אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג

Summary

מאמר זה מתאר את השיטות לסינון גני השליטה חדירה plasmodesmal ומכאן שיפוע אוקסין במהלך התגובה טרופית. זה כולל מדידת מידת התגובה הטרופית ב hypocotyl של ארבידופסיס thaliana ובדיקת חדירות plasmodesmal ידי טעינת חומצה 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic (HPTS) ולבסוף הערכת רמת callose.

Abstract

האוקסין הורמון הצמח ממלא תפקיד חשוב בתהליכי צמיחה רבים והתפתחותית, כולל תגובות טרופיות לאור הכביד. הקמת שיפוע אוקסין היא אירוע מרכזי שמוביל פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם. בעבר, תחבורת אוקסין קוטבית (PAT) הוצגה להקים שיפוע אוקסין בתחומים סלולריים שונים של צמחים. עם זאת, האן ואח '. הראו כי לאחרונה להיווצרות שיפוע אוקסין נכונה, plasmodesmal בתיווך callose קישוריות symplasmic בין תאים סמוכים הוא גם גורם קריטי. בכתב היד הזה, את האסטרטגיה כדי להבהיר את התפקיד של גנים מסוימים, אשר יכול להשפיע פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם ידי שינוי קישוריות symplasmic באמצעות ויסות סינתזת callose plasmodesmal, נדון. הצעד הראשון הוא להקרין תגובות טרופיות סוטות מן 3 ימים בת שתילים מולבנים של מוטציות או ביטוי יתר קווים של גן יחד עם הסוג הבר. סינון ראשוני זהיכול להוביל לזיהוי של מגוון רחב של גני תפקוד PAT או שליטת קישוריות symplasmic. ההקרנה השנייה כרוכה מיון מועמדים המראים תגובות טרופיות שינו ידי המשפיע קישוריות symplasmic. כדי לטפל מועמדים כאלה, את התנועה של נותב symplasmic ואת בתצהיר של callose plasmodesmal נבדקו. אסטרטגיה זו תהיה שימושית לחקור גני מועמדים חדשים שיכול לווסת קישוריות symplasmic במישרין או בעקיפין במהלך תגובות טרופות תהליכים התפתחותיים אחרים.

Introduction

צמחים, כמו אורגניזמים חיים נייחים, פתחו רשת מתוחכמת מאוד של תא אל תא איתות להתייחס לגירויים סביבתיים שונים. תגובות חוג הם אחת התופעות שבו צמחים להגיב לגירויים סביבתיים. צמחים להראות שתי תגובות טרופיות ראשיות, פוטוטרופיזם ו גרביטרופיזם. צמחים פוטוסינתטיים לכופף לכיוון מקור האור על ידי פוטוטרופיזם לקצור אנרגיה מקסימלית. באופן דומה, גרביטרופיזם עושה לצמחים לגדול לכיוון מרכז הכובד. המנגנון הבסיסי שמוביל תגובות טרופיות כאמורות כרוך היווצרות שיפוע סימטרית של אוקסין phytohormone ^1. פעולת היווצרות שיפוע אוקסין המקומית מאופיינת היטב; הגנים המעורבים במנגנון זה לספק מפת דרכים לפעולה הורמון ^2-8. העמדה הספציפית של ספקים בזרימת אוקסין, כגון קודי PIN הבנוי (PIN) ו- P-גליקופרוטאינים, מבצעת תנועת אוקסין מן הציטופלסמה אל דופן התא של תאי תורם ^9,10. Furthermore, על ידי פעילות symport הפעילה H ⁺ / רשות העתיקות של ספקי זרם אוקסין, כגון AUX1 / חלבוני מש' LAX, אוקסין הועבר סוף סוף תאי המקלט הסמוך ^2,11,12. התנועה של אוקסין כיוונית תופעה זו ידועה בשם תחבורה אוקסין קוטבי (PAT). PAT מוביל חלוק אוקסין הפרש במהלך שלבי התפתחות שונים בתגובה לגירויים סביבתיים שונים ^13,14. יתר על כן, שיבוש בלוקליזציה או ביטוי של כל הנשאים זרם או בזרימת אוקסין אלה מוביל שינוי חמור PAT, הגורמת לשיבוש שיפוע אוקסין, שמוביל ליקויים התפתחותיים. לאחרונה, האן ואח '. גם דיווח כי תקנת plasmodesmal היא הכרחית כדי לשמור על שיפוע אוקסין ^15. עד כה, יותר מ -30 חלבונים plasmodesmal זוהו ^16. בין החלבונים האלה, AtGSL8 דווחה כמו אנזים המפתח לסינתזת callose ב plasmodesmata (PD) ומכאן ממלא תפקיד חיוני בשימורaining למגבלת הכללת גודל PD (SEL). ביטוי מודחק AtGSL8 הביא לדפוס שיפוע אוקסין מעוות שמוביל לשום תשובה טרופית בניגוד שתילי סוג בר ^15.

בכתב היד הזה, שיטות לחקור גנים מועמדים חדשים אשר עוסקות בתקנה PD מסופקים. AtGSL8 שמש חלבון מודל כדי לבדוק שיטות אלה, כפי שהוא אנזים מפתח תורם PD ביוסינתזה callose. בשל שתיל-הקטלניות של מוטציות gsl8 נוק-אאוט ^17, dexamethasone (DEX) קווי RNAi -inducible שימשו בהתאם בדו"ח שפורסם בעבר ^15. האסטרטגיה הניתן כאן ניתן להתאים למסך גנים מעורבים בתגובה טרופי hypocotyl בשליטת PD SEL.

Protocol

הקרנת 1. של מוטאנטים עם שפנה אל האור שינו Gravitropic תגובות

1. כן Murashige 1x ו Skoog (MS) בינוני, pH 5.7, עם 0.8% אגרו יום אחד לפני הניסוי.
   1. להוסיף 800 מיליליטר מים מזוקקים כפולים בבקבוק 2 ליטר חרוטים ומערבבים עם פס מגנטי.
   2. להוסיף 4.4 גרם מלח MS בקבוק החרוטים.
   3. הוסף 0.5 גרם של 2- (N-Morpholino) חומצה אתאן sulphonic (MES) ומערבבים עד שכל מלחים מתמוססים לחלוטין.
   4. התאם את ה- pH של המדיום כדי 5.7 עם 1 M KOH.
   5. העבר הבינוני גליל המוני ולהביא נפח סופי 1 L עם DDH ₂ O.
   6. יוצק בחזרה המדיום לתוך בקבוק 2 ליטר חרוטים ולהוסיף 8 גרם של אגר צמח.
   7. עוטפים את הפה של הבקבוק חרוטי בחוזקה עם רדיד אלומיניום.
   8. החיטוי המדיום MS ו DDH ₂ O למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi, ואחרי מעוקר, לשמור המדיום באינקובטור 60 ° C ואת DDH ₂ O ב RT.
   9. לאחר קירור 60 ° C, לשפוך את המדיום לתוך 125 x 125 x 20 מ"מ ³ צלחות מרובעות על ספסל זרימה למינרית (50 מיליליטר בכל צלחת).
   10. אפשר אגר כדי לחזק ב RT במשך כ 1 hr על ידי שמירה על הצלחות פתוחה חלקית. אם הצלחות אינן משמשות באופן מיידי, לאטום אותם באמצעות פלסטיק לעטוף ולאחסן ב 4 ° C במקרר.
2. משטח לעקר את הזרעים עם תת-כלורי נתרן 1.1% ונקודה הזרעים על צלחות אגר 1x MS שהוכנו בסעיף 1.1.
   הערה: כאן, thaliana ארבידופסיס {Col-0 זרעים, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ משמשים התגובה טרופי, מכתים callose וטעינה HPTS thaliana ארבידופסיס {Col-0 ו dsGSL8 (Col-0) EMS מוטציה} זרעים (. לא פורסם) משמשים תגובה טרופית באיור 2.
   1. החיטוי 300 מ"ל של DDH ₂ O בבקבוק.
   2. להוסיף כמאה זרעים עבור כל רקע, כלומר,קו מוטציה / יתר ביטוי וסוג בר (Col-0) זרעים, כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
   3. להוציא צלחות 1x MS אגר ממקרר 4 ° C. ולייבש אותם על ספסל זרימה למינרית בעמדה פתוחה חלקית.
   4. משטח לעקר את הזרעים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון אקונומיקה 0.2X (חומצת נתרן 1.1%) ולשמור את צינורות microcentrifuge על שייקר ב 250 סל"ד במשך 5 דקות.
   5. תנו זרעים ליישב לתחתית ידי כוח הכבידה ולאחר מכן להסיר את הפתרון אקונומיקה על ידי micropipette.
   6. הוסף 1 מ"ל של DDH טרי ₂ O (autoclaved) לזרעים ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך microcentrifuge מספר פעמים. תן הזרעים להתיישב שוב ולאחר מכן להסיר את המים.
   7. חזור על שלב 1.2.6 5-6 פעמים.
   8. להוסיף הכמות כפולה של מים בהיקף של הזרעים שנשארו לאחר השטיפה הסופית.
   9. Dot הזרעים מעוקרות על צלחת אגר חצי יבשים 1x MS באמצעות קצה micropipette 1 מ"ל המכיל 200 μl של זרעים (במי cluding).
      1. שמור כ במרחק 0.1 ס"מ בין שני זרעים מינימום של 1.8 ס"מ בין שתי שורות זרע. Dot הזרעים בחמש שורות אופקיות לכל צלחת מרובע (125 x 125 x 20 מ"מ ^3). אפשר המים להתייבש מעט לפני הצבת את המכסה על הצלחת.
   10. חותם את הצלחות בעזרת פלסטר, מחסנית כל הצלחות אנכית, ועוטפים בנייר אלומיניום.
   11. מעביר את הצלחות העטופות לתיבה כהה (ללא גישת אור). לאחר מכן, לשמור על התיבה הכהה במקרר 4 מעלות צלזיוס בחדר / במשך 3 ימים.
   12. החל משלב זה, לשמור על הכיוון של צלחות ללא שינוי. לאחר 3 ימים של טיפול קר, לשמור על התיבה הכהה בחדר התרבות צמח ב 22 מעלות צלזיוס במשך 3 הימים הבאים. לאחר 3 ימים, לבדוק את מצב הנביטה של ​​הזרעים תחת אור ירוק בחדר חשוך.
       הערה: בדרך כלל 3 ימים בת Col-0 שתילים מולבן יכול לגדול עד 1.6 ס"מ אורך.
3. לנתח א שפנה אל האור שינהnd בתגובה gravitropic מוטנטים או ביטוי יתר הקווים של גן מסוים. בחר רק בגודל דומה ואנכי גדלו שתילים ישר תחת אור ירוק בחדר חשוך. עבר שתילים שנבחרו לצלחת אגרה 1x MS טרי באמצעות הקצה של קיסם מעוקר.
   1. בעדינות לבחור את השתילים מהחלק הנמוך ביותר של hypocotyl שלהם בלי לגעת בשום בחלקים אחרים. ודא כי כל יש השתילים באותו כיוון טבורית / וו, ולאחר ההעברה, כי הכיוון של ווי שתיל נשאר אותו הדבר. השתמש מינימום של 20 שתילים של כל רקע בכל שורת מינימום של שתי צלחות עבור כל נקודת זמן לניתוח נוסף.
      הערה: ארבעה מרקעים שונים ניתן להשוות בכל צלחת (4 שורות).
      אופציונלי: בעוד באמצעות dexamethasone (DEX) -inducible RNAi / יתר ביטוי שורות, להעביר את השתילים מעל ל MS 1x צלחת יחד עם צלחת + DEX MS (צלחת המכילה 1x MS, 0.8% בינוני אגר בתוספת 20 מיקרומטר DEX) FOhr r 3 ולשמור על הצלחות אנכיות בתיבה כהה.
   2. כדי לבדוק בתגובה שפנה אל האור, להעביר את הצלחות מעל אנכית כדי קופסה שחורה עם רק צד אחד נפתח. מעביר את הקופסה השחורה המכילה צלחות בתא גידול צמחים עם אור לבן חד-צדדי. כדי להבטיח אור חד צדדי, הנח את השולים צלחת לכיוון מקור האור (לא בצד הקדמי). עיין ההתקנה באיור 1.
   3. באופן דומה, כדי לבדוק את התגובה gravitropic, לשמור על צלחות עם מועברים השתילים אנכי, ומכסים ברדיד אלומיניום. לאחר מכן, לשנות את כיוון הצלחת אנכי 90 ° ולשמור אותו בתוך הקופסה השחורה מכוסה מכל הצדדים. עיין ההתקנה באיור 1.
   4. לאחר שהוחלט על נקודות זמן נתון, (בדרך כלל 1.5 שעות, 3 שעות, 6 שעות, ו -12 שעות) ולסרוק את הלוחות עם סורק, ולשמור את התמונות בפורמט JPEG.
   5. מדוד את זווית הכיפוף של שתילים באמצעות תוכנת ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (איוריור 2).
      1. הפעילו את תוכנית ImageJ על ידי לחיצה כפולה (איור 2 א).
         הערה: הכלים העיקריים ששימשו למדידת זווית מוצגים באיור 2B.
      2. לחץ על האפשרות "קובץ" ואחריו-אפשרות תת "פתוחה" בסרגל כלי ImageJ, ותמונות פתוחות שנשמרו בתבנית קובץ JPEG כדי למדוד את זווית כיפוף הטרופית (איור 2 ג).
      3. לחץ על כלי המגדלת כדי להגדיל או להקטין על התמונה על ידי לחיצה על כפתור העכבר שמאלה או ימינה, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 2B.
      4. לחץ על כלי גלילה לגרור ולמקם את התמונה (איור 2 ד) .Next, לחץ על כלי זווית כדי למדוד את זווית ההטיה (איור 2E).
         1. בצע קליק שמאלי כפול על hypocotyl המקורי נקודת כיוון גדל 'a', גרור את העכבר לנקודה ייזום כיפוף ב '(איור 2F), ולחץ התחת שמאלהעל מנת למתוח את הקו הראשון (איור 2G).
         2. גרור את העכבר מ b הצבע על 'ג' נקודת הסיום כיפוף, ולחץ על הלחצן השמאלי כדי לצייר את הקו השני (איור 2H) ויוצרים קבוע הערת א: זווית הכיפוף האמיתית היא B, אשר שווה 180 מעלות - א (איור 2F).
         3. מדוד ורשום A על ידי לחיצה 'm' במקלדת. קובץ התוצאה יפתח בנפרד כפי שמוצג באיור 2I. מדוד ורשום את כל אחד השתילים על ידי אחד. לדוגמא, ראשון למדוד את זווית כיפוף לכל hypocotyls מ Col-0 ולאחר מכן לקווי מוטציה.
   6. מעבירים את הנתונים מן ImageJ לקובץ גיליון אלקטרוני כדי להפוך את average של כיפוף זוויות של כל רקע.
   7. לניתוח כמוני, לבצע תרשים גרף עמודות עם תוצאות מבחן סטטיסטיות, כוללים ברי סטיית התקן וערכי הסתברות (ראה איור 2).
      1. חשבתי את הכיפוף הנכון B, ולעצב נוסחה באמצעות גיליון אלקטרוני, כלומר, B = 180 ° - פתק: A הוא ערך כי נגזר ניתוח ImageJ.
      2. מדוד את זווית הכיפוף הממוצעת B עבור כל כלי גיליון אלקטרוני באמצעות הרקע (איור 2J).
      3. נתח את סטיית התקן בין משכפל לכל מדידה שימוש באפשרות "נוסחאות" גיליון אלקטרוני (איור 2J).
      4. בדוק את significance של התוצאות על ידי החלת מבחן t לזווית כיפוף הממוצע וערכים סטיית התקן המחושבת כאמור לעיל.
      5. צייר תרשים בר באמצעות הערכים הנ"ל לייצג את ההפרש הכמותי גרפי זווית הכיפוף בין שני מרקעים שונים באמצעות כלי הגיליון האלקטרוני "יבוא" (האיור 2K).
         הערה: Mutant / יתר ביטוי שורות של גני מועמדים חזקים תיראינה הבדלים ברורים ביחס סוג בר, כגון אין כיפוף, מהיר כיפוף או כיפוף איטי.

2. קווי הצמח מסך עם תגובות פגומים חוג עקב שינוי PD SEL עם רמה שבוצע בהם שינוי PD Callose

1. בצע Assay טוען Hypocotyl ידי 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic חומצה (HPTS) טוען דיי על החלק העליון של שתילים עם HPTS Agarose בלוקים השווה את התנועה של דיי בין Mutant / Over-ביטוי קווים Col-0.
   1. כן HPTS agarose בלוקים עבור assay טעינת hypocotyl.
      1. קח 10 מ"ל של DDH ₂ O בבקבוק 50 מ"ל חרוטי ולהוסיף 0.1 גרם של agarose להכין ג'ל agarose 1%. מרתיחים את agarose במיקרוגל במשך 1-2 דקות עם רעד לסירוגין, ולאפשר לו להתקרר במשך 5 דקות.
      2. הוסף 50 מ"ג של HPTS עד 10 מ"ל של תמיסת 1% agarose, ומערבבים היטב עד הפתרון הופך ירוק.
      3. יוצקים את התערובת מעל לצלחת 10 מ"מ פטרי, ולאפשר לו לחזק במשך 15 דקות.
      4. חותכים את HPTS הקרושה agarose עם להב לנתיחה חדה לעשות בלוקים agarose קטן (0.5 x 2 ס"מ ^2).
   2. הכינו דגימות צמח עבור assay צבען טעינת HPTS.
      1. גדר פלטפורמה עבור assay צבע טעינת HPTS; המקום שקופיות כיסוי מיקרוסקופ (24 x 50 מ"מ ²⁾ על צלחת מדיום חדש MS כפי שמוצג באיור 3 א.
      2. בלו 3 שתילים מולבנים בן יום מהבסיס של הקרס באמצעות מספריים כירורגית חדים.
      3. מידלהעביר את השתילים לעיל (מינימום של 5 שתילים מכל רקע) אל פני השטח של זכוכית מכסה מיקרוסקופית בצורה כזאת שרק 0.5 סנטימטר של hypocotyl מעמדת הכריתה צריך להישאר בשקופית לכסות, ואת שאר hypocotyl צריך לגעת המדיום כפי שמוצג באיור 3 ב.
      4. מניח את גוש agarose HPTS על גבי hypocotyl (עם וו ניכר) במשך 5 דקות בצורה כזו כי האזור הניכר נוגע לחסום agarose HPTS.
      5. אחרי 5 דקות של טעינה, מסירה את החסימה agarose מפני השטח hypocotyl, להעביר את hypocotyls אל צלחת 10 מ"מ פטרי המכילה DDH ₂ O לשטוף hypocotyls DDH ₂ O למשך 15 דקות עם רעד מתמשך.
   3. הכינו דגימות למיקרוסקופיה Confocal.
      1. יש לבחור לפחות 5 שתילים מכל רקע להסתכלות במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.
      2. באפיק הליזר, להגדיר את אורך הגל 488 ננומטר עבור EXC הספציפיitation ו -500 כדי 550 ננומטר עבור פליטת הלהקה עוברים.
      3. שתילי העברה 2 סטים (אחד Col-0 + אחד מוטנטי) לשקופית מיקרוסקופית חדשה לאחר שטיפה עם DDH ₂ O. הוסף 100-150 μl של מים מזוקקים פעמיים לשקופית, ומכסים שקופיות כיסוי. Shift השקופית לשלב של המיקרוסקופ confocal.
      4. פוקוס באזור hypocotyl (עם עדשה אובייקטיבי 20X או 40X) באמצעות תאורה שדה בהיר (אור לבן). לאחר מכן, לסרוק את השקופיות עבור פלואורסצנטי.
      5. קח תמונות למשך תקופה מינימלית של 10 סטים, להשוות בין שני הרקעים על ידי בדיקת היקף התנועה לצבוע מנקודת הטעינה.
         הערה: Mutant / יתר ביטוי קווים עם תנועת symplasmic שינתה ייראו דפוסים שונים של צבע טעינה לעומת סוג בר Col-0.
2. נתח את רמת Callose ב Mutant / קווי יתר ביטוי מציג שפנה אל אור שיניתי Gravitropic ענות מציג הברור HPTS דיי תנועת compared עם הקולונל-0.
   1. הכן לצבוע מכתים callose כחול אנילין.
      1. הפוך 1 M גליצין, pH 9.5 ו -0.1% (W / V) כחול אנילין ב autoclaved DDH ₂ O.
      2. הפוך את החיץ מכתים ידי ערבוב כחול 0.1% אנילין ו -1 M גליצין ב 2: 3 יחס נפח. לדוגמה, עבור 50 מ"ל של חיץ מכתים, לקחת 20 מ"ל של אנילין 0.1% כחול 30 מ"ל של 1 M גליצין. הערה: הפוך את מכתים חיץ מינימום של 48 שעות לפני השימוש ולאחסן אותו בחושך.
   2. כתם bended או שאינו bended שתילים עם צבע כחול callose הספציפי אנילין.
      1. כדי לעכב את דה נובו callose סינתזה במהלך תהליך מכתים, מוסיפים את נפח סופי של 1.5 מ"מ 2-deoxy-D- גלוקוז (DDG) 50 מ"ל של חיץ מכתים.
      2. קח שתילים מולבנים בן 3 ימים עבור מכתים callose (עם או בלי תגובה טרופית).
      3. חותך את השתילים מאזור הוו שלהם באמצעות מספרי כירורגיות דקים.
      4. מעבירים את השתילים בצלחת קטנה פטרי המכילותing 2 מ"ל של חיץ מכתים באמצעות קצה של קיסם.
      5. דגירה את השתילים עם חיץ מכתים בחושך במשך שעה 2 עם רעד מתמשך ב 30 סל"ד.
      6. לאחר מכתים, לשטוף את השתילים עם DDH ₂ O למשך 2 דקות כדי להסיר חיץ מכתים עודף.
      7. יש לבחור לפחות 5 שתילים לכל רקע צמח להסתכלות במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.
   3. הכינו דגימות במיקרוסקופ confocal:
      1. מעבירים את השתילים סט (אחד Col-0 + אחד מוטנטי) לניקוי שקופיות מיקרוסקופ לאחר שטיפה עם DDH ₂ O.
      2. הוסף 100-150 μl של DDH ₂ O ומכסים שקופית כיסוי. Shift השקופית לשלב של המיקרוסקופ confocal.
      3. בשנת ערוץ ליזר, להגדיר את אורך הגל 405 ננומטר עבור עירור ספציפי ו -500 עד 550 ננומטר פליטה עבור ההדמיה של קרינה הכחולה אנילין.
      4. לדרדר את האזור hypocotyl אל המוקד, הראשון עם 10X ומאוחרr עם עדשות אובייקטיבי 20X או 40X באמצעות בהיר שדה (אור לבן) תאורה.
      5. לאחר מכן, לעבור על אור מסונן, לסרוק את השקופיות עבור קרינה, ולשמור את התמונות.
      6. מדוד את עוצמת אות callose עם תוכנת ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (ראה איור 4).
         1. לשנות את הפורמט של תמונות מיקרוסקופיה confocal מהתבנית בינארי תמונת אולימפוס (* .oib) לפורמט קובץ JPEG. הערה: רק בפורמט JPEG נתמך על ידי תוכנת ImageJ.
         2. הפעילו את תוכנית ImageJ על ידי לחיצה כפולה (איור 4 א). הערה: החצים מצביעים על כלי מלבן לשמש למדידת עוצמת callose (איור 4B).
         3. לחץ על האפשרות "קובץ" ואחריו-האפשרות תת "הפתוחה" בסרגל כלי ImageJ, ותמונות מיקרוסקופיה פתוחות שנשמרו בפורמט קובץ JPEG כדי למדוד את עוצמת callose (האיור 4C).
         4. לחץ על הסמל המלבני על האמאסרגל הכלים GEJ (איור 4D).
         5. כדי לנתח את עוצמת האות, וגרור את הסמן מעל התמונה ובחר את האזור להיבדק (איור 4E)
         6. מדוד ורשום את הערכים המספריים עבור עוצמת האות על ידי לחיצה על 'M' במקלדת (איור 4E). הערה: קובץ התוצאה יפתח בנפרד (איור 4F).
         7. מדוד ורשום את עוצמת ערכים אחד אחד עבור כל השתילים מכל רקע צמח.
            הערה: ב ImageJ, קובץ התוצאה "Mean" מציין את עוצמת האות של "השטח" שנבחר.
      7. העתק את הערכים הממוצעים מקובץ תוצאה ImageJ, ולהדביק בקובץ הגיליון על ניתוח כמותי.
      8. לניתוח כמותי, לבצע תרשים גרף עמודות עם מבחנים סטטיסטיים, כולל ברים סטיית התקן וערכי הסתברות (איור 4).
         1. מדוד את עוצמת האות הממוצעת(זאת אומרת, לפי ImageJ) עבור כל רקע שימוש באפשרות "נוסחאות" גיליון אלקטרוני (איור 4G).
         2. נתח את סטיית התקן בין משכפל לכל מדידה שימוש באפשרות "נוסחאות" גיליון אלקטרוני (איור 4G).
         3. חשב את סטיית התקן (SE) באמצעות thespreadsheet באפשרות "נוסחאות".
            הערה: s = SE / √ n, שם (ים) הוא סטיית התקן של האוכלוסייה, ו (n) הוא בגודל (מספר התצפיות) של המדגם.
         4. בדוק את המשמעות של התוצאות על ידי החלת מבחן t לעוצמת האות הממוצעת וערכי סטיית התקן מחושבים כאמור לעיל.
         5. צייר תרשים גרף עמודות באמצעות הערכים הנ"ל לייצג את ההפרש הכמותי גרפי ברמת callose בין שני מרקעים שונים באמצעות כלי הגיליון האלקטרוני "יבוא" (האיור 4H).
            הערה: Mutant / יתר ביטוי שורות של מועמדים חזקים יהיה יםכמה שונה רמות של callose לעומת סוג בר, כגון לא callose, callose מעט או הצטברות callose PD hyper.

תוצאות

בשנת ההגדרה הנוכחית, dexamethasone (DEX) קווי RNAi -inducible של AtGSL8 [להלן dsGSL8 (+ DEX / -dex)] שימשו, כמו מוטציות הכניסה הומוזיגוטים gsl8 T-DNA הם שתיל ¹⁸ קטלני. שלושה ימים בת שתילים מולבנים של dsGSL8 ושתילי סוג ברים עם DEX ± נחשפו לגירויים שפנה אל אור ואת gravi...

Discussion

בכתב היד הזה, אסטרטגיה להקרין מוטציה / יתר ביטוי קווים פגומים בתגובות שפנה אל אור ואת gravitropic בשל callose PD שינה, ומכאן, פ"ד SEL מתואר בפירוט. סינתזה השפלה callose PD מושגת בעיקר על ידי synthases callose ו β-1,3-Glucanases, אבל הרגולציה של אנזימים אלה נשלטת על ידי גורמים רבים במעלה הזרם. כדי לחפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds