباشر من خلال ردود استوائية والعمليات التنموية الأخرى.

Introduction

النباتات، والكائنات الحية لاطئة، وضعت شبكة متطورة للغاية من الإشارات من خلية إلى خلية لمعالجة المحفزات البيئية المختلفة. ردود استوائية هي واحدة من الظواهر التي النباتات تستجيب للمؤثرات البيئية. تظهر النباتات ردين مدار الرئيسية، توجه ضوئي وانتحاء أرضي. النباتات الضوئي تنحني باتجاه مصدر الضوء التي توجه ضوئي لحصاد الطاقة القصوى. وبالمثل، انتحاء أرضي يجعل النباتات تنمو في اتجاه مركز الجاذبية. الآلية الأساسية التي تؤدي إلى مثل هذه الردود استوائية تتضمن تشكيل التدرج غير المتماثلة من هرمون نباتي أوكسين 1. فعل تشكيل أوكسين التدرج المحلي يتميز أيضا؛ الجينات التي تشارك في هذه الآلية توفر خارطة طريق لعمل هرمون 2-8. موقف محدد من الناقلات أوكسين هروب رأس المال، مثل تشكيل PIN (PIN) و ف بروتينات سكرية، ينفذ حركة أوكسين من السيتوبلازم إلى جدار الخلية من الخلايا المانحة 9،10. Furthermore، من قبل H + / IAA النشاط symport نشط من حاملات تدفق أوكسين، مثل AUX1 / البروتينات الأسرة التراخي، يتم تسليم أوكسين في النهاية إلى خلايا استقبال المجاورة 2،11،12. وتعرف هذه الحركة الاتجاه من أوكسين وسائل النقل أوكسين القطبي (PAT). بات يؤدي إلى توزيع التفاضلية أوكسين خلال مراحل النمو المختلفة، واستجابة لمختلف المحفزات البيئية 13،14. وعلاوة على ذلك، واضطراب في توطين أو التعبير عن أي من هذه الناقلات تدفق أو هروب رأس المال أوكسين يؤدي إلى تغيير حاد في PAT، الذي يؤدي إلى اختلال التدرج أوكسين، مما يؤدي إلى عيوب التنموية. في الآونة الأخيرة، وهان وآخرون. وذكرت أن تنظيم plasmodesmal ضروري أيضا للحفاظ على التدرج أوكسين 15. حتى الآن، وقد تم تحديد أكثر من 30 البروتينات plasmodesmal 16. ومن بين هذه البروتينات، تم الإبلاغ عن AtGSL8 كما إنزيم أساسي لتخليق callose في رابطات هيولية (PD)، وبالتالي تلعب دورا حيويا في صيانة العامةaining الحد PD حجم الاستبعاد (SEL). وأدى قمع التعبير AtGSL8 في نمط أوكسين التدرج مشوهة مما يؤدي إلى أي رد مدار على النقيض من الشتلات نوع البرية 15.

في هذه المخطوطة، وأساليب لاستكشاف الجينات المرشحة الجديدة التي تشارك في تنظيم PD يتم توفيرها. وقد استخدم AtGSL8 كما بروتين نموذج لاختبار هذه الطرق، كما هو الأنزيم الرئيسي المساهمة في PD الحيوي callose. ويرجع ذلك إلى الشتلات الفتك من المسوخ gsl8 خروج المغلوب 17، واستخدمت ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) -inducible خطوط رني وفقا لتقرير نشر في وقت سابق 15. الاستراتيجية المقدمة هنا يمكن تكييفها لفحص الجينات المسئولة ردا التحتفلقي مدار تسيطر عليها PD SEL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. فحص المسوخ مع غيرت موجه ضوئيا وGravitropic الردود

  1. إعداد 1X Murashige وسكوغ (MS) متوسطة، ودرجة الحموضة 5.7، مع 0.8٪ اجار يوم واحد قبل التجربة.
    1. إضافة 800 مل من الماء المقطر المزدوج إلى 2 لتر مخروطي قارورة واثارة مع شريط مغناطيسي.
    2. إضافة 4.4 غرام من الملح MS إلى دورق مخروطي.
    3. إضافة 0.5 غرام من 2- (N-Morpholino) الإيثان حمض السلفونيك (MES) ويحرك حتى يذوب كل من الأملاح تماما.
    4. ضبط درجة الحموضة في المتوسط ​​إلى 5.7 مع 1 M KOH.
    5. نقل متوسطة إلى اسطوانة الإعلام وجلب الحجم النهائي إلى 1 لتر مع DDH 2 O.
    6. صب العودة المتوسط ​​إلى 2 لتر مخروطي قارورة وإضافة 8 غراما من أجار النبات.
    7. التفاف فم القارورة المخروطية بإحكام بورق الألمنيوم.
    8. الأوتوكلاف المتوسطة التصلب العصبي المتعدد وده 2 O لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية، و 15 رطل، وبعد التعقيم، والحفاظ على المتوسط ​​في 60 درجة مئوية الحاضنة وده 2 O في RT.
    9. بعد التبريد إلى 60 درجة مئوية، صب المتوسطة إلى 125 × 125 × 20 مم 3 لوحات مربع على مقاعد البدلاء تدفق الصفحي (50 مل في كل لوحة).
    10. السماح للأجار ليصلب في RT لمدة 1 ساعة عن طريق الحفاظ على لوحات مفتوحة جزئيا. إذا لم يتم استخدام لوحات على الفور، وختم عليها باستخدام غلاف بلاستيكي وتخزينها في 4 درجات مئوية في الثلاجة.
  2. السطح تعقيم البذور مع 1.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم وتنتشر البذور على لوحات أجار 1X MS التي تم إعدادها في القسم 1.1.
    ملاحظة: هنا، نبات الأرابيدوبسيس thaliana {العقيد-0 البذور، dsGSL8 (كو-0)} تستخدم 15 للاستجابة مدار، وتلطيخ callose وHPTS تحميل thaliana نبات الأرابيدوبسيس {العقيد-0 وdsGSL8 (كو-0) EMS متحولة} البذور (. غير منشورة) تستخدم للاستجابة مدار في الشكل 2.
    1. الأوتوكلاف 300 مل من ده 2 O في زجاجة.
    2. إضافة ما يقرب من مائة البذور لكل الخلفية، أيمتحولة / خط الإفراط في التعبير والنوع البري (كو-0) والبذور، وإلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    3. تأخذ بها لوحات 1X MS أجار من 4 درجات مئوية الثلاجة وتجفيفها على مقاعد البدلاء تدفق الصفحي في وضع مفتوح جزئيا.
    4. السطح تعقيم البذور عن طريق إضافة 1 مل من محلول التبييض 0.2x (1.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم) والحفاظ على أنابيب microcentrifuge على شاكر في 250 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
    5. لندع البذور تترسب في القاع بفعل الجاذبية ثم قم بإزالة محلول التبييض من قبل micropipette.
    6. إضافة 1 مل من ده الطازجة 2 O (تعقيمها) إلى البذور وتخلط جيدا للقلب أنبوب microcentrifuge عدة مرات. لندع البذور تستقر مرة أخرى ثم قم بإزالة الماء.
    7. كرر الخطوة 1.2.6 5-6 مرات.
    8. إضافة مضاعفة كمية المياه لحجم البذور التي تركت بعد غسل النهائي.
    9. نقطة بذور معقمة على طبق أجار 1X MS-المجففة شبه باستخدام تلميح 1 مل micropipette تحتوي على 200 ميكرولتر من البذور (فيالمياه بغرض اختتامها).
      1. إبقاء حوالي مسافة 0.1 سم بين اثنين من البذور والحد الأدنى من 1.8 سم بين صفين البذور. تنتشر البذور في خمسة صفوف أفقية في لوحة مربعة (125 × 125 × 20 مم 3). اسمحوا المياه لتجف قليلا قبل وضع غطاء على طبق من ذهب.
    10. ختم لوحات مع الشريط الجراحية، كومة جميع لوحات عموديا، والتفاف مع رقائق الألومنيوم.
    11. نقل لوحات ملفوفة إلى مربع الظلام (الذين لا يحصلون على الضوء). ثم، والحفاظ على مربع الظلام في 4 ° C / غرفة الثلاجة لمدة 3 أيام.
    12. بدءا من هذه الخطوة، والحفاظ على اتجاه لوحات دون تغيير. بعد 3 أيام من العلاج الباردة، والحفاظ على مربع مظلم في غرفة ثقافة النباتات عند 22 درجة مئوية لمدة 3 أيام القادمة. بعد 3 أيام، تحقق من حالة إنبات البذور تحت الضوء الاخضر في غرفة مظلمة.
      ملاحظة: يمكن عادة القديمة يوم 3 العقيد-0 شتلات etiolated تنمو لتصل إلى 1.6 سم في الطول.
  3. تحليل وموجه ضوئيا تغييرالثانية استجابة gravitropic في المسوخ أو الإفراط في التعبير خطوط جين معين. اختيار الشتلات على التوالي الحجم فقط بالمثل، وتنمو عموديا تحت الضوء الاخضر في غرفة مظلمة. نقل الشتلات المحدد إلى لوحة أجار 1X MS جديدة باستخدام غيض من المسواك تعقيمها.
    1. اختيار برفق الشتلات من أدنى جزء من التحتفلقي من دون لمس أي أجزاء أخرى. تأكد من أن جميع الشتلات لها نفس التوجه فلقة / هوك، وبعد نقل، أن التوجه من السنانير الشتلات لا تزال هي نفسها. استخدام ما لا يقل عن 20 شتلة من كل خلفية في كل صف والحد الأدنى من اثنين من لوحات لكل نقطة من الوقت لمزيد من التحليل.
      ملاحظة: يمكن مقارنة أربع خلفيات مختلفة في كل لوحة (4 صفوف).
      اختياري: في حين تستخدم ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) رني / الإفراط في التعبير خطوط -inducible، ونقل شتلات المذكورة أعلاه إلى 1X MS وحة جنبا إلى جنب مع لوحة MS + التنفيذ المباشر (لوحة تحتوي على 1X MS، 0.8٪ أجار المتوسطة تستكمل مع التنفيذ المباشر 20 ميكرومتر) FOص 3 ساعات والحفاظ على لوحات عموديا في مربع مظلم.
    2. للتحقق استجابة موجه ضوئيا، ونقل لوحات أعلاه عموديا إلى مربع أسود مع جانب واحد فقط فتح. نقل الصندوق الأسود يحتوي على لوحات لغرفة نمو النباتات مع الضوء الأبيض من جانب واحد. لضمان ضوء من جانب واحد، ضع حافة صفيحة نحو مصدر الضوء (وليس الجانب الأمامي). الرجوع إلى الإعداد في الشكل 1.
    3. وبالمثل، للتحقق من استجابة gravitropic، والحفاظ على لوحات مع الشتلات نقل عمودية، ويغطى بورق الألومنيوم. بعد ذلك، تغيير اتجاه لوحة عموديا إلى 90 درجة والاحتفاظ بها داخل الصندوق الأسود تغطيتها من جميع الجوانب. الرجوع إلى الإعداد في الشكل 1.
    4. بعد نقطة زمنية معينة، (عادة 1.5 ساعة، 3 ساعات، 6 ساعة، و 12 ساعة) مسح لوحات مع الماسح الضوئي، وحفظ الصور في شكل JPEG.
    5. قياس زاوية الانحناء من الشتلات باستخدام برنامج ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (الشكللدى عودتهم 2).
      1. بدء برنامج يماغيج عن طريق النقر المزدوج (الشكل 2A).
        ملاحظة: يتم عرض الأدوات الرئيسية التي تم استخدامها في قياس زاوية في الشكل 2B.
      2. انقر فوق الخيار "ملف"، يليه الخيار الفرعي "فتح" في شريط الأدوات يماغيج، والصور مفتوحة حفظها في تنسيق ملف JPEG لقياس مدار زاوية الانحناء (الشكل 2C).
      3. انقر فوق الأداة مكبرة لتكبير أو تصغير الصورة عن طريق النقر على زر الماوس الأيسر أو الأيمن، على التوالي كما هو مبين في الشكل 2B.
      4. انقر فوق الأداة التمرير لسحب ووضع الصورة (الشكل 2D) .Next، انقر فوق الأداة زاوية لقياس زاوية الانحناء (الشكل 2E).
        1. جعل النقر المزدوج على اليسار التحتفلقي الأصلي متزايد نقطة الاتجاه "أ"، اسحب الماوس إلى الانحناء نقطة البدء "ب" (الشكل 2F)، ثم انقر بعقب غادرعلى رسم السطر الأول (الشكل 2G).
        2. اسحب الماوس من نقطة ب إلى نقطة النهاية الانحناء "ج"، وانقر على الزر الأيسر لرسم الخط الثاني (الشكل 2H) وتشكيل ثابتة figure-protocol-8272 ألف ملاحظة: زاوية الانحناء الحقيقية هي figure-protocol-8371 B، والتي تساوي 180 ° - figure-protocol-8454 A. (الشكل 2F).
        3. قياس وسجل figure-protocol-8606 A عن طريق الضغط على 'M' على لوحة المفاتيح. سيتم فتح الملف نتيجة على حدة كما هو مبين في الشكل 2I. قياس وتسجيل جميع الشتلات واحدا تلو الآخر. على سبيل المثال، لأول مرة قياس زاوية الانحناء لجميع hypocotyls من العقيد-0 ثم لخطوط متحولة.
    6. نقل بيانات من يماغيج إلى ملف جدول لجعل مركباتerage من الانحناء زوايا كل الخلفية.
    7. للتحليل الكمي، وجعل الرسم البياني شريط الرسم البياني مع نتائج الاختبارات الإحصائية، بما في ذلك أشرطة الخطأ القياسية والقيم الاحتمالية (انظر الشكل 2).
      1. حساب الانحناء الصحيح figure-protocol-9409 B، وتصميم صيغة باستخدام جداول البيانات، أي figure-protocol-9521 B = 180 ° - figure-protocol-9593 ملاحظة: figure-protocol-9661 (أ) هو القيمة التي كانت مستمدة من تحليل يماغيج.
      2. قياس متوسط ​​زاوية الانحناء figure-protocol-9847 B لكل الخلفية باستخدام أدوات جدول (الشكل 2J).
      3. تحليل الانحراف المعياري بين مكررات لكل قياس باستخدام جدول "صيغ" أداة (الشكل 2J).
      4. اختبار سيجnificance النتائج من خلال تطبيق اختبار (ت) لمتوسط ​​زاوية الانحناء والقيم الانحراف المعياري يحسب على النحو المذكور أعلاه.
      5. رسم تخطيطي الشريط باستخدام القيم أعلاه لتمثيل بياني الفرق الكمي في زاوية الانحناء بين اثنين من خلفيات مختلفة باستخدام جدول "إدراج" أداة (الشكل 2K).
        ملاحظة: سوف المسخ / الإفراط في التعبير خطوط جينات مرشحة قوية تظهر اختلافات واضحة فيما يتعلق النوع البري، مثل عدم وجود الانحناء، وبسرعة الانحناء أو الانحناء بطيئة.

2. خطوط النبات الشاشة مع الردود عيب مدار نظرا للتغيرات في PD SEL مع ... تغيير PD Callose مستوى

  1. إجراء التحتفلقي تحميل الفحص بنسبة 8-hydroxypyrene-1،3،6-trisulfonic حمض (HPTS) صبغ تحميل على الجزء العلوي من الشتلات مع HPTS الاغاروز كتل وقارن حركة صبغ بين المسخ / الإفراط في التعبير خطوط والعقيد-0.
    1. إعداد HPTS agaroبنات حد ذاتها لفحص التحتفلقي التحميل.
      1. يستغرق 10 مل من ده 2 O في 50 مل قارورة مخروطي الشكل وإضافة 0.1 غرام من الاغاروز لإعداد agarose هلام 1٪. غلي الاغاروز في فرن الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة مع اهتزاز متقطعة، والسماح لتبرد لمدة 5 دقائق.
      2. إضافة 50 ملغ من HPTS إلى 10 مل من محلول 1٪ الاغاروز، وتخلط جيدا حتى يتحول الحل الأخضر.
      3. يصب الخليط المذكور أعلاه إلى 10 مم طبق بيتري، والسماح لها لترسيخ لمدة 15 دقيقة.
      4. قطع HPTS طدت الاغاروز بشفرة حادة تشريح لجعل كتل الاغاروز صغيرة (0.5 × 2 سم 2).
    2. تحضير عينات مصنع لHPTS فحص صبغ التحميل.
      1. وضع منصة للمقايسة HPTS صبغ تحميل. وضع شريحة غطاء المجهر (24 × 50 مم 2) في مرض التصلب العصبي المتعدد لوحة متوسطة جديدة كما هو موضح في الشكل 3A.
      2. المكوس الشتلات etiolated القديمة يوم 3 من قاعدة هوك باستخدام مقص جراحي حادة.
      3. فورانقل الشتلات أعلاه (لا تقل عن 5 شتلات من كل خلفية) على سطح غطاء زجاجي المجهري في مثل هذه الطريقة التي يجب أن تبقى فقط 0.5 سم من التحتفلقي من موقع الختان على غطاء الشرائح، وبقية التحتفلقي يجب أن تلمس المتوسط ​​كما هو مبين في الشكل 3B.
      4. وضع كتلة HPTS الاغاروز على رأس التحتفلقي (مع هوك رفعه) لمدة 5 دقائق في مثل هذه الطريقة أن المنطقة رفعه تلامس كتلة الاغاروز HPTS.
      5. بعد 5 دقائق من التحميل، وإزالة كتلة agarose من سطح التحتفلقي، ونقل hypocotyls إلى 10 مم طبق بتري تحتوي ده 2 O وغسل hypocotyls في ده 2 O لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز مستمر.
    3. تحضير عينات للمتحد البؤر المجهري.
      1. تحديد الحد الأدنى من 5 شتلات من كل خلفية للمراقبة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر.
      2. في قناة الليزر، وتعيين الطول الموجي إلى 488 نانومتر للمريض بالحب محددitation و500-550 نانومتر لانبعاث الفرقة تمرير.
      3. الشتلات نقل في 2 مجموعات (واحد العقيد-0 + واحد متحولة) إلى شريحة مجهرية جديدة بعد غسل مع ده 2 O. إضافة 100-150 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى الشريحة، وتغطي مع شريحة الغطاء. تحويل الشريحة إلى مرحلة المجهر متحد البؤر.
      4. التركيز على منطقة التحتفلقي (مع 20X أو 40X عدسة الهدف) باستخدام مشرق الميدان (الضوء الأبيض) إضاءة. ثم، مسح الشرائح لمضان.
      5. التقاط صور لمدة لا تقل عن 10 مجموعات، ومقارنة الخلفيات اثنين عن طريق التحقق من مدى الحركة صبغة من وجهة التحميل.
        ملاحظة: سوف المسخ / الإفراط في التعبير خطوط مع حركة symplasmic المتغيرة تظهر أنماط مختلفة من الصبغة تحميل بالمقارنة مع النوع البري العقيد-0.
  2. تحليل مستوى Callose في المسخ / الإفراط في التعبير خطوط عرض غيرت موجه ضوئيا وGravitropic الاستجابة وعرض مميز HPTS صبغ حركة Comparإد إلى العقيد-0.
    1. إعداد الأنيلين الأزرق callose تلطيخ صبغ.
      1. جعل 1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 9.5 و 0.1٪ (W / V) الأزرق الأنيلين في تعقيمها ده 2 O.
      2. جعل عازلة تلطيخ عن طريق خلط 0.1٪ الأنيلين الأزرق و 1 M الجلايسين في 2: 3 نسب حجم. على سبيل المثال، لمدة 50 مل من العازلة تلطيخ، يستغرق 20 مل من 0.1٪ الأنيلين الأزرق و 30 مل من 1 M الجلايسين. ملاحظة: تأكد من تلطيخ العازلة ما لا يقل عن 48 ساعة قبل استخدامها وتخزينها في الظلام.
    2. وصمة عار محني أو الشتلات مع callose محددة الأنيلين صبغة زرقاء غير محني.
      1. لكبح دي نوفو callose التخليق خلال عملية التلوين، إضافة الحجم النهائي من 1.5 ملم 2-ديوكسي-D-الجلوكوز (نائب المدير العام) إلى 50 مل من العازلة تلطيخ.
      2. أخذ شتلات etiolated القديمة لمدة 3 أيام لتلطيخ callose (مع أو بدون استجابة مدار).
      3. قطع شتلة من المنطقة هوك وذلك باستخدام مقص جراحي رقيقة.
      4. نقل الشتلات في طبق بيتري صغير يحتوي علىجي 2 مل من العازلة تلطيخ باستخدام غيض من المسواك.
      5. احتضان الشتلات مع العازلة تلطيخ في الظلام لمدة 2 ساعة مع الهز المستمر في 30 دورة في الدقيقة.
      6. بعد تلطيخ، وغسل الشتلات مع ده 2 O لمدة 2 دقيقة لإزالة العازلة تلطيخ الزائد.
      7. تحديد الحد الأدنى من 5 شتلة لكل خلفية مصنع للمراقبة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر.
    3. تحضير عينات للفحص المجهري متحد البؤر:
      1. نقل الشتلات في مجموعة (واحد العقيد-0 + واحد متحولة) لتنظيف المجهر الشرائح بعد غسل ده 2 O.
      2. إضافة 100-150 ميكرولتر من ده 2 O، وتغطي مع شريحة الغطاء. تحويل الشريحة إلى مرحلة المجهر متحد البؤر.
      3. في قناة الليزر، وتعيين الطول الموجي إلى 405 نانومتر لإثارة محددة و500-550 نانومتر الانبعاثات للتصوير من الأنيلين مضان الأزرق.
      4. جلب المنطقة التحتفلقي إلى التركيز، لأول مرة مع 10X وفي وقت متأخرص مع 20X أو 40X العدسات الهدف باستخدام مشرق الميدان (الضوء الأبيض) إضاءة.
      5. ثم، والتبديل على ضوء تصفيتها، مسح الشرائح لمضان، وحفظ الصور.
      6. قياس كثافة إشارة callose مع برنامج ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (انظر الشكل 4).
        1. تغيير شكل الصور المجهري مبائر من أوليمبوس صورة شكل ثنائي (* .oib) إلى تنسيق ملف JPEG. ملاحظة: يتم اعتماد صيغة JPEG فقط من خلال برنامج ImageJ.
        2. بدء برنامج يماغيج عن طريق النقر المزدوج (الشكل 4A). ملاحظة: تشير الأسهم إلى أداة المستطيل لاستخدامها في قياس كثافة callose (الشكل 4B).
        3. انقر فوق الخيار "ملف" متبوعة-الخيار الفرعية "فتح" في شريط الأدوات يماغيج، والصور المجهر المفتوحة التي تم حفظها في تنسيق ملف JPEG لقياس كثافة callose (الشكل 4C).
        4. انقر فوق رمز مستطيل على إيماgeJ شريط الأدوات (الشكل 4D).
        5. لتحليل كثافة إشارة، اسحب المؤشر فوق الصورة وتحديد المنطقة المراد فحصها (الشكل 4E)
        6. قياس وتسجيل القيم العددية لكثافة إشارة عن طريق الضغط على 'م' على لوحة المفاتيح (الشكل 4E). ملاحظة: الملف نتيجة فتح بشكل منفصل (الشكل 4F).
        7. قياس وتسجيل كثافة تقدر واحدا تلو الآخر لجميع شتلات من كل خلفية النبات.
          ملاحظة: في يماغيج، الملف نتيجة "يعني" يشير إلى كثافة إشارة من "المنطقة" المختارة.
      7. نسخ القيم المتوسطة من الملف نتيجة يماغيج، ولصق في ملف جدول بيانات للتحليل الكمي.
      8. للتحليل الكمي، وجعل الرسم البياني شريط الرسم البياني مع الاختبارات الإحصائية، بما في ذلك أشرطة الخطأ القياسية والقيم الاحتمالية (الشكل 4).
        1. قياس متوسط ​​كثافة إشارة(يعني من يماغيج) لكل الخلفية باستخدام جدول البيانات "الصيغ" أداة (الشكل 4G).
        2. تحليل الانحراف المعياري بين مكررات لكل قياس باستخدام جدول "صيغ" أداة (الشكل 4G).
        3. حساب الخطأ المعياري (SE) باستخدام thespreadsheet "الصيغ" أداة.
          ملاحظة: SE = ق / ن √، حيث (ق) هو الانحراف المعياري من السكان، و (ن) هو حجم (عدد من الملاحظات) من العينة.
        4. اختبار أهمية النتائج من خلال تطبيق اختبار (ت) لمتوسط ​​كثافة إشارة وقيم الخطأ القياسية تحسب على النحو المذكور أعلاه.
        5. رسم تخطيطي شريط الرسم البياني باستخدام القيم أعلاه لتمثيل بياني الفرق الكمي في مستوى callose بين اثنين من خلفيات مختلفة باستخدام جدول "إدراج" أداة (الشكل 4H).
          ملاحظة: المسخ / الإفراط في التعبير خطوط مرشح قوي والصورةكيف مستويات callose بالمقارنة مع نوع البرية، مثل عدم وجود callose، callose قليلا أو فرط تراكم PD callose مختلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في الإعداد الحالي، ديكساميثازون (التنفيذ المباشر) -inducible خطوط رني من AtGSL8 [الآخرة dsGSL8 (+ التنفيذ المباشر / -dex)] استخدمت، كما gsl8 متماثل المسوخ T-DNA الإدراج والشتلات فتكا 18. تعرضت الشتلات etiolated منذ ثلاثة أيام مع dsGSL8 ونوع الشتلات الب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه المخطوطة، ووضع استراتيجية للكشف خطوط متحولة / الإفراط في التعبير التي هي معيبة في الردود موجه ضوئيا وgravitropic بسبب callose PD تغييرها، وبالتالي يوصف PD SEL في التفاصيل. ويتم إنجاز PD التوليف callose وتدهور بشكل رئيسي من قبل synthases callose وβ-1،3-Glucanases، ولكن يتم التحكم تنظيم هذه ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم الافصاحات.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني، 2015R1A2A1A10053576)، ومنحة من برنامج الجيل التالي من BioGreen 21 (SSAC، منح PJ01137901)، إدارة التنمية الريفية، وجمهورية كوريا. ودعمت RK، WS، ABB وDK من الدماغ كوريا 21 زائد برنامج (BK21 +).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)SigmaH1529-1GFluorescent dye as symplasmic tracer
LE AgaroseDongin-GenomicGEL001-500GUsed for HPTS agarose block
Microwave ovenLG-GoldstarMachine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flaskDong KwangA0205Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)SPL life sciencesSPL10035Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples 
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)Marienfeld Laboratory Glassware101222Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mmSPL life sciencesSPL11125Plates to make MS agar medium
ScissorsGermany StainlessHSB 942-11Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixtureDuchefaP10453.01MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrateBioshop3G30212To make MS media.
Plant agarDuchefaP1001.1000To solidify MS media.
AutoclaveALPCL-40L
ShakerWise MixSHO-1DTo wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tipsSorenson10040
1 ml pipetteBioPetteL-1101-2
Surgical tapeMIcropore1530-0To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)SigmaM5528-25GUsed to prepare aniline blue staining buffer.
GlycineBioshopGLN001Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDGSigmaD8375-1GUsed for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscopeOlympusFV1000MPE SIMTo check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer I lab K400To mix media solution.
Aluminium foilSW cooking foilTo wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochloriteSamjin IndustryTo surface-sterilized seeds

References

  1. Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).
  2. Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
  3. Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
  4. Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
  5. Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
  6. Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
  7. Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
  8. Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883(2006).
  9. Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
  10. Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
  11. Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
  12. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  13. Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
  14. Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
  15. Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
  16. Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
  17. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

110 PD callose symplasmic 8 hydroxypyrene 1 3 6 trisulfonic HPTS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved