JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Abstract

فن إنتاج البروتينات المؤتلف مع بعض التعديلات بعد متعدية معقدة يمثل تحديا كبيرا للدراسات البنية والوظيفة. إنشاء السريع واسترداد عالية من خطوط الخلايا الثديية عابر.، ويتناول هذا الحاجز ويشكل وسيلة فعالة للتعبير عن البروتينات التي يتم توجيهها بشكل طبيعي من خلال ER ومسار إفرازية بوساطة جولجي. هنا هو بروتوكول واحد للتعبير البروتين باستخدام HEK293F البشرية وخطوط الخلايا HEK293S مع transfected متجه التعبير الثدييات مصممة لعوائد عالية من البروتين. مدى انطباق هذا النظام كما يتجلى ذلك باستخدام ثلاثة بروتينات سكرية التمثيلية التي أعربت عن ذات العوائد بين 95-120 ملغ من البروتين المنقى تعافى للتر الواحد من الثقافة. هذه البروتينات هي FcγRIIIa البشرية وsialyltransferase الفئران α2-6، ST6GalI، سواء أعرب مع GFP الانصهار N-محطة، وكذلك الغلوبولين المناعي البشري معدلة G1 لكرة القدم. هذا النظام يده قويةlizes وسيلة خالية من المصل التي هي قابلة للتكيف للتعبير عن البروتينات والكربوهيدرات للدراسات الهيكلية باستخدام مطياف الكتلة والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي المخصب نظائريا. وعلاوة على ذلك، تكوين N-غليكان يمكن ضبطها من خلال إضافة جزيء صغير لمنع بعض التعديلات غليكان بطريقة لا يقلل من العائد.

Introduction

إنتاج غلة عالية من البروتينات البشرية مطوية بشكل مناسب وبعد translationally معدلة لتحليل مفصل للبنية ووظيفة لا يزال يشكل تحديا كبيرا. تتوفر التي تنتج البروتينات المؤتلف مع مثل مواطن وظيفة والسلوك وهناك عدد كبير من أنظمة التعبير. أنظمة التعبير البكتيرية، في الغالب سلالات الإشريكية القولونية، تمثل الأدوات التي يمكن الوصول إليها والتي يشيع استخدامها في المجال البحثي، نظرا لبساطة هذه الأنظمة التعبير، على الرغم من الخميرة، والنباتات والحشرات والثدييات أنظمة موصوفة 1-4 أيضا. ومع ذلك، فإن معظم هذه النظم غير قادرة على تعديل ما بعد متعدية المناسب من البروتينات المستهدفة. A المصالح الأساسية للمختبرات اذع والوفل تنتج بروتينات حقيقية النواة مع بالغليكوزيل المناسب. العديد من البروتينات البشرية تتطلب بالغليكوزيل المناسب للوظيفة المناسبة (انظر 5).

في حقيقية النواةماكينات بالغليكوزيل واسعة النطاق وقادرة على صنع مجموعة متنوعة من التعديلات، بما في ذلك الأسباراجين (N) - وسيرين / ثريونين (O) -linked glycans معقدة 6. ويقدر أن> 50٪ من البروتينات البشرية هي N-الغليكوزيلاتي 7. Glycans هي عناصر أساسية في العديد من البروتينات بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية، إرثروبويتين، وعوامل تخثر الدم مثل عامل التاسع، على سبيل المثال لا الحصر. على الرغم من وجود طرق متعددة لتحضير البروتينات بشكل مناسب N-الغليكوزيلاتي وتتراوح الاصطناعية بحتة 10/08، لchemoenzymatic 11-14 أو التعافي من أنظمة المؤتلف المهندسة 15-20، وليس من المستغرب، ونظم التعبير الإنسان وقد ثبت حتى الآن أن يكون أكثر قوة طرق لتوليد بروتينات بشرية.

ويتم إنتاج العديد من بروتينات سكرية الإنسان العلاجية في أنظمة المؤتلف باستخدام خلايا الثدييات. نظم المذكرة هي الهامستر المبيض الصينية (CHO)، والماوس المايلوما (NS0)، بيبي الهامستر Kidneص (BHK)، الجنينية البشرية الكلى (HEK-293) وخطوط الخلايا في شبكية العين البشرية التي يعملون في الالتصاق أو التعليق الثقافة لإنتاج البروتين 4،21،22. ومع ذلك، فقد يتطلب أنظمة تعبير البروتين الثدييات جيل من خطوط الخلايا مستقرة، وسائط النمو مكلفة والركيزة ساعدت إجراءات ترنسفكأيشن 23.

ويتحقق ترنسفكأيشن الخلية الثديية بمساعدة العديد من العوامل بما في ذلك الفوسفات الكالسيوم 24،25، والبوليمرات الموجبة (DEAE-ديكستران، polybrene، متعدد الليزين، polyethylimine (PEI)) أو الجسيمات الشحمية الموجبة موجبة الشحنة 26-29. PEI هو polycationic، اتهم، خطي أو البوليمر تشعبت (25 كيلو دالتون) 26 الذي يشكل مجمع مستقرة مع DNA وendocytosed. على تحمض الاندوسوم، ويعتقد PEI للتضخم، مما أدى إلى تمزق الإندوسومات والإفراج عن الحمض النووي في السيتوبلازم 26،30.

حتى وقت قريب، ترنسفكأيشن عابرة في suspensiعلى الثقافة كان يحملها الحمض النووي / PEI تشكيل معقد مسبق يليه بالإضافة إلى زراعة الخلايا 29. ومع ذلك، ذكرت ورم وزملاء العمل بروتوكول كفاءة عالية الأمثل لإنتاج البروتين المؤتلف في الخلايا HEK293 التي شكلت مجمع DNA / جزيرة الأمير إدوارد في الموقع 31،32. تجنب هذا الإعداد والتعقيم للمجمع، وتبادل عازلة في مستنبت. مزيد من التحسين من قبل بما في ذلك البلازميدات المعززة للتعبير أدى إلى زيادة العائد الكبير 33. هنا هو الطريقة التي يبني عليها هذه السلف وغير قابلة للتطبيق على نطاق واسع. ويمكن أيضا أن تتغير الظروف التعبير للتأثير على تكوين-N غليكان.

خط الخلية HEK293S، مع حذف الجينات التي توقف تجهيز N-غليكان في مرحلة وسيطة، ويؤدي إلى التعبير عن البروتينات مع الزي N-glycans يتكون من 2 بقايا N-acetylglucosamine بالإضافة إلى خمسة بقايا المانوز (مان 5 GlcNAc 2) 34، 35. هذه الخلاياتفتقر إلى ترانسفيراز N-acetylglucosaminyl I (GntI) الجين الذي هو مطلوب للالمصب-N غليكان معالجة 36،37. استخدام مثبطات ناقلة الغليكوزيل بما في ذلك kifunensine، النظير الحامض اللعابي وفوكوسي التناظرية و2-ديوكسي-2-الفلورية فوكوسي له تأثيرات وحدود المعالجة N-غليكان 38-41 مماثلة.

ذكرت بروتوكول هنا يستخدم ناقل pGEn2 كما هو مبين في الشكل 1 42،43، PEI بمساعدة ترنسفكأيشن عابرة إلى خطوط خلايا الثدييات (HEK293F أو خلايا HEK293S)، واسترداد عوائد عالية من البروتين الغليكوزيلاتي بشكل مناسب. هذا النظام هو قوي ويمكن أن تستوعب عوامل مختلفة بما في ذلك وضع العلامات النظائر والهندسة غليكان لإنتاج التتر كبيرة من البروتينات المؤتلف.

Protocol

هذا البروتوكول هو كاف للتعبير باستخدام HEK293F أو خلايا HEK293S.

1. خلية المؤسسة

  1. ثقافة التلقيح
    ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات التلاعب الثقافة في منشأة BSL-2 وكل بند جلبت الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية يجب تعقيمها عن طريق الرش مع الايثانول 70٪ في محلول مائي.
    1. تعمل شاكر حاضنة عند 135 دورة في الدقيقة، 80٪ الرطوبة وعند 8.0٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. تحويل "على" مصباح الأشعة فوق البنفسجية من الوزراء للسلامة الأحيائية 1 ساعة على الأقل قبل العمل. Prewarm مختومة المتوسطة A والمتوسطة B زجاجات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. تعقيم 125 مل قوارير النمو مخروطي مع قبعة تنفيس، الماصات، pipettors، والزجاجات وسائل الاعلام prewarmed عن طريق الرش مع الايثانول 70٪ في محلول مائي. ضع هذه العناصر في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. ملاحظة: تعقيم سوى البلاستيك الخارجي الذي يغطي 125 مل مخروطي قارورة الثقافة، ثم قم بإزالة فقط عندما طالصورة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    3. من أجل ثقافة 30 مل، 26 مل من سحب متوسطة A و 3 مل من متوسط ​​B (10٪ من ثقافة النهائية) ونقل إلى 125 مل دورق مخروطي سعة الثقافة وبلطف مزيج التي تهز (وهو ما يسمى فيما بعد باسم مستنبت الطازجة).
    4. نقل قنينة واحدة من الخلايا التي تحتوي على خلايا HEK293F، في المجمد -80 ° C، على الجليد والانتقال إلى غرفة الثقافة. ملاحظة: يتم تزويد خلايا HEK293F في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 خلية / مل.
    5. تدفئة القارورة بلطف في الماء حمام عند 37 درجة مئوية لذوبان الجليد جزئيا الخلايا (يستغرق ما يقرب من دقيقة والخلايا لا ينبغي إذابة تماما). تعقيم خارج القارورة مع الايثانول 70٪ في محلول من المياه ونقلها الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
    6. باستخدام 1 مل ماصة، سحب تعليق خلية (حوالي 0،7 مل)، ونقل إلى 125 مل دورق مخروطي يحتوي على 29 مل من مستنبت الطازجة. إغلاق غطاء القارورة الثقافة ونقلها إلى شاكر المحتضنة.
    7. صيانة الخلية: التحقق من كثافة الخلايا، والسلامة ومقاطع الخلية
      1. تحقق من كثافة الخلايا بعد 24 ساعة من ذوبان ثقافة باتباع بروتوكول أدناه. تزرع الخلايا لمدة 24 ساعة بعد ذوبان لضمان نمو الخلايا الأساسية وجدوى> 80٪: مذكرة.
      2. تعقيم قارورة الثقافة مع الايثانول 70٪ في محلول من المياه ونقلها الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
      3. باستخدام ماصة 1 مل و pipettor، سحب ببطء 100 ميكرولتر من ثقافة التعليق ونقل إلى العقيمة 0.5 مل إيبندورف أنبوب. إغلاق ونقل قارورة الثقافة العودة الى شاكر في أقرب وقت ممكن.
      4. مزيج 7.5 ميكرولتر من التريبان الأزرق الحل مع 7.5 ميكرولتر من الخلايا. مزيج بقوة مع 7.5 ميكرولتر من خلية / التريبان خليط الأزرق وتحويلها إلى الشريحة العد.
      5. بدوره على مكافحة الخلايا التلقائي ووضع شريحة العد الى غرفة التحميل. يتم تنشيط القارئ السيارات وتحسب الخلايا تلقائيا في الوحداتمن عدد الخلايا في جدوى مل و في المئة
      6. تحديد حجم ثقافة المانحة المطلوبة للنقل إلى مستنبت جديدة على كثافة خلايا 0.3 × 10 6 الخلايا الحية / مل.
        ملاحظة: انظر حساب العينة في المواد التكميلية.
      7. كرر الخطوات 1.1.2 و1.1.3 من البروتوكول "1.1 ثقافة التلقيح" أعلاه لإعداد المواد اللازمة لمستنبت الطازجة.
      8. نقل متوسطة A (23 مل) والمتوسطة B (3 مل) إلى طازجة 125 مل قارورة الثقافة. إزالة زجاجات الأسهم المتوسطة والمتوسطة وB من مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
        ملاحظة: لا ينبغي أن تبقى مخزونات زجاجات وسائل الاعلام في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية في نفس الوقت خلايا كلوة 293F. وهذا يحد من إمكانية تلوث زجاجات الأسهم المتوسطة.
      9. إزالة ثقافة الخلية HEK293 من الحاضنة ورذاذ مع الايثانول 70٪ في محلول مائي. باستخدام ماصة جديدة، سحب قسامة من الخلايا (4 مل، تم تحديد هذا الحجم وفقا رس خطوة 1.2.6) من الثقافة ونقلها إلى القارورة التي تحتوي على مستنبت الطازجة.
      10. نقل كل من الثقافات من الوزراء للسلامة الأحيائية إلى شاكر حاضنة تعيين وفقا ل1.1.1. تنمو الخلايا لكثافة التقريبية 2-3 × 10 6 الخلايا الحية / مل.
        ملاحظة: المرة مضاعفة التقريبي للخلايا هو 32 ساعة. وسوف يستغرق 3-4 أيام للوصول إلى هذه الكثافة. احتضان الخلايا لمدة 3-4 ممرات أن يكون نمط النمو المستقر للخلايا قبل ترنسفكأيشن الأول.

    2. إعداد المواد اللازمة لترنسفكأيشن

    1. إعداد خلايا HEK293 (يوم 1)
      1. خلايا فرعية لكثافة من 1 × 10 6 خلية / مل في متوسطة جديدة B 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن وفقا للخطوة 1.2.
        ملاحظة: حجم ثقافة ترنسفكأيشن ستعتمد على عدد من الخلايا. سوف أحجام ترنسفكأيشن أكبر (> 20 مل) تتطلب كمية أكبر من الثقافة في هذه المرحلة.
    2. إعداد القديسocks المواد
      1. إعداد محلول المخزون من Polyethylenimine الخطي (PEI) بتركيز 1 ملغ / مل في منطقة عازلة تحتوي على 25 ملي 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) و 150 ملي كلوريد الصوديوم (7.5 درجة الحموضة). حل PEI تماما. هذا قد يستغرق 30-60 دقيقة في RT. تعقيم خلال 0.22 ميكرومتر تصفية حقنة وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها على المدى الطويل.
      2. إعداد DNA البلازميد العقيمة (وفقا لخطوات 2.2.2.1-2.2.2.4). يتم وصف هذا الإجراء بناء البلازميد في أماكن أخرى 42. وأوضح الإجراء موجز لإعداد DNA هنا:
        1. تنمو ثقافة خلايا الإشريكية القولونية كيميائيا المختصة تحولت مع ناقلات pGEn2 في 1 لتر من LB المتوسطة (Tryptone- 10 ز / L، الخميرة extract- 5 ز / L وchloride- الصوديوم 10 جم / لتر) تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. E. يزرع القولونية عند 37 درجة مئوية في غير مرطب، والهز الحاضنة.
        2. تنقية DNA pGEn2 ترميز ناقلات البلازميد الهدف وفقا لمانوfacturer في DNA بروتوكول تنقية.
        3. لضمان العقم الكامل للDNA البلازميد، نفذ هطول الأمطار الأيسوبروبانول وإعادة تعليق الخطوات النهائية للإجراءات استخراج الحمض النووي داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
        4. إضافة حجم الأيزوبروبانول (المحدد في إعداد ملف البلازميد) إلى الحمض النووي مزال وأجهزة الطرد المركزي في 10000 س ز لمدة 10 دقيقة. تعقيم خارج الحاوية الحمض النووي مع الايثانول 70٪ في محلول من المياه ونقلها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. تجاهل طاف الأيسوبروبانول باستخدام ماصة والهواء الجاف بيليه DNA. الجاف مرة واحدة، resuspend الكرية في العقيمة العازلة 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0.
      3. إعداد محلول المخزون من 220 ملي فالبوريك (VPA) الحمض الموجود في المياه وتعقيم قبل المرور عبر العقيمة 0.22 ميكرون التصفية. تخزين الحل في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

    3. إنشاء ترنسفكأيشن عابر

    1. ترنسفكأيشن (يوم 0)
      1. تحقق من كثافة الخلايا باتباع الخطوات 1.2.2 خلال 1.2.5 من "1.2. الصيانة خلية" أعلاه. تحديد كمية الخلايا لترنسفكأيشن (2،5-3،0 × 10 6 الحية خلية / مل مع بقاء> 95٪). رؤية الحساب عينة في المواد التكميلية.
      2. نقل حجم الخلايا الثقافة تعليق المحسوبة في الخطوة السابقة (هنا 67 مل) إلى أنبوب الطرد المركزي 250 مل باستخدام ماصة المصلية العقيمة. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 100 ز س.
      3. في هذه الأثناء، وإعداد مستنبت ترنسفكأيشن جديدة بعد خطوة 1.1.3 وفقا ل "1.1. تلقيح الثقافة" أعلاه. انظر المواد التكميلية لحساب العينة. أيضا، ونقل 5 مل من مستنبت الطازجة إلى أنبوب معقم 15 مل وتوضع جانبا.
      4. أنابيب نقل تحتوي على خلايا مكعبات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية بعد تعقيم السطح الخارجي للأنابيب مع الايثانول 70٪ في محلول من المياه واستخدام ماصة معقمة لصب عشرطاف ه تتألف من قضى مستنبت.
      5. بقوة resuspend الخلايا مكعبات من قبل pipetting صعودا وهبوطا باستخدام 10 مل من مستنبت الطازجة ونقل إلى قارورة مع الطازجة مستنبت ترنسفكأيشن (المعد في خطوة 3.1.3 أعلاه). المسمار الغطاء على تنفيس قارورة زراعة الخلايا ونقل قارورة إلى الحاضنة (كما هو مبين في 1.1.1) لمدة 15 دقيقة، 1 ساعة مع اهتزاز.
      6. خلال هذا الوقت، ويخفف من DNA البلازميد والأسهم PEI باستخدام مستنبت الطازجة (باستخدام حجم 5 مل سحب من الخطوة 3.1.3 أعلاه) لتركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر. رؤية الحسابات عينة في المواد التكميلية لتحديد كمية الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد. نقل قارورة الثقافة مع الخلايا تنتشر في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
      7. إضافة DNA البلازميد (300 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى الثقافة باستخدام ماصة صغيرة وتخلط بواسطة طيف الهز اليدوي. إضافة PEI (900 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) للثقافة، مزيج من قبل يهز بلطف. إضافة 3.8 مل من طريق مسدود جديدةالبنية المتوسطة، من الخطوة 3.1.3، أعلاه ونقل قارورة لشاكر الحاضنة لمدة 24 ساعة.
      8. تنظيف الوزراء للسلامة الأحيائية وفقا للخطوة 1.1.
    2. التخفيف (يوم 1) (للاطلاع على حجم ترنسفكأيشن 50 مل)
      1. احتضان الثقافة transfected لمدة 24 ساعة.
      2. سحب 1 مل من prewarmed 220 حمض فالبرويك ملي (VPA، أعدت وفقا إلى الخطوة 2.2.3.) باستخدام معقمة 1 مل ماصة المصلية وتحويلها إلى أنبوب معقم 50 مل.
      3. سحب 5.0 مل من prewarmed المتوسطة B و 44 مل من prewarmed المتوسطة A وهذا إضافة إلى الحل VPA باستخدام ماصة المصلية العقيمة لإعداد 50 مل من مستنبت الطازجة مع تركيز النهائي من 4.4 ملم من VPA.
      4. نقل ثقافة transfected في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية بعد تعقيم الخارج من القارورة مع الايثانول 70٪ في المحلول المائي، إضافة المتوسطة تخفيف استعداد ونقل القارورة إلى شاكر المحتضنة.
    3. التعبير والحصاد (أيام 2-6)
      1. احتضان الخلايا ل4-5 أيام إضافية (5-6 أيام الإجمالي منذ ترنسفكأيشن).
      2. سحب aliquots من مستنبت التالية خطوة 1.2.2. إلى 1.2.5. هو موضح في "1.2. صيانة الخليوي،" أعلاه باستخدام معقم 1 مل ماصة المصلية، لرصد الخلايا الحيوية وحفظ قسامات لتحليل البروتين التعبير في كل يوم SDS-PAGE (انظر القسم 5 أدناه).
      3. حصاد الخلايا بعد 5-6 أيام من قبل الطرد المركزي الخلايا بالإضافة إلى متوسطة في 1000 ز لمدة 5 دقائق. بالإضافة إلى ذلك، حصاد طاف إذا وقعت على بقاء الخلية أقل من 50٪ (انظر الخطوات 1.2.2-1.2.5).
      4. تخلصي من طاف التي سوف تحتوي على بروتين يفرز. إضافة 5 مل من التبييض 10٪ لبيليه خلية كلوة وتجاهل باعتباره اقية.

    4. تنقية البروتين

    1. إعداد عمود مع 5 مل من البروتين-A sepharose و. تتوازن العمود مع 5 مجلدات عمود من العازلة ألف (20 ملم من 3- (N-morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف)، ودرجة الحموضة 7.4، 100 مم بريدال).
    2. أجهزة الطرد المركزي طاف جمعها مع البروتين أعرب بسرعة عالية (14،000 ز لمدة 10 دقيقة) لإزالة أي حطام الخلايا المتبقية. جمع من قبل الصب في أنبوب جديد. تجاهل بيليه باعتباره اقية.
    3. جمع قسامة 10 ميكرولتر من طاف وبالإضافة إلى ذلك جمع عينة صغيرة في كل خطوة تنقية البروتين لتحليل عينة من SDS-PAGE (الموصوفة في القسم 5). تحميل طاف أوضح وجمع التدفق من خلال.
    4. غسل العمود مع أحجام 3 عمود من العازلة ألف وأزل البروتين مع وحدات التخزين 5-عمود من 100 ملي الجلايسين، ودرجة الحموضة 3.0. جمع شطافة في أنابيب تحتوي على حجم نصف 1 M تريس العازلة، ودرجة الحموضة من 8.0 إلى تحييد بسرعة الرقم الهيدروجيني.
    5. غسل العمود مع 10 مجلدات عمود من العازلة ألف وتخزينها لاستخدامها في المستقبل.
    6. عازلة تبادل بروتين مزال مع ما لا يقل عن تتجاوز 10 أضعاف من العازلة A باستخدام 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع المرشحات الطرد المركزي. ملاحظة: لا التركيز على عينة من مزال لحجم منخفض جدا (<2 مل) في المخزن المؤقت مزال. استخدام الفلاتر الطرد المركزي لتبادل المخزن المؤقت مع العازلة A.
    7. متجر البروتين النقي في 4 درجات مئوية حتى استخدام المقبل.
      ملاحظة: البروتين وأعربت في طاف يمكن تنقيته بواسطة الأعمدة تقارب اختيارهم على أساس خصائص البروتين أو استخدام علامات تقارب. لإجراء تنقية نموذجي، البروتين ويمكن استخدام عمود للمفتش أو التيسير شظايا أو عمود النيكل يمكن استخدامها للبروتينات وأعرب مع علامة بولي الحامض الاميني. هنا، هو وصف للخطوات تنقية IgG1-FC باستخدام بروتين عمود.

    5. تحليل البروتين بواسطة SDS-PAGE

    1. تمييع قسامات (7.5 ميكرولتر) من كل عينة مع حجم مساو من 2X العازلة تحميل (0.125 M تريس، ودرجة الحموضة 8.0 و 4٪ SDS، 10٪ β المركابتويثانول، و 20٪ الجلسرين، و 0.01٪ برموفينول الأزرق).
    2. يغلي الخليط عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق باستخدام كتلة الحرارة أو حمام الماء. الطرد المركزي العينات في 10000 ز FOص 1 دقيقة. تحميل هلام استعداد مع 5 ميكرولتر من البروتين علامة و 14 ميكرولتر من العينات للتحاليل باستخدام ماصة 20 ميكرولتر مع طرف المتاح.
    3. تشغيل جل واحدة في 25 مل أمبير لمدة 60 دقيقة. مرة واحدة الخطوة الكهربائي كاملة، نقل هلام إلى حاوية مع 1 لتر من الماء والميكروويف لمدة 5 دقائق.
    4. وصمة عار الجل مع الحل تلطيخ (40٪ من الإيثانول، حمض الخليك 10٪ و 0.1٪ coomassie الأزرق اللامع) لمدة 2 ساعة ويزيل اللون في الماء.

    6. تحليل Glycans التي كتبها الطيف الكتلي

    1. تحليل glycans كما هو موضح سابقا 44. لفترة وجيزة، تم trypsinized 75 ميكروغرام من IgG1-FC، ثم يعامل من قبل PNGaseF للإفراج عن glycans 45. تم permethylated glycans صدر وتحليلها باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين الوقت من الطيران مطياف الكتلة (MALDI-TOFMS).

    7. تعديلات بروتوكول السيناريوهات الخاصة

    1. وسم البروتينات مع 15 N-وصفت الأحماض الأمينية (لحجم ترنسفكأيشن 50 مل)
      1. الاستغناء عن 5 ملغ من كل الأحماض الأمينية في عملية واحدة قارورة زجاجية معقمة. و resuspend مع 4 مل تعقيمها الماء (لاحظ صور لا إذابة تماما، على عكس اليس والفنيل ألانين). تعقيم الحل عن طريق التعقيم في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. السماح للحل لتبريد تقريبا 50-60 ° C.
      2. لحجم ترنسفكأيشن 50 مل، اتبع الخطوة 3.1.3 وفقا ل "3.1 إنشاء ترنسفكأيشن عابرة". راجع قسم المواد التكميلية للحصول على مثال مع وحدات التخزين المناسبة.
      3. لترنسفكأيشن، اتبع الخطوات من "3. إنشاء ترنسفكأيشن عابرة" باستخدام مستنبت الطازجة استبداله مع المسمى الأمينية بقايا حمض كما أعدت أعلاه.
      4. بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن، في يوم الثقافة التخفيف، وسحب 5.0 مل من prewarmed المتوسطة B، 40 مل من prewarmed المتوسطة ألف وتعقيمها طازجة 4 مل قسامة من مزيج من الأحماض الأمينية (المعدة كما في الخطوة 7.1.1 أعلاه) وإضافة 1مل prewarmed حل سهم الحل VPA لإعداد 50 مل من الطازجة مستنبت التخفيف مع تركيز النهائي من 4.4 ملم من VPA. إضافة هذه الوسيلة للثقافة ترنسفكأيشن باستخدام ماصة المصلية العقيمة.
      5. نقل ثقافة transfected في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية بعد تعقيم الخارج من القارورة مع الايثانول 70٪ في المحلول المائي، إضافة المتوسطة تخفيف استعداد ونقل القارورة إلى شاكر المحتضنة.
        ملاحظة: متوسط ​​(أ) هو، خالية من مصل المتوسطة محددة كيميائيا. وبالتالي، فمن الممكن لإعداد صياغة مختلفة. الاتصال المورد للحصول على مخصص المتوسطة وإعداد تفتقر إلى بعض الأحماض الأمينية. فمن الممكن أن يكون تركت جميع الأحماض الأمينية، مع ذلك، نحن نفضل استخدام المتوسطة التي تفتقر فقط قلة مختارة مخلفات لأن المتوسطة التسرب الكامل يتطلب تعديل الأسمولية بعد مكملات. اخترنا التسرب المتوسطة اليس-صور-الفنيل ألانين التي يمكن أن تستكمل و لا يتطلب تعديل الأسمولية. فوrthermore والمتوسطة وهناك مورد لا تشارك تركيزات المكونات المتوسطة بحرية. استخدمنا 100 ملغم / لتر كل لاليس، صور والفنيل ألانين بالنجاح. يجب أن يتم ضبط كميات من ترنسفكأيشن والتعبير المتوسطة لحساب الأحماض الأمينية المضافة. وهنا هي تعديلات على البروتوكول أعلاه لوضع العلامات النظائر
    2. تكملة ترنسفكأيشن مع جزيء صغير
      1. إعداد 100 ملي حل الأوراق المالية من 2-ديوكسي-2-الفلوري-L-فوكوسي استخدام المياه وتعقيمها وتعقيم هذا الحل باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر.
      2. من أجل ثقافة 50 مل، إضافة 125 ميكرولتر (250 ميكرومتر) من الحل فوكوسي التناظرية إلى ترنسفكأيشن وتخفيف وسائل الإعلام. ملاحظة: نحن المهملة لإجراء أي تعديل حجم آخر بسبب إضافة المستبدلة في هذه الحسابات تركيز٪ فقط 0،25 من إجمالي حجم الثقافة. انها غير ممكنة لتعديل التعبير باستخدام مثبطات جزيء صغير من معالجة غليكان. نحن هنا وصف شروط بما في ذلك 2-ديوكسي2-الفلوري-L-فوكوسي، مثبط لfucosylation غليكان. وجدنا> تخفيض 90٪ في fucosylation بإضافة فوكوسي التناظرية بتركيز 250 ميكرومتر في ترنسفكأيشن وتخفيف وسائل الإعلام.

النتائج

تعبير البروتين رفيع المستوى والنقاء

هذا النظام التعبير الأمثل ولدت عالية الغلة من البروتينات الغليكوزيلاتي. ويرد النمط المعتاد في التعبير عن IgG1-FC (الشكل 1). في هذه الحالة، يوم 0 هو اليو...

Discussion

يوضح هذا البروتوكول البروتين التعبير عبر ترنسفكأيشن عابرة من الخلايا HEK293F أو S. شروط ترنسفكأيشن المثلى التي أنشئت في اذع والوفل مختبرات توظف مزيجا ينتقد تركيز كثافة الخلايا وكاشف لتحقيق عالية الكفاءة ترنسفكأيشن. الاعتبارات الهامة عند تنفيذ هذا البروتوكول ما يلي: ال?...

Disclosures

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل ماليا من المنح K22AI099165 (AWB)، P41GM103390 (KWM) وP01GM107012 (KWM) من المعاهد الوطنية للصحة، وبأموال من روي J. زارة كارفر الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة ولاية ايوا . مضمون هذا العمل هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للالمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinet NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shakerINFORS HTMultitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium Life Technologies12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium SIGMA14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10B
10 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10J
25 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blue Solution Thermo Scientific SV30084.01
Counting slides Bio-Rad145-0011
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc.23966Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μMFisher Scietific09-719A
Trisaminomethane (Tris base)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
Yeast extractFluka Analytical 92144
Sodium chlorideBDH chemicalsBDH8014
Plasmid Purification KitQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
CentrifugeThermo Scientific EW-17707-65
Protein A-Sepharose columnSIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycineFisher ScietificBP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters MilliporeUFC901096
Sodium dodecyl sulfateALDRICHL3771
Beta-mercaptoethanolALDRICHM6250
GlycerolSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Acetic Acid, Glacial Fisher Scietific64-19-7
coomassie brilliant blue Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N labeled L-TyrosineALDRICH332151
15N labeled L-LysineALDRICH592900
Unlabeled L-PhenylalanineSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-GlucoseALDRICH389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose SANTA CRUZ Biotechnologysc-283123

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Erratum


Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106 G FC HEK293F HEK293S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved