JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Abstract

האמנות של ייצור חלבונים רקומביננטיים עם לאחר translational שינויים מורכבים מהווה אתגר גדול ללימודים של מבנה ותפקוד. ההקמה המהירה וגבוהה התאוששות משורות תאי יונקים זמני-transfected מטפל המחסום הזה והוא אמצעי יעיל לביטוי חלבונים שמופנים דרך חדר המיון ומסלול הפרשה בתיווך Golgi באופן טבעי. הנה פרוטוקול אחד לביטוי חלבון באמצעות HEK293F האדם ושורות תאי HEK293S transfected עם וקטור ביטוי יונקים מיועדים לתשואות גבוהות של חלבון. תחולתה של מערכת זו באה לידי ביטוי בשלושת גליקופרוטאינים הנציג שבאו לידי ביטוי בתשואות בין 95-120 מ"ג של חלבון מטוהר התאושש לליטר התרבות. חלבונים אלה הם FcγRIIIa האנושי וsialyltransferase העכברוש α2-6, ST6GalI, שני הביע עם פיוז'ן GFP N-מסוף, כמו גם אימונוגלובולינים אדם ללא שינוי G1 Fc. UTI מערכת חזק זהlizes בינוני סרום ללא שניתן להתאמה לביטוי של חלבונים ופחמימות ללימודים מבניים באמצעות ספקטרומטר המסה וספקטרוסקופיה בתהודה המגנטית הגרעינית מועשרים isotopically. יתר על כן, הרכב של N-הסוכרים יכול להיות מכוון על ידי הוספת מולקולה קטנה כדי למנוע שינויי סוכרים מסוימים באופן שאינו מפחית תשואה.

Introduction

הפקת תשואות גבוהות של חלבונים אנושיים כראוי מקופלים ופוסט-translationally שונה לניתוח מפורט של מבנה ותפקוד עדיין מהווה אתגר משמעותי. מספר גדול של מערכות ביטוי זמין המייצרים חלבונים רקומביננטי עם פונקציה והתנהגות כמו-ילידים. מערכות חיידקי ביטוי, בעיקר זני Escherichia coli, מייצגים את הכלים הנגישים ביותר ונפוצים בזירת המחקר, בשל הפשטות של מערכות ביטוי אלה, אם כי שמרים, מפעל, חרקים ומערכות יונקים הן גם תיארו 1-4. עם זאת, הרוב המכריע של מערכות אלה אינם מסוגלים שינוי לאחר translational המתאים של חלבוני היעד. ריבית בסיסית של המעבדות בארב וMoremen מייצרת חלבוני אוקריוטים עם glycosylation המתאימה. חלבונים אנושיים רבים דורשים glycosylation המתאימה לתפקוד תקין (ראה 5).

אוקריוטיםמכונות glycosylation היא נרחבות ומסוגלות לבצע מגוון רחב של שינויים, כולל שני asparagine (N) - וסרין / תראונין (O) -linked glycans המורכב 6. ההערכה היא כי> 50% מחלבונים אנושיים הם N glycosylated-7. Glycans הם מרכיבים חיוניים של חלבונים רבים, כולל נוגדנים חד שבטיים טיפוליים, אריתרופויאטין, וגורמי קרישת דם כמו התשיעי גורם, עד כמה שם. למרות מספר שיטות קיימות להכנת חלבונים כראוי N-מסוכרים ונעות בין טהור סינטטי 8-10, לchemoenzymatic 11-14 או התאוששות ממערכות מהונדסות רקומביננטי 15-20, שלא במפתיע, מערכות ביטוי אנושיות עד כה הוכיחו להיות חזק ביותר שיטות ליצירת חלבונים אנושיים.

גליקופרוטאינים אדם טיפוליים רבים מיוצרים במערכות רקומביננטי באמצעות תאי יונקים. מערכות של לב הם השחלות סיניות (CHO), מיאלומה עכבר (NS0), בייבי אוגר Kidney (BHK), כליה העוברית אנושי (HEK-293) ושורות תאים ברשתית אנושיות שמועסקות בתרבות הידבקות או השעיה לייצור חלבון 4,21,22. עם זאת, מערכות ביטוי חלבון יונקים נדרשו הדור של קווים יציבים תא, תקשורת צמיחה יקרה ונהלי transfection מצע סייע 23.

transfection תאים היונקים מושגת בעזרת סוכנים רבים כוללים פוספטים סידן 24,25, פולימרים קטיוני (DEAE-dextran, polybrene, polylysine, polyethylimine (PEI)) או ליפוזומים קטיוני טעונים חיובי 26-29. PEI הוא polycationic, טעון, ליניארי או פולימר מסועף (25 KDA) 26 שיוצר מורכב יציב עם DNA והוא endocytosed. על החמצה של אנדוזום, הוא חשב PEI להתנפח, שהוביל לקרע של endosomes ושחרורו של ה- DNA לתוך 26,30 ציטופלסמה.

עד לאחרונה, transfection חולף בsuspensiעל התרבות בוצע על ידי היווצרות מורכבת לפני DNA / PEI אחרי בנוסף לתרבית תאי 29. עם זאת, וורם ועמיתים לעבודה דיווחו פרוטוקול יעיל ביותר מותאם לייצור חלבון רקומביננטי בHEK293 תאים שיצרו מורכב DNA / PEI באתר 31,32. זה נמנע הכנה, עיקור של המתחם, וחילופי חיץ למדיום תרבות. אופטימיזציה נוספת על ידי כולל פלסמידים שיפור ביטוי הובילו לעליית תשואה משמעותית 33. מסמך זה הוא שיטה שמתבססת על התפתחויות הללו והיא באופן כללי החלים. תנאי ביטוי גם עשויים להשתנות להשפיע על הרכב N-סוכרים.

קו HEK293S התא, עם מחיקת גן שעוצרת עיבוד N-סוכרים בשלב ביניים, מוביל לביטוי של חלבונים עם המדים N-glycans בהיקף של 2 שאריות N-acetylglucosamine ועוד חמש שאריות מנוז (איש 5 GlcNAc 2) 34, 35. תאים אלהחסר transferase N-acetylglucosaminyl אני (GntI) גן אשר נדרש לעיבוד N-סוכרים במורד הזרם 36,37. השימוש במעכבי glycosyltransferase כוללים kifunensine, תחליפי חומצת sialic והאנלוגי fucose ו2-deoxy-2-fluoro-fucose יש השפעות וגבולות עיבוד N-38-41 סוכרים דומים.

הפרוטוקול דיווח כאן משתמש בוקטור pGEn2 כפי שמוצג באיור 1 42,43, PEI transfection סייע החולף לקווי יונקים תאים (HEK293F או תאי HEK293S), וההתאוששות של תשואות גבוהות של חלבון glycosylated כראוי. מערכת זו היא חזקה ויכולה להכיל גורמים שונים, כוללים תיוג איזוטופ והנדסת סוכרים לייצור titers הגדול של חלבונים רקומביננטי.

Protocol

פרוטוקול זה מספיק לביטוי או באמצעות HEK293F או תאי HEK293S.

1. תא הקמת

  1. תרבות חיסון
    הערה: כל נהלי המניפולציה התרבות חייבים להתבצע במתקן BSL-2 וכל פריט הביא לתוך ארון הבטיחות הביולוגית חייבים להיות מעוקר על ידי ריסוס עם אתנול 70% בפתרון מים.
    1. פועל שייקר אינקובטור ב 135 סל"ד, לחות 80%, ובשיעור של 8.0% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. הפעל "על" מנורת UV של ארון הבטיחות הביולוגית שעות לפחות 1 לפני העבודה. Prewarm הבקבוקים בינוניים ובינוני ב 'החתומים במי האמבטיה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. לעקר 125 מיליליטר צלוחיות צמיחת Erlenmeyer עם כובע פרק, טפטפות, pipettors, ובקבוקי מדיה prewarmed על ידי ריסוס עם אתנול 70% בפתרון מים. הנח פריטים אלה בממשלת הבטיחות הביולוגית. הערה: לעקר את הפלסטיק החיצוני רק מכסה את בקבוק תרבות Erlenmeyer 125 מיליליטר, ולאחר מכן להסיר רק כאשר זה אניים בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
    3. לתרבות 30 מיליליטר, 26 מיליליטר של לסגת בינוני ו -3 מיליליטר של המדיום B (10% מהתרבות הסופית) ולהעביר לתוך בקבוק תרבות Erlenmeyer 125 מיליליטר ולערבב בעדינות על ידי טלטול (להלן נקרא כמו מדיום תרבות טרי).
    4. בקבוקון אחד העברה של תאים המכילים תאי HEK293F, קפוא ב -80 ° C, על קרח ולעבור לחדר התרבות. הערה: תאי HEK293F מסופקים בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מיליליטר.
    5. לחמם את הבקבוקון בעדינות במי אמבטיה על 37 מעלות צלזיוס להפשיר באופן חלקי התאים (זה לוקח בערך אחד דק ותאים לא צריכים להיות מופשרים לחלוטין). לעקר מחוץ לבקבוקון עם אתנול 70% בפתרון מים ולהעביר אותו לתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
    6. באמצעות פיפטה 1 מיליליטר, למשוך את ההשעיה התא (כ 0.7 מיליליטר) ולהעביר לבקבוק 125 מיליליטר Erlenmeyer המכיל 29 מיליליטר של מדיום תרבות הטרי. סגור את המכסה של בקבוק התרבות ולהעביר אותו לייקר מודגרות.
  2. תחזוקה נייד: בדוק צפיפות תאים, הכדאיות ומעברים סלולריים
    1. בדוק את צפיפות התאים לאחר 24 שעות של הפשרה של התרבות על ידי ביצוע הפרוטוקול להלן. הערה: תאים גדלים במשך 24 שעות לאחר ההפשרה כדי להבטיח צמיחת תאים חיוניים וכדאיות של> 80%.
    2. לעקר את בקבוק התרבות עם אתנול 70% בפתרון מים ולהעביר אותו לתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
    3. בעזרת פיפטה 1 מיליליטר וpipettor, לסגת באיטיות של תרבות השעיה והעברה 100 μl לתוך צינור 0.5 מיליליטר סטרילי Eppendorf. לסגור ולהעביר את בקבוק התרבות חזרה לייקר בהקדם האפשרי.
    4. מערבבים 7.5 μl של Trypan כחול פתרון עם 7.5 μl של תאים. מערבבים נמרצות עם 7.5 μl של התא / תערובת trypan הכחולה ולהעביר אותו לשקופית הספירה.
    5. הפעל את דלפק התא האוטומטי ובמקום להחליק ספירה לתוך תא הטעינה. רכב הקורא מופעל ותאים נספרים באופן אוטומטי ביחידותשל מספר תאים לכל כדאיות מיליליטר ואחוזים
    6. לקבוע את עוצמת הקול של תרבות התורם נדרשת להעברה למדיום תרבות טרי בצפיפות התאים של 0.3 x 10 6 תאים / מיליליטר בשידור חי.
      הערה: ראה חישוב מדגם בחומרים משלימים.
    7. חזרו על שלבי 1.1.2 ו1.1.3 של הפרוטוקול "1.1 תרבות החיסון" לעיל כדי להכין את החומרים הנדרשים למדיום תרבות טרי.
    8. העבר בינוני (23 מיליליטר) ובינוני ב '(3 מיליליטר) בבקבוק 125 מיליליטר תרבות טרי. הסר את מניית בקבוקים בינוניים ובינוני ב 'מארון הבטיחות הביולוגית.
      הערה: מניות של בקבוקי תקשורת לא צריכים להיות כל הזמן בקבינט הבטיחות הביולוגית באותו הזמן כמו תאי HEK 293F. זה מגביל את האפשרות של זיהום הבקבוקים בינוני המניה.
    9. הסר את תרבות תאי HEK293 מהחממה ולרסס עם אתנול 70% בפתרון מים. בעזרת פיפטה חדשה, לסגת aliquot של תאים (4 מיליליטר, נפח זה נקבע לא על פיצעד o 1.2.6) מהתרבות ולהעביר אותו לבקבוק המכיל מדיום תרבות טרי.
    10. העבר את שני התרבויות מארון הבטיחות הביולוגית לייקרה החממה נקבע לפי 1.1.1. לגדל תאים לצפיפות משוערת של 2-3 x 10 6 תאים / מיליליטר בשידור חי.
      הערה: זמן ההכפלה המשוער של תאים הוא 32 שעות. זה ייקח 3-4 ימים להגיע לצפיפות זו. דגירה התאים במשך 3-4 קטעים שיש דפוס צמיחה יציב של תאים לפני transfection הראשון.

2. להכין חומרים לTransfection

  1. הכנת תאי HEK293 (יום 1)
    1. תאים תת-תרבות לצפיפות של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר בשעות בינוני B 24 טריות לפני transfection לפי שלב 1.2.
      הערה: הנפח של תרבות transfection יהיה תלוי במספר התאים. כרכי transfection הגדול (> 20 מיליליטר) ידרשו נפח גדול יותר של תרבות בשלב זה.
  2. הכנת Stעדרים של חומרים
    1. הכן פתרון מניות של Polyethylenimine ליניארי (PEI) בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר במאגר המכיל 25 מ"מ 4 חומצת -1-piperazineethanesulfonic (2-hydroxyethyl) (HEPES) ו -150 מ"מ NaCl (pH 7.5). ממיסים PEI לחלוטין; זה עלול לקחת 30-60 דקות ב RT. לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב -20 ° C לשימוש לטווח ארוך.
    2. הכן את ה- DNA פלסמיד סטרילי (על פי צעדים 2.2.2.1-2.2.2.4). הליך בניית פלסמיד מתואר במקומות אחרים 42. הליך קצר להכנת DNA מוסבר כאן:
      1. לגדול תרבות של תאי coli כימיים-המוסמכים Escherichia הפכו עם וקטור pGEn2 בL 1 של מדיום LB (Tryptone- 10 גרם / L, שמרי extract- 5 גר '/ ל' וchloride- נתרן 10 גר '/ ל') בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. א coli הוא גדל ב 37 מעלות צלזיוס בחממה אינה humidified, רועדת.
      2. לטהר את ה- DNA פלסמיד יעד קידוד וקטור pGEn2 לפי Manuפרוטוקול טיהור DNA של facturer.
      3. כדי להבטיח סטריליות של פלסמיד דנ"א מלא, בצע את שלבי המשקעים isopropanol וresuspension הסופיים של הליכי מיצוי DNA בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
      4. הוסף את נפח isopropanol (שצוין בערכת הכנת פלסמיד) ל- DNA eluted וצנטריפוגות ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות. לעקר מחוץ למכל DNA עם 70% אתנול בפתרון מים ולהעביר אותו בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. בטל supernatant isopropanol בעזרת פיפטה ואוויר יבש גלולה DNA. לאחר יבש, resuspend גלולה במאגר 10 מ"מ טריס סטרילי, pH 8.0.
    3. הכן פתרון מניות של 220 מ"מ ולפרואית חומצה (VPA) במים ולעקר על ידי מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר סטרילי. אחסן את הפתרון ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.

3. הקמת Transfection חלוף

  1. Transfection (יום 0)
    1. בדוק את צפיפות תאים על ידי ביצוע צעדים 1.2.2 דרך 1.2.5 של "1.2. תחזוקה נייד" לעיל. לקבוע את כמות התאים לtransfection (2.5-3.0 x 10 6 תאים / מיליליטר בשידור חי עם הכדאיות> 95%). ראה חישוב מדגם בחומרים משלימים.
    2. העבר את הנפח של תאי תרבות השעיה מחושבים בשלב הקודם (כאן 67 מיליליטר) לצינור צנטריפוגות 250 מיליליטר בעזרת פיפטה סרולוגיות סטרילי. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 100 x גרם.
    3. בינתיים, להכין מדיום תרבות transfection טרי הבא צעד 1.1.3 על פי "1.1. תרבות חיסון" לעיל. ראה חומרים נוספים לחישוב מדגם. כמו כן, העברה 5 מיליליטר של מדיום תרבות הטרי לצינור 15 מיליליטר סטרילי ומניח בצד.
    4. צינורות העברה המכילים את תאי pelleted לתוך ארון הבטיחות הביולוגית לאחר החיטוי החיצוני של הצינורות עם אתנול 70% בפתרון מים ולהשתמש פיפטה סטרילית ללמזוג הsupernatant דואר בהיקף של מדיום התרבות בילה.
    5. במרץ resuspend תאי pelleted ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות 10 מיליליטר של מדיום תרבות הטרי והעברה לבקבוק עם מדיום תרבות transfection טרי (מוכן בשלב 3.1.3 לעיל). לדפוק את הכובע על בקבוק תרבות התא פרק ולהעביר את הבקבוק לחממה (כמפורט ב1.1.1) במשך 15 שעות דקות-1 עם רעד.
    6. במהלך תקופה זו, לדלל את ה- DNA פלסמיד ומניות PEI באמצעות מדיום תרבות טרי (באמצעות 5 מיליליטר נסוג מהצעד 3.1.3 לעיל הנפח) לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / μl. ראה חישובי מדגם בחומרים משלימים כדי לקבוע את כמות ה- DNA וPEI. העבר את בקבוק התרבות עם התאים המפוזרים לתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
    7. להוסיף פלסמיד דנ"א (300 μl של 0.5 מיקרוגרם / μl) לתרבות באמצעות מיקרו-פיפטה ומערבבים על ידי טלטול ידני עדין. להוסיף PEI (900 μl של 0.5 מיקרוגרם / μl) לתרבות, לערבב בעדינות על ידי רועד. להוסיף 3.8 מיליליטר של רחוב ללא טריבינוני ture, מצעד 3.1.3, לעיל ובקבוק העברה לייקר החממה למשך 24 שעות.
    8. נקה את ארון הבטיחות הביולוגית על פי שלב 1.1.
  2. דילול (יום 1) (ל50 מיליליטר transfection נפח)
    1. דגירה תרבות transfected למשך 24 שעות.
    2. לסגת 1 מיליליטר של prewarmed 220 מ"מ לפרואית חומצה (VPA; הוכן בהתאם לצעד 2.2.3.) בעזרת פיפטה סרולוגיות 1 מיליליטר סטרילי ולהעביר אותו לצינור 50 מיליליטר סטרילי.
    3. לסגת 5.0 מיליליטר של מדיום B prewarmed ו -44 מיליליטר של מדיום prewarmed ולהוסיף את זה לפתרון VPA בעזרת פיפטה סרולוגיות סטרילי כדי להכין 50 מיליליטר של מדיום תרבות הטרי עם ריכוז סופי של 4.4 מ"מ של VPA.
    4. הזז את תרבות transfected לתוך ארון הבטיחות הביולוגית לאחר החיטוי החיצוני של הבקבוק עם אתנול 70% בפתרון מים, להוסיף בינוני דילול מוכן ולהעביר את הבקבוק חזרה לייקרתי מודגרות.
  3. ביטוי והקציר (הימים 2-6)
    1. דגירה התאים עבור 4-5 ימים נוספים (5-6 ימים יסתכמו מאז transfection).
    2. לסגת aliquots של מדיום התרבות הבא צעד 1.2.2. ל1.2.5. תאר ב" 1.2. תחזוקת תא, "מעל בעזרת פיפטה סרולוגיות 1 מיליליטר סטרילי, כדי לפקח על כדאיות תאים ולשמור aliquots לנתח ביטוי חלבון בכל יום על ידי SDS-עמוד (ראה סעיף 5, להלן).
    3. קציר תאים לאחר 5-6 ימים על ידי צנטריפוגה התאים בתוספת בינונית ב 1000 גרם במשך 5 דקות. בנוסף, לקצור את supernatant אם כדאיות התא נופלת מתחת ל -50% (ראה צעדים 1.2.2-1.2.5).
    4. יוצקים את supernatant שיכיל חלבון מופרש. הוסף 5 מיליליטר של אקונומיקה 10% לתא גלולה HEK וזורקים כBiohazard.

טיהור 4. חלבון

  1. הכן עמודה עם 5 מיליליטר של sepharose חלבון-. לאזן את העמודה עם 5 כרכי עמודה של חיץ (20 מ"מ של 3 (N-morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים), pH 7.4, 100 מ"מ NACיב).
  2. צנטריפוגה supernatant נאסף עם חלבון הביע במהירות גבוהה (14,000 גרם במשך 10 דקות) כדי להסיר כל פסולת תא שנותרה. לאסוף באמצעות אחסון לתוך צינור טרי. זורק את הכדור כמו Biohazard.
  3. לאסוף aliquot 10 μl של supernatant ובנוסף לאסוף דגימה קטנה בכל שלב טיהור החלבון לנתח את המדגם על ידי SDS-עמוד (שתואר בסעיף 5). טען את supernatant הבהיר ולאסוף את הזרימה דרך.
  4. לשטוף את העמודה עם כרכי 3-טור של החיץ וelute החלבון עם כרכי 5-טור של 100 מ"מ גליצין, pH 3.0. לאסוף את eluate בצינורות המכילים מחצית נפח של 1 חיץ M טריס, pH של 8.0 לנטרל את החומציות במהירות.
  5. לשטוף את העמודה עם 10 כרכי טור של חיץ וחנות לשימוש עתידי.
  6. מאגר להחליף חלבון eluted עם לפחות עודף של פי 10 של חיץ באמצעות 10 מסננים חתוכים משקל מולקולרי kDa צנטריפוגלי. הערה: אל תתרכז מדגם eluted לנפח נמוך מאוד (<2 מיליליטר) במאגר eluted. השתמש במסנני צנטריפוגלי להחליף החיץ עם א 'החיץ
  7. חנות מטוהרת חלבון על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש הבא.
    הערה: חלבון מתבטא בsupernatant יכול להיות מטוהר על ידי עמודות זיקה נבחרו על בסיס המאפיינים של החלבון או השימוש בתגי זיקה. להליך טיהור טיפוסי, חלבון טור יכול לשמש לברי IgG או FC או עמודת ניקל יכול לשמש לחלבונים הביעו עם תג פולי-היסטידין. כאן, הוא תיאור של השלבים לטיהור לIgG1-FC באמצעות חלבון טור.

5. ניתוח של חלבון על ידי SDS-עמוד

  1. לדלל את aliquots (7.5 μl) של כל דגימה עם נפח שווה של חיץ 2x טעינה (0.125 M טריס, pH 8.0, 4% SDS, 10% β-mercaptoethanol, גליצרול 20%, וbromophenol 0.01% כחולים).
  2. מרתיחים את התערובת על 90 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות באמצעות בלוק חום או אמבט מים. צנטריפוגה דגימות ב10,000 ז FOR 1 דקות. טען את הג'ל מוכן עם 5 μl חלבון סמן של 14 וμl דגימות עבור ניתוחים בעזרת פיפטה 20 μl עם קצה חד פעמי.
  3. הפעל ג'ל אחד ב 25 מילים-אמפר עבור 60 דקות. ברגע שצעד אלקטרופורזה הושלם, להעביר את הג'ל למכל עם 1 ליטר של מים ומיקרוגל במשך 5 דקות.
  4. כתם ג'ל עם פתרון מכתים (40% אתנול, 10% חומצה אצטית וכחול מבריקים Coomassie 0.1%) לשעה 2 וdestain במים.

6. ניתוח glycans ידי ספקטרומטריית מסה

  1. לנתח glycans כפי שתואר לעיל 44. בקצרה, 75 מיקרוגרם של IgG1-FC היה trypsinized, אז טופל על ידי PNGaseF לשחרורו של glycans 45. glycans שוחרר היה permethylated ונותח באמצעות ספקטרומטריית בסיוע מטריקס לייזר desorption יינון הזמן של בריחה ההמונית (MALDI-TOFMS).

7. התאמות פרוטוקול לתרחישים מיוחדים

  1. תיוג חלבונים עם 15 N-כותרת חומצות אמינו (ל50 מיליליטר transfection נפח)
    1. לוותר 5 מ"ג של כל חומצת אמינו לתוך בקבוקון זכוכית סטרילית יחיד. Resuspend עם 4 מיליליטר autoclaved מים (שים לב Tyr לא solubilize לחלוטין, בניגוד ליס וPhe). לעקר את הפתרון על ידי מעוקר ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אפשר הפתרון להתקרר כ 50-60 מעלות צלזיוס.
    2. ל50 מיליליטר transfection נפח, בצע את צעד 3.1.3 על פי "3.1 הקמת transfection חולף". עיין בסעיף חומרים נוספים לדוגמה עם כמויות מתאימות.
    3. עבור transfection, בצע את הפעולות של "3. הקמת transfection חולף" באמצעות מדיום תרבות הטרי הוחלף עם שאריות חומצת אמינו שכותרתו כפי שהוכן לעיל.
    4. לאחר 24 שעות של transfection, ביום דילול התרבות, לסגת 5.0 מיליליטר של מדיום B prewarmed, 40 מיליליטר של מדיום prewarmed ו4 מיליליטר aliquot טרי autoclaved של תערובת חומצת אמינו (שהוכנה כמו בשלב 7.1.1. לעיל) ולהוסיף 1מיליליטר prewarmed פתרון מניות של פתרון VPA להכין 50 מיליליטר של מדיום תרבות דילול טרי עם ריכוז סופי של 4.4 מ"מ של VPA. הוסף בינוני זה לתרבות transfection באמצעות פיפטה סרולוגיות סטרילי.
    5. העבר את תרבות transfected לתוך ארון הבטיחות הביולוגית לאחר החיטוי החיצוני של הבקבוק עם אתנול 70% בפתרון מים, להוסיף בינוני דילול מוכן ולהעביר את הבקבוק חזרה לייקרתי מודגרות.
      הערה: בינוני הוא מדיום הגדרה כימית, סרום ללא. לפיכך, אפשר להכין ניסוח שונה. צור הספק על מנת להשיג בינוני הכנה מותאמת אישית שחסרות חומצות אמינו מסוימות. אפשר לקבל את כל חומצות אמינו נשארו בחוץ, לעומת זאת, אנו מעדיפים להשתמש במדיום שחסר רק כמה שאריות בחרו משום בינוני נשירה מלאה ידרוש התאמה של osmolarity לאחר תוספים. בחרנו בינוני נשירת יס-Tyr-Phe שניתן להשלים ואינו דורש התאמת osmolarity. פוrthermore, בינוני ספק אינו חולק את הריכוזים של מרכיבים בינוניים בחופשיות; היינו 100 מ"ג / ליטר כל אחד ליס, Tyr וPhe בהצלחה. כרכים של מדיום transfection והביטוי חייבים להיות מותאמים לחשבון לחומצות אמינו, הוסיפו. הנה ההתאמות לפרוטוקול הנ"ל לתיוג איזוטופ
  2. להשלים את Transfection עם מולקולה קטנה
    1. הכן 100 מניות פתרון מ"מ של 2-deoxy-2-L-fucose fluoro-שימוש במי autoclaved ולעקר את הפתרון הזה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    2. לתרבות 50 מיליליטר, להוסיף 125 μl (ב 250 מיקרומטר) של הפתרון האנלוגי fucose לתקשורת transfection ודילול. הערה: אנו מוזנחים לבצע כל התאמת עוצמת קול נוספת, כי הוספת substituent בחשבונות הריכוז זה רק 0.25% בסך הכל .הוא תרבות הנפח אפשר לשנות את הביטוי באמצעות מעכבי מולקולה קטנים של עיבוד סוכרים. כאן אנו מתארים את התנאים לכוללים 2-deoxy-2-fluoro-L-fucose, מעכב של fucosylation סוכרים. מצאנו ירידה של 90%> בfucosylation ידי הוספה האנלוגית fucose בריכוז של 250 מיקרומטר בתקשורת transfection ודילול.

תוצאות

ביטוי חלבון ברמה גבוהה ובטהרה

מערכת מותאמת ביטוי זה נוצרה תשואה גבוהה של חלבונים מסוכרים. דפוס אופייני מוצג בביטוי של IgG1-FC (איור 1). במקרה זה, יום 0 הוא יום transfection אחרי יום 1 (דילול) וימים ?...

Discussion

פרוטוקול זה ממחיש ביטוי חלבון באמצעות transfection החולף של תאי HEK293F או S. התנאים אופטימליים transfection הוקמו במעבדות בארב וMoremen להעסיק שילוב קריטי של ריכוזי צפיפות תאים ומגיבים להשגת transfection יעילות הגבוהה. שיקולים קריטיים בעת יישום פרוטוקול זה כוללים: שמירה על תרבות יציבה לפני...

Disclosures

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המענקים K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) וP01GM107012 (KWM) מהמכון הלאומי לבריאות, ועל ידי קרנות מרוי ג 'המחלקה לביוכימיה קארבר, ביופיסיקה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת איווה סטייט . התוכן של עבודה זו הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinet NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shakerINFORS HTMultitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium Life Technologies12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium SIGMA14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10B
10 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10J
25 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blue Solution Thermo Scientific SV30084.01
Counting slides Bio-Rad145-0011
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc.23966Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μMFisher Scietific09-719A
Trisaminomethane (Tris base)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
Yeast extractFluka Analytical 92144
Sodium chlorideBDH chemicalsBDH8014
Plasmid Purification KitQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
CentrifugeThermo Scientific EW-17707-65
Protein A-Sepharose columnSIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycineFisher ScietificBP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters MilliporeUFC901096
Sodium dodecyl sulfateALDRICHL3771
Beta-mercaptoethanolALDRICHM6250
GlycerolSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Acetic Acid, Glacial Fisher Scietific64-19-7
coomassie brilliant blue Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N labeled L-TyrosineALDRICH332151
15N labeled L-LysineALDRICH592900
Unlabeled L-PhenylalanineSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-GlucoseALDRICH389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose SANTA CRUZ Biotechnologysc-283123

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Erratum


Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106GFCHEK293F HEK293S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved