トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

要約

この記事では、指向性応答の間にplasmodesmal透過性、ひいてはオーキシン勾配を制御する遺伝子をスクリーニングするための方法を説明します。これは、胚軸における向性応答の程度の測定を含みます シロイヌナズナおよび8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS）ロードし、最終的にカロースレベルの評価によりplasmodesmal透過性を確認します。

要約

植物ホルモンのオーキシンは、光と重力向性応答を含む多くの成長と発達の過程で重要な役割を果たしています。オーキシン勾配の確立は光屈性と重力屈性につながる重要なイベントです。以前に、極性オーキシン輸送（PAT）は、植物の異なる細胞ドメインでオーキシン勾配を確立することが示されました。しかし、Han らは 、最近、適切なオーキシン勾配形成のために、隣接するセル間plasmodesmalカロース媒介symplasmic接続性も重要な要素であることを実証しました。本稿では、plasmodesmalカロース合成を調節することを通じてsymplasmic接続を変更することによって光屈性と重力屈性に影響を与える可能性があり、特定の遺伝子の役割を解明するための戦略が議論されています。最初のステップは、野生型と一緒に突然変異体または遺伝子の過剰発現株の3日齢の黄化苗から異常な熱帯応答をスクリーニングすることです。この予備スクリーニングPATで機能やsymplasmicの接続を制御する遺伝子の範囲の同定につながることができます。二次スクリーニングはsymplasmic接続に影響することにより改変された指向性応答を示す候補の選別を伴います。このような候補者に対処するために、symplasmicトレーサーの動きとplasmodesmalカロースの沈着を調べました。この戦略は、熱帯応答や他の発達プロセスの間に直接的または間接的にsymplasmic接続性を調節することができる新たな候補遺伝子を探索するのに有用であろう。

概要

植物は、固着生命体として、様々な環境刺激に対処するために、細胞から細胞へのシグナル伝達の高度に洗練されたネットワークを開発しました。トロピック応答は、植物が環境刺激に応答することにより、現象の一つです。植物は、主に2つの指向性応答、光屈性と重力屈性を示しています。光合成植物は、最大エネルギーを収穫する光屈性により光源に向かって曲がります。同様に、重力屈性は、植物が重力の中心に向かって成長することができます。このような熱帯の応答につながる基本的なメカニズムは、植物ホルモンのオーキシン¹の非対称勾配の形成を伴います。地元のオーキシン勾配形成の行為は十分に特徴付けされています。このメカニズムに関与する遺伝子は、ホルモン作用^2-8のためのロードマップを提供します。オーキシン例えばPIN形成（PIN）として排出される担体、およびP糖タンパク質の特定の位置は、ドナー細胞^9,10の細胞壁への細胞質からオーキシンの移動を実行します。 Furthermore、このようなAUX1 / LAXファミリータンパク質としてオーキシン流入キャリアのアクティブH ⁺ / IAA共輸送活性により、オーキシンは、最終的には、隣接するレシーバセル^2,11,12に配信されます。オーキシンのこの方向の動きは、極性オーキシン輸送（PAT）として知られています。 PATは、種々の発生段階の間に、別の環境刺激^13,14に応答して、差動オーキシン分布につながります。また、これらのオーキシンの流入や流出担体のいずれかの局在または発現の破壊は、発達障害につながる、オーキシン勾配の破壊を引き起こすPATの深刻な変化をもたらします。近年、Han ら 。 plasmodesmal規制はオーキシン勾配^15を維持するためにも必要であることを報告しました。今日まで、30以上のplasmodesmalタンパク質^16が同定されています。これらのタンパク質のうち、AtGSL8は原形質連絡にカロース合成の鍵酵素（PD）として報告されているので、のmaintで重要な役割を果たしていますPDサイズ排除限界（SEL）をaining。抑制AtGSL8発現は、野生型苗¹⁵とは対照的に、無指向性応答につながる歪んだオーキシン勾配パターンが得られました。

本稿では、PDの調節に関与する新たな候補遺伝子を探索するための方法が提供されます。これはPDのカロース生合成に寄与する重要な酵素であるようAtGSL8は、これらの方法を試験するためのモデルタンパク質として使用しました。ノックアウトgsl8変異体¹⁷の苗-致死に、デキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAi線は以前に発表された報告書¹⁵に従って使用しました。ここで提供される戦略は、PD SELによって制御される胚軸指向性応答に関与する遺伝子をスクリーニングするために適合させることができます。

プロトコル

変化した屈光性や重力屈性応答を有する変異体の1スクリーニング

1. 実験前に0.8％寒天一日で1×ムラシゲ・スクーグ（MS）培地、pHが5.7を準備します。
   1. 2リットルの三角フラスコに蒸留水800mlを加え、磁気棒でかき混ぜます。
   2. 三角フラスコにMS塩の4.4グラムを追加します。
   3. 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）を0.5gを加え、塩の全てが完全に溶解するまで攪拌します。
   4. 1 M KOHで5.7に培地のpHを調整します。
   5. マスシリンダーにメディアを転送し、のddH ₂ Oで1リットルに最終的なボリュームをもたらします
   6. 2リットルの三角フラスコに培地をバック注ぎ、植物寒天の8グラムを追加します。
   7. アルミホイルでしっかりと三角フラスコの口を包みます。
   8. 121°C、15 psiで15分間、MS培地とのddH ₂ Oをオートクレーブし、オートクレーブ処理した後、60℃のインキュベーター、室温でのddH ₂ Oに培地を保ちます。
   9. 60℃に冷却した後、層流ベンチで125×125×20ミリメートル³平方プレートに培地（各プレートで50ミリリットル）を注ぎます。
   10. 寒天は、部分的に開いたプレートを保持することにより、約1時間、室温で固化することを可能にします。プレートは直ちに使用しない場合は、冷蔵庫に4℃でラップとストアを使用してそれらを密封します。
2. 1.1％の次亜塩素酸ナトリウムとの種子を表面滅菌すると、セクション1.1で調製した1×MS寒天プレート上の種子に点在しています。
   注：ここでは、 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）{COL-0の種子、dsGSL8（COL-0）} ^15は、指向性応答、カロース染色とHPTSのロードに使用されているシロイヌナズナ {COL-0とdsGSL8（COL-0）EMS変異}種子（。未発表）は、図2の指向性応答のために使用されます。
   1. ボトル内のddH ₂ Oのオートクレーブ300ミリリットル。
   2. すなわち 、それぞれの背景に約百種を追加、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに、変異型/過剰発現ラインと野生型（Col-0）の種子。
   3. 4℃の冷蔵庫から1×MS寒天プレートを取り出し、部分的に開いた位置にある層流ベンチでそれらを乾燥させます。
   4. 0.2Xの漂白剤溶液（1.1％次亜塩素酸ナトリウム）を1ml添加​​することによって、種子を表面滅菌し、5分間、250rpmでシェーカー上にマイクロチューブを保ちます。
   5. 種子は重力によって底に沈殿した後、マイクロピペットにより漂白剤溶液を除去してみましょう。
   6. 種子への新鮮なのddH（オートクレーブ処理_）2 Oの1ミリリットルを加え、マイクロチューブを数回反転させてよく混ぜます。種子が再び定住した後、水を除去してみましょう。
   7. 繰り返しステップ1.2.6 5-6回。
   8. 最後の洗浄後に残された種子のボリュームへの水の重量を追加します。
   9. ドット種子の200μLを含む1ミリリットルマイクロピペットチップを使用して、半乾燥の1x MS寒天プレート上の滅菌種子（中cluding水）。
      1. 約2の種と2種の行の間の1.8センチメートルの最小0.1センチの距離を保ちます。角板（125×125×20ミリメートル^3）あたり5の水平列に種子に点在しています。水がプレート上に蓋を配置する前に、わずかに乾燥することができます。
   10. 、手術用テープでプレートをシールし、垂直プレートのすべてをスタックし、アルミホイルで包みます。
   11. （光へのアクセスなしで）暗箱に包まれたプレートを転送します。その後、3日間4℃の部屋/冷蔵庫で暗箱を保ちます。
   12. このステップから開始し、不変のプレートの方向を保ちます。低温処理の3日後に、次の3日間22℃で植物培養室で暗箱を保ちます。 3日後、暗い部屋で緑色の光の下で種子の発芽状態を確認してください。
       注：通常3日齢のCOL-0黄化苗は、長さ1.6センチまで成長することができます。
3. 変更された屈光性Aを分析変異体または特定の遺伝子の過剰発現株ではND重力屈性応答。暗い部屋で緑色の光の下でのみ同様の大きさと垂直成長ストレート苗を選択します。滅菌爪楊枝の先端を使用して、新鮮な1×MS寒天プレートに選択された苗を転送します。
   1. 静かに他の部分に触れることなく、胚軸の最下部から苗を選択します。苗のすべてが同じ子葉/フックの向きを持っていることを確認し、転送した後、苗のフックの向きは同じままです。各行の各背景とさらなる分析のために、各時点のための2つのプレートの最小の20苗の最小値を使用してください。
      注：4つの異なる背景を各プレート（4行）に比較することができます。
      オプション：foは1×MS + DEX MSプレートと一緒にプレート（1×MSを含むプレート、20μMのデキサメタゾンを補充し、0.8％寒天培地）に上記の苗を転送し、デキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAi /過剰発現ラインを使用している間R 3時間と暗箱内に垂直にプレートを保持します。
   2. 屈光性応答を確認するには、開かれた片側のみでブラックボックスに垂直に上記のプレートを転送します。一方的な白色光で植物の成長室にプレートを含むブラックボックスを転送します。一方的な光を確保するために、光源（ない手前側）に向かってプレートの端を置きます。 図1のセットアップを参照してください。
   3. 同様に、重力屈性応答をチェックし、垂直転送苗でプレートを維持し、アルミホイルで覆います。次に、90°、垂直プレートの向きを変更し、すべての側面から覆われ、ブラックボックスの中に保管してください。 図1のセットアップを参照してください。
   4. 与えられた時間点の後、（通常1.5時間、3時間、6時間、および12時間）は、スキャナでプレートをスキャンし、JPEG形式で画像を保存。
   5. ImageJソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）（ 図8を用いて苗の曲げ角度を測定しますURE 2）。
      1. ダブルクリック（ 図2A）によってImageJのプログラムを起動します。
         注：角度測定に使用した主要なツールは、 図2Bに示されています。
      2. サブオプションはImageJツールバーの「開く」、および熱帯曲げ角度（ 図2C）を測定するためにJPEGファイル形式で保存されたオープンな絵が続く「ファイル」オプションをクリックします。
      3. 図2（b）に示すそれぞれのように、左または右マウスボタンをクリックすることで、画像のズームインまたはズームアウトするには拡大ツールをクリックします。
      4. 画像をドラッグして配置するためにスクロールツールをクリックします（ 図2D）.Next、（ 図2E）曲げの角度を測定するために、角度ツールをクリックします。
         1. 元の胚軸成長方向点''、曲げ開始点'B'（ 図2F）に、マウスをドラッグし、左のお尻をクリックをダブル左クリックしてください最初の行（ 図2G）を描画します。
         2. 曲げエンドポイント'C'に点bからマウスをドラッグし、2行目（ 図2H）を描画し、固定を形成するために、左ボタンをクリックします A.注：真の曲げ角度があります 180°となるB、 - A.（ 図2F）。
         3. 測定し、記録キーボードの 'M'を押して、A。 図2Iに示すように、結果ファイルは、個別に開きます。測定し、一つ一つに苗のすべてを記録します。例えば、最初のCOL-0から胚軸のすべてのための曲げ角度を測定した後、突然変異系統のため。
   6. AVを作るためにスプレッドシートファイルへのImageJからデータセットを転送します各背景の角度を曲げerage。
   7. 定量分析のために、標準エラーバーと確率値を含む統計的検定結果、（ 図2を参照）とバーグラフ図を作ります。
      1. 真の屈曲を計算します B、 ​​およびスプレッドシートを使用して式を設計することは、 すなわち、 B = 180° - A.注： Aは、ImageJの解析から導出された値です。
      2. 平均曲げ角度を測定スプレッドシートツール（ 図2J）を使用して、それぞれの背景B。
      3. スプレッドシートの「式」ツール（ 図2J）を使用して、各測定のための反復間の標準偏差を分析します。
      4. SIGのテスト平均曲げ角と上記のように計算された標準偏差値にt検定を適用して結果のnificance。
      5. グラフィカルスプレッドシート「挿入」ツール（ 図2K）を使用して2つの異なる背景の間の屈曲角度の量的違いを表現するために上記の値を使用して、棒グラフを描画します。
         注：強力な候補遺伝子の変異/過剰発現系統は、高速曲げや遅い曲げ、そのような無曲げなどの野生型に関して明らかな差を示すことになります。

改変されたPDカロースレベルとPD SELの変化による不良トロピック応答2.画面の植物系統

1. HPTSアガロースブロックと苗の上に8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS）色素添加によって胚軸ローディングアッセイを行い、変異の間の色素の移動の比較/過剰発現株およびCOL-0。
   1. HPTS agaroを準備胚軸ローディングアッセイのためのSEブロック。
      1. 50mlコニカルフラスコ中のddH ₂ Oを10mlを取り、1％アガロースゲルを調製し、アガロースを0.1gを加えます。断続的に振盪しながら1-2分間電子レンジでアガロースを茹でて、それを5分間冷却させます。
      2. 1％アガロース溶液10mlにHPTS 50mgを追加し、溶液が緑色になるまでよく混ぜます。
      3. 10 mmのペトリ皿に、上記混合物を入れ、それを15分間凝固することを可能にします。
      4. 小さ ​​なアガロースブロックを作るために鋭い解剖ブレード（0.5×2 cm ^2）を用いてアガロース固化HPTSをカットします。
   2. HPTS色素ローディングアッセイのために植物試料を準備します。
      1. HPTS色素負荷アッセイのためのプラットフォームを設定します。 図3（a）に示すように、新しいMS培地プレート上に顕微鏡カバースライド（24×50mmの^2）を配置します。
      2. 消費税​​鋭い手術用ハサミを使用して、フックの基部から3日齢の黄化苗。
      3. すぐに切除位置からの胚軸のわずか0.5センチカバースライド上に残るべきであるように、顕微鏡カバーガラスの表面に上記の苗（各背景から5苗の最小値）を転送し、胚軸の残りの部分は触れる必要があります図3Bに示すように、媒体。
      4. 切除された領域がHPTSアガロースブ​​ロックに触れるような方法で5分間（切除されたフックで）胚軸の上にHPTSアガロースブ​​ロックを配置します。
      5. ローディングの5分後、胚軸の表面からアガロースブロックを削除するのddH ₂ Oを含む10ミリメートルのペトリ皿に胚軸を転送し、連続的に振とうしながら15分間のddH ₂ Oで胚軸を洗います。
   3. 共焦点顕微鏡のためのサンプルを準備します。
      1. 共焦点レーザー走査顕微鏡観察用の各背景から5苗の最小値を選択します。
      2. レーザチャンネルでは、特定のEXCのための488 nmの波長を設定しますitationバンドパス放射500〜550ナノメートル。
      3. ddH ₂ Oで洗浄した後、新しい顕微鏡のスライドに2セットで転送苗（1 COL-0 + 1の変異体）スライドに二重蒸留水の100から150μLを追加し、カバースライドでカバーしています。共焦点顕微鏡のステージにスライドをシフトします。
      4. 明視野（白色光）照明を用いた（20Xや40X対物レンズ付き）胚軸領域をフォーカス。その後、蛍光についてスライドをスキャンします。
      5. 10セットの最小のための画像を撮影し、荷重の点から染料移動の程度を確認することにより、2つの背景を比較します。
         注：変更されたsymplasmic動きに変異/過剰発現株は、野生型COL-0に比べて色素負荷の異なるパターンが表示されます。
2. 変化した屈光性や重力屈性応答を表示カロースレベルミュータントで/過剰発現ラインを分析し、個別HPTS色素ムーブメント比較例を表示COL-0にエド。
   1. アニリンブルーカロース染色色素を準備します。
      1. オートクレーブ処理のddH ₂ Oに1 Mグリシン、pHは9.5と0.1％（W / V）アニリンブルーを作ります
      2. 3体積比：0.1％アニリンブルーと2中1Mグリシンを混合することにより、染色バッファーを作成します。例えば、染色緩衝液の50ミリリットルのために、0.1％アニリンブルーと1 Mグリシンの30ミリリットルの20ミリリットルを取ります。注意：染色は暗闇の中でそれを使用し、保存する前に48時間の最小値をバッファリングしてください。
   2. ステインは、カロース固有アニリンブルー色素で苗を曲がっまたは非曲がっ。
      1. 染色プロセス中デノボカロース合成を阻害するために、染色バッファー50mlに1.5mMの2-デオキシ-D-グルコース（DDG）の最終容量を加えます。
      2. （または向性応答なし）カロース染色のために3日齢の黄化苗を取ります。
      3. 薄い手術用はさみを使用して、フック領域から苗をカットします。
      4. 含まれている小さなペトリ皿に苗を移し爪楊枝の先端を使用して染色バッファーの2ミリリットルをる。
      5. 30 rpmで連続振とうしながら2時間、暗所で染色緩衝液で苗をインキュベートします。
      6. 染色した後、過剰染色バッファーを除去するために、2分間のddH ₂ Oで苗木を洗います。
      7. 共焦点レーザー走査顕微鏡観察用の各プラントの背景5苗の最小値を選択します。
   3. 共焦点顕微鏡のためのサンプルを準備します。
      1. 顕微鏡をきれいにするセットに苗を移し（1 COL-0 + 1の変異体は）のddH ₂ Oで洗浄した後にスライド
      2. ddH ₂ Oの100から150μlを添加して、カバースライドでカバーしています。共焦点顕微鏡のステージにスライドをシフトします。
      3. レーザチャンネルでは、特定の励起およびアニリンブルー蛍光イメージングのための500〜550 nmの発光に405 nmの波長を設定します。
      4. 10Xと後半で最初の、焦点に胚軸領域を持参明視野（白色光）照明を使用して、20Xや40X対物レンズとrを。
      5. その後、濾過し、光に切り替える蛍光についてスライドをスキャンし、画像を保存します。
      6. ImageJソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）とカロース信号強度を測定します（ 図4を参照してください）。
         1. JPEGファイル形式にオリンパスイメージバイナリ形式（* .oib）から共焦点顕微鏡画像の形式を変更します。注：のみJPEG形式は、ImageJソフトウェアによってサポートされています。
         2. ダブルクリック（ 図4A）によりImageJのプログラムを起動します。注：矢印はカロース強度測定（ 図4B）で使用される矩形のツールを示します。
         3. ImageJのツールバーの「開く」、およびカロース強度（ 図4C）を測定するためにJPEGファイル形式で保存されたオープンな顕微鏡画像サブオプションに続いて「ファイル」オプションをクリックします。
         4. いまの長方形のアイコンをクリックしますGEJツールバー（ 図4D）。
         5. 、信号強度を解析する画像の上にカーソルをドラッグして検査する領域を選択する（ 図4E）
         6. 測定し、キーボード（ 図4E）に'M'を押すことによって、信号強度の数値を記録。注：結果ファイルを個別に（ 図4F）を開きます。
         7. 測定し、強度は各工場の背景から苗のすべてのための1ずつ値を記録。
            注：ImageJのでは、そのファイルが「平均」を選択「エリア」の信号強度を示しています。
      7. ImageJの結果ファイルからの平均値をコピーし、定量分析のためにスプレッドシートファイルに貼り付けます。
      8. 定量分析のために、標準エラーバーと確率値（ 図4）などの統計的検定とバーグラフ図を作ります。
         1. 平均信号強度を測定しますスプレッドシートの「式」ツール（ 図4G）を使用して、それぞれの背景に（ImageJのから平均）。
         2. スプレッドシートの「式」ツール（ 図4G）を使用して、各測定のための反復間の標準偏差を分析します。
         3. thespreadsheet「式」ツールを使用して標準誤差（SE）を計算します。
            注：SE =秒/√N（S）は、標準的な集団の偏差、および（n）は、サンプルのサイズ（観測値の数）です。
         4. 平均信号強度と上記のように計算された標準誤差の値にt検定を適用することによって、結果の有意性をテストします。
         5. グラフィカルスプレッドシート「挿入」ツール（ 図4H）を使用して2つの異なる背景の間にカロースレベルの定量的な違いを表現するために上記の値を使用して、バーグラフの図を描画します。
            注：強力な候補の変異/過剰発現ラインますのどのように異なるような無カロース、ほとんどカロースまたはハイパーPDのカロースの蓄積などの野生型と比較カロースのレベル、。

結果

ホモ接合gsl8 T-DNA挿入変異体は致死^18苗されているように、現在の設定では、AtGSL8のデキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAiラインを使用した[（+ DEX / -dex）がdsGSL8を以後]。 dsGSL8と±デキサメタゾンと野生型苗の三日齢の黄化苗は屈光性や重力屈性刺激に曝露しました。我々はdsGSL8（+ DEX）苗は光屈性と重力屈性¹⁵で不良品で?...

ディスカッション

本稿では、戦略が原因したがって、PD SELが詳細に記載されている変更されたPDのカロースと、への屈光性や重力屈性応答の欠陥がある変異型/過剰発現株をスクリーニングします。 PDのカロース合成および分解は、主にカロース合成酵素とβ-1,3-グルカナーゼにより達成されるが、これらの酵素の調節は、多くの上流の因子によって制御されます。このような上流因子または直接PDの調節に関与?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds