的策略，以验证胼胝质介导的Plasmodesmal浇注在热带反应中的作用

摘要

本文介绍了筛选基因控制的热带响应期间plasmodesmal渗透性，因此生长素梯度的方法。这包括在胚轴热带反应程度的测量 拟南芥和8羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）装载终于胼胝质水平评估检查plasmodesmal渗透性。

摘要

植物激素生长素起着许多生长和发育过程，包括对光和重力热带反应中起重要作用。生长素梯度的建立是导致向光性和向地关键事件。先前，生长素极性运输（PAT）的结果表明在植物中的不同蜂窝结构域建立生长素梯度。然而，韩等人最近证明为正确生长素梯度的形成，在相邻小区之间plasmodesmal胼胝质介导的共质体连通也是一个关键的因素。在此手稿，策略阐明特定基因，其中可通过改变通过调制plasmodesmal胼胝质合成的共质体连通影响向光性和向地的作用，进行了讨论。第一步是筛选从突变体或基因的过表达的行3天龄的黄化苗异常嗜应答与野生型一起。这初步筛选可导致一系列基因PAT功能或控制共质体连通的识别。第二次筛选涉及候选人，显示通过影响共质体连通改变热带响应的排序。为了解决这样的候选人，一个共质体示踪剂的运动和plasmodesmal胼胝质的沉积进行检测。探索新的候选基因可以在热带的反应和其他发育过程直接或间接调节共质体连通这一战略将是有益的。

引言

植物，如固着活的生物体，已经开发了细胞 - 细胞信号传导的高度复杂的网络，以解决各种环境刺激。热带反应是由植物对环境刺激作出反应的现象之一。植物显示出两个主要的热带响应，向光性和向地。光合植物朝向光源通过弯曲向光性收获最大的能量。同样地，向重力使植物朝向重心生长。导致这些热带反应的基本机制涉及到植物激素生长素¹的不对称形成梯度。当地生长素梯度的形成的行为被很好地表征;所涉及的这种机制的基因提供激素作用^2-8的路线图。生长素流出载体，如个人识别码形成的（PIN）和P糖蛋白的特定位置，从细胞质到供体细胞^9,10的细胞壁执行生长素的运动。 Furthermore，通过将活性^的 H ⁺ / IAA同向转运生长素涌入载体，如AUX1 / LAX家族蛋白的活性，生长素最终递送到邻近的接收器单元^2,11,12。生长素的这个方向的运动被称为极性生长素输送（PAT）。 PAT中各个发育阶段以及响应于不同的环境刺激^13,14导致差分生长素分布。此外，在任何这些生长素流入或流出的载体的定位或表达的破坏导致的PAT严重改变，这会导致生长素梯度的破坏，导致发育缺陷。近日，韩寒等人 。报告说plasmodesmal调节也有必要保持生长素梯度^15。迄今为止，已有30 plasmodesmal蛋白质已经确定了^16个 。在这些蛋白质，AtGSL8已被报告为在胞间连丝（PD），用于胼胝质合成的关键酶，因此起着MAINT至关重要的作用癌宁对PD尺寸排阻极限（SEL）。压抑AtGSL8表达导致扭曲的生长素梯度图案导致在对比野生型幼苗¹⁵没有嗜响应。

在这份手稿，方法，探索参与PD调控提供了新的候选基因。 AtGSL8用作模型蛋白来测试这些方法，因为它是促进PD胼胝质的生物合成的关键酶。由于gsl8敲除突变体¹⁷秧苗杀伤力，地塞米松（DEX）诱导型的RNAi线按照使用了与以前公布的报告^15。这里提供的策略可适于筛选了在用PD SEL受控胚轴嗜响应牵连的基因。

研究方案

1突变体筛选与改变向光性和向重力响应

1. 制备1×Murashige和Skoog（MS）培养基，pH值5.7，用0.8％的琼脂一天实验之前。
   1. 加800毫升双蒸水至一个2升的锥形烧瓶中，并用磁力棒搅拌。
   2. 4.4克MS盐添加到锥形瓶中。
   3. 加入0.5克2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（MES），搅拌直到所有的盐的完全溶解。
   4. 调整培养基至5.7用1M KOH的pH。
   5. 介质传送到海量缸和使终体积到1L的DDH ₂ O
   6. 倒回介质到2升锥形瓶中，加入8克植物琼脂。
   7. 用铝箔紧紧包裹锥形烧瓶口。
   8. 高压灭菌的MS培养基和DDH ₂ O的15分钟，在121℃，15磅，和高压灭菌后，保持介质，在60℃培养箱和DDH ₂ O的室温。
   9. 冷却至60℃之后，倒入介质成125×125×20mm的³方板的层流长凳上（50毫升每块板）。
   10. 允许琼脂通过保持所述板部分打开在RT固化约1小时。如果板被不立即使用，通过在冰箱用保鲜膜和储存在4℃下密封。
2. 表面消毒用1.1％的次氯酸钠的种子点在1.1节制备的1倍MS琼脂平板上的种子。
   注:在这里， 拟南芥 {Col-0中的种子，dsGSL8（Col-0中 ）} ¹⁵用于热带响应，胼胝质染色和HPTS装载拟南芥 {Col-0中和dsGSL8（Col-0中 ）EMS突变}种子（。未公布的）被用于在图2中嗜响应。
   1. 高压灭菌300毫升的DDH ₂ O的瓶子。
   2. 添加大约为一百种子为每个背景， 即突变体/过表达系与野生型（Col-0中 ）种子，到1.5ml微量离心管中。
   3. 取出从4℃的冰箱1倍的MS琼脂平板上，在部分打开位置晾干层流工作台上。
   4. 通过加入1ml的0.2×漂白溶液（1.1％次氯酸钠）的表面消毒的种子，并保持在微量离心管在摇床上以250rpm进行5分钟。
   5. 让种子通过重力沉在底部，然后取出用微量漂白粉溶液。
   6. 加入1毫升的新鲜的DDH ₂ O（灭菌）的种子并颠倒离心管数次拌匀。让种子再次沉降，然后除去水分。
   7. 重复步骤1.2.6 5-6倍。
   8. 水双倍量加入到最终洗涤之后被留下的种子的体积。
   9. 点上使用含有200微升的种子1毫升微量移液器尖端的半干燥1倍的MS琼脂平板上的消毒的种子（在cluding水）。
      1. 保持两个种子和​​至少两种行之间1.8厘米之间约0.1厘米的距离。圆点每平方板（125×125×20mm的^3）五横行的种子。让水将盖到前盘稍干。
   10. 密封采用外科胶带板，堆栈中的所有板垂直，并用铝箔包裹。
   11. 转移包裹板，以暗箱（没有进入光）。然后，保持暗箱在4℃的室温/冰箱3天。
   12. 从该步骤开始，保持板不变的方向。经过冷处理3天，保持在22℃，植物培养室在接下来的3天暗箱。 3天后，检查在黑暗的房间在绿灯种子的发芽状态。
       注:通常3日龄的Col-0黄化苗可长到1.6厘米长。
3. 分析改变向光性一个在突变体或过度表达的特定基因的线十二次向地响应。在黑暗的房间中选择下绿灯只有同样大小和垂直生长的直苗。传送所选苗使用杀菌牙签的前端的新鲜的1X MS琼脂板上。
   1. 轻轻地选择自己的下胚轴的最低部分秧苗时不接触任何其他部分。确保所有的苗木具有相同的子叶/挂钩方向，转让后，即苗挂钩的方向保持不变。使用最少20苗​​每行中的每个背景和用于进一步分析每个时间点至少两个板组成。
      注意:四种不同的背景可以在每个板（4行）进行比较。
      可选:在使用地塞米松（DEX）诱导型的RNAi /过表情纹，上面的苗转移到1X MS与+ DEX MS板块沿（含有1x MS板，0.8％琼脂培养基中添加20μMDEX）FOR 3小时，并在暗箱保持垂直板。
   2. 要检查趋光反应，垂直转移上述板到黑匣子只开了一边。包含板的黑盒单侧​​白光转移到植物生长室。以确保单侧光，将朝向光源（未前侧）的板的边缘。指设置在图1中。
   3. 同样，检查向地反应，保持与平板转移苗垂直，并用铝箔覆盖。其次，改变垂直板方向90度，并保持它从四面八方覆盖的黑盒子里面。指设置在图1中。
   4. 在给定的时间点后，（通常为1.5小时，3小时，6小时和12小时）扫描所述板用扫描器，并保存在JPEG格式的图片。
   5. 测量使用ImageJ软件（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）幼苗的弯曲角度（ 图URE 2）。
      1. 启动通过双击（ 图2A）的ImageJ的程序。
         注意:在角度测量中使用的主要工具是图2B所示。
      2. 点击"文件"选项后面的子选项"打开"ImageJ的工具栏，并保存在JPEG文件格式来衡量热带弯曲角度（ 图2C）打开图片。
      3. 点击放大镜工具，通过点击鼠标左右键，分别如图2B所示放大或缩小图片。
      4. 点击滚动工具拖动和放置图像（ 图2D）。接下来，单击角度工具来测量弯曲（ 图2E）的角度。
         1. 使原始胚轴生长方向点'A'，拖动鼠标弯曲起始点'B'（ 图2F），然后单击左屁股左键双击上绘制的第一行（ 图2G）。
         2. 从b点鼠标拖动到弯曲结束点"C"，并单击左键绘制第二行（ 图2H）和形成固定 A.注意:真正的弯曲角 B，它等于180° - A.（ 图2F）。
         3. 测量和记录通过按下键盘上的'M'A。 如图2I结果文件将单独打开。测量和一个记录所有苗木之一。例如，第一测量对于所有从Col-0中的下胚轴的弯曲角度，然后为突变品系。
   6. 从ImageJ的转移数据集电子表格文件，使AV弯曲每个后台的角度erage。
   7. 进行定量分析，使用统计测试结果，包括标准误差棒和概率的值（参见图2）的柱状图图。
      1. 计算真实弯曲 B，使用电子表格设计一个公式， 即: B = 180° - 一张纸条: A是一个从ImageJ的分析得出的值。
      2. 测量平均弯曲角度 B中各使用后台电子表格工具（ 图2J）。
      3. 分析使用电子表格"公式"的工具（ 图2J）每次测量重复之间的标准偏差。
      4. 测试SIG结果通过施加t-试验对平均弯曲角度和上述计算出的标准偏差值的着性。
      5. 使用上述值来使用的电子表格"插入"工具（ 图2K）以图形方式表示在两个不同的背景之间的弯曲角度的定量差绘制一个直条图。
         注:强有力的候选基因突变/过度表达线将显示方面明显的差异野生型，如无弯曲，弯曲快或慢弯曲。

2.屏幕株系有缺陷的热带响应由于PD SEL变化具有改变PD胼胝质水平

1. 8羟基芘- -1,3,6-三对顶部幼苗与HPTS琼脂糖块酸（HPTS）染料加载执行下胚轴加载分析，比较染料的突变体之间的运动/过表达线和Col-0中 。
   1. 准备HPTS琼胶SE块胚轴加载试验。
      1. 取10毫升DDH ₂ O的在50ml锥形瓶中，并添加0.1克琼脂糖以制备1％琼脂糖凝胶。煮沸琼脂糖在微波炉1-2分钟间歇摇动，并让它冷却5分钟。
      2. 50毫克HPTS的可加10毫升1％琼脂糖溶液，搅拌均匀，直到溶液变为绿色。
      3. 倒入上述混合物至10毫米培养皿，并允许它固化15分钟。
      4. 用锋利的刀片解剖剪琼脂糖凝固HPTS做小琼脂糖块（0.5×2 ^平方厘米）。
   2. 准备植物样品的HPTS染料加载试验。
      1. 设置了HPTS染料负载测定的平台;上放置一个新的MS培养基平板的显微镜盖玻片（24×50毫米^2）， 如图3A所示 。
      2. 从钩的基地使用锋利手术剪消费为期3天的老黄化苗。
      3. 立即传送上述秧苗（从每个背景最少5苗），以微观盖玻璃的表面中，使得只有0.5厘米处的切除位置胚轴的应保留在盖玻片上的方式，和胚轴的其余部分应该接触如在图3B中所示的介质。
      4. 放置在胚轴的顶部HPTS琼脂糖块（带有一个切钩）中5分钟以这样的方式使切下的区域接触HPTS琼脂糖块。
      5. 5分钟装载后，从胚轴表面去除琼脂糖块中，下胚轴转移到含有DDH ₂ O的10毫米的培养皿并在DDH ₂ O洗胚轴与连续摇动15分钟。
   3. 准备共聚焦显微镜的样品。
      1. 从激光扫描共聚焦显微镜下的每个背景观察选择至少5苗。
      2. 在激光信道，波长设置为特定EXC 488纳米itation和500至550nm为带通发射。
      3. 在2台传送秧苗（一个的Col-0 +一个突变）到一个新的显微镜载玻片用的DDH ₂ O洗涤后添加100-150微升双蒸水至滑动，并用盖玻片覆盖。移幻灯片以共焦显微镜的阶段。
      4. 采用亮场（白光）照明聚焦下胚轴区域（具有20X 40X或物镜）。然后，扫描荧光的幻灯片。
      5. 拍摄图像最少10套，并通过从装货点检查染料移动的范围的两个背景进行比较。
         注意:突变/过表达系具有改变的共质体的运动将表现出与野生型相比Col-0中染料载荷不同的模式。
2. 分析胼胝质水平突变/过度表达线条显示修改过的向光性和向重力响应和显示鲜明HPTS染料运动
   比较教育署COL-0。
   1. 准备苯胺蓝染色胼胝质染色。
      1. 使1M甘氨酸，pH为9.5和0.1％（W / V）的苯胺蓝在高压灭菌的DDH ₂ O
      2. 3体积比:通过混合0.1％苯胺蓝和2 1M甘氨酸使染色缓冲液。例如，对于50毫升染色缓冲液中，取20毫升0.1N％苯胺蓝和30毫升的1M甘氨酸。注意:请染色缓冲最低使用和储存在黑暗中前48小时。
   2. 染色弯曲或无弯曲与特定的胼胝质苯胺蓝染色苗。
      1. 以在染色过程中抑制从头胼胝质合成，1.5mM的2-脱氧-D-葡萄糖（DDG）的最终体积加至50ml染色缓冲液中。
      2. 就拿胼胝质染色（有或无响应热带）3日龄的黄化苗。
      3. 切薄用手术剪从他们的钩地区的苗。
      4. 转移苗小培养皿中含有ING用牙签的尖端2毫升染色缓冲液中。
      5. 孵化用染色缓冲幼苗在黑暗中2小时连续摇动以30rpm。
      6. 染色后，清洗与DDH ₂ O的幼苗2分钟以除去过量的染色缓冲液中。
      7. 选择一个最小的5苗的激光扫描共聚焦显微镜下每个工厂背景观察。
   3. 准备共聚焦显微镜的样品:
      1. 转移苗组（单的Col-0 +一个突变）清洁显微镜的DDH ₂ O.洗涤后滑
      2. 添加DDH ₂ O的100-150微升，并用盖滑盖。移幻灯片以共焦显微镜的阶段。
      3. 在激光信道，波长设置为特定激发405nm和500至550nm发射苯胺蓝荧光的成像。
      4. 与10X和后期带来胚轴区成为关注的焦点，第一R，其中采用亮场（白光）照明20X 40X或物镜。
      5. 然后，打开过滤光线，扫描幻灯片荧光，并保存图像。
      6. 衡量ImageJ的软件（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）胼胝质信号强度（ 见图4）。
         1. 改变从奥林巴斯图像二进制格式（* .oib）到JPEG文件格式共聚焦显微镜图像的格式。注意:只有JPEG格式是由ImageJ的软件支持。
         2. 启动通过双击（ 图4A）的ImageJ的程序。注:箭头指示矩形工具在胼胝质强度测量（ 图4B）被使用。
         3. 点击"文件"选项后面的子选项"打开"ImageJ的工具栏，然后打开显微镜照片中保存的JPEG文件格式来测量胼胝强度（ 图4C）。
         4. 点击伊玛矩形图标GEJ工具栏（ 图4D）。
         5. 分析信号强度，拖动光标在画面和选择区域进行检查（ 图4E）
         6. 测量，按"M"键盘（ 图4E）上录制的信号强度的数值。注:结果文件将开立单独的（ 图4F）。
         7. 测量和记录的强度值逐一对所有从每个工厂背景的苗木。
            注意:在ImageJ的，结果文件"平均"表示所选择的"区域"的信号强度。
      7. 平均值从ImageJ的结果文件的拷贝，并在定量分析的电子表格文件粘贴。
      8. 进行定量分析，使用统计检验，包括标准误差棒和概率值（ 图4）的柱状图图。
         1. 测量的平均信号强度（从ImageJ的意思）使用电子表格"公式"工具（ 图4G）每个后台。
         2. 分析使用电子表格"公式"的工具（ 图4G）用于每次测量重复之间的标准偏差。
         3. 计算使用thespreadsheet"公式"工具的标准误差（SE）。
            注意:SE = S /√n，其中（s）是总体的标准偏差，和（n）是该样品的尺寸（观测数）。
         4. 通过施加t检验到的平均信号强度，并且如上所述计算出的标准误差值测试结果的意义。
         5. 使用上述值来使用的电子表格"插入"工具（ 图4H）以图形方式表示在两个不同的背景之间的胼胝质水平的定量差绘制的柱状图图。
            注:强有力的候选人的突变/过度表达线将小号与野生型胼胝质的水平，如无胼胝质，胼胝质很少或超PD胼胝质的积累有什么不同。

结果

在当前的设置，AtGSL8的地塞米松（DEX）诱导型的RNAi线[以下dsGSL8（+ DEX / -dex）]中使用，作为纯合子gsl8 T-DNA插入突变体幼苗致死^18。 dsGSL8和野生型苗±DEX三日龄的黄化苗暴露于向光性和向地刺激。我们发现，dsGSL8（+ DEX）幼苗中向光性和向地¹⁵有缺陷。 图5清楚地表明，dsGSL8（+ DEX）呈现既向光性和向地的?...

讨论

在此手稿，一个策略来筛选由于改变的PD胼胝质，因此，PD SEL中详细描述的突变体/过表达系是在向光性和向地响应缺陷的。 PD胼胝质合成和降解主要由胼胝质合成酶和β-1,3-葡聚糖酶来实现，但这些酶的调节是通过许多上游因素控制。要搜索这样的上游因素或直接参与PD调控的候选人，我们已建立了筛选此方法。这种设置有一些限制，调节PD胼胝质合成（gsl8）的一些关键酶的突变体是致命的<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 ml glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri dish (35 mm x 10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 mm x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds