JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Özet

Karmaşık post-translasyonel modifikasyonlar ile rekombinant proteinlerin üretilmesi teknolojisi yapı ve fonksiyon çalışmaları için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Geçici olarak transfekte memeli hücre dizilerinden hızla oluşturulması ve yüksek geri kazanım doğal ER ve Golgi dolayımlı salgılama yolundan kanalize proteinleri ifade için etkili bir vasıta, bu bariyer ele alan ve bir. Burada, insan HEK293F ve yüksek protein verimine için tasarlanmış bir memeli ifade vektörü ile transfekte edilmiş HEK293S hücre çizgileri kullanılarak protein ifadesi için tek bir protokoldür. Bu sistemin uygulanabilirliği kültürünün litresi başına geri kazanılan saflaştırılmış proteinin 95-120 mg arasında verimleri ile eksprese üç temsilci glikoproteinleri kullanılarak araştınlır. Bu proteinler, insan FcyRIIIA ve sıçan α2-6 sıyalıltransferaz, ST6GalI, hem bir N-terminal GFP füzyon ifade, hem de rekombinant insan immünoglobülin Fc G1 bulunmaktadır. Bu sağlam sistem utiizotopik olarak zenginleştirilmiş proteinler ve kütle spektrometrisi, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak yapı çalışmaları için de karbonhidrat ekspresyonu için uyarlanabilir bir serumsuz ortam lizes. Ayrıca, N-glıkan bileşimi verimi azaltır olmayan bir şekilde belirli bir glıkan değişiklikleri önlemek için küçük bir molekül eklenerek ayarlanabilir.

Giriş

Yapı ve fonksiyonunun ayrıntılı analizi için uygun katlanmış ve translasyon sonrası değiştirilmiş insan proteinlerinin yüksek verim üreten önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Ekspresyon sistemleri çok sayıda yerel benzeri fonksiyonu ve davranışı ile yeniden birleştirici proteinlerin üretmek mevcuttur. Maya, bitki, böcek ve memeli sistemleri, aynı zamanda 1-4 tarif olsa Bakteriyel ekspresyon sistemleri, esas olarak, Escherichia coli suşu, bağlı, bu sentezleme sistemlerinden basitliği, araştırma alanında en kolay ve yaygın olarak kullanılan araçlar temsil etmektedir. Bununla birlikte, bu sistemler büyük çoğunluğu hedef proteinlerin uygun post-translasyonel modifikasyon, Ulus. Barb ve Moremen laboratuvarlarının temel bir ilgi uygun glikosilasyona ile ökaryotik proteinleri üretiyor. Birçok insan proteinleri (5 bakınız) düzgün işlev için uygun glikozilasyonu gerektirir.

Ökaryotglikosilasyon makineleri yaygın ve her iki asparagin (N) de dahil olmak üzere, modifikasyon bir yelpazede yapma yeteneğine sahiptir - ve serin / treonin (O) kompleksi glikanları 6 -bağlı. İnsan proteinlerinin>% 50 7, N-glikosile olduğu tahmin edilmektedir. Glıkanlar birkaç isim faktör IX gibi terapötik monoklonal antikorlar, eritropoietin ve kan pıhtılaşma faktörleri gibi birçok proteinin temel bileşenleri vardır. Birden çok yöntem uygun N-glikosile proteinlerin hazırlamak için var ve 8-10 tamamen sentetik aralığı olsa da, en sağlam olması şaşırtıcı insan ifade sistemleri bugüne kadar kanıtlanmış değil mühendislik rekombinant sistemlerinden 15-20, 11-14 den veya kurtarma chemoenzymatic için insan proteinlerini üretmek için yöntemler.

Bir çok tedavi edici insan glikoproteinleri, memeli hücreleri kullanılarak yeniden birleştirici sistemlerde üretilmektedir. Not sistemleri Çin Hamster Yumurtalık (CHO), fare miyelom (ns0), bebek hamster Kidne olany (BHK), insan embriyonik böbrek (HEK-293), ve protein üretimi 4,21,22, yapıştırma veya süspansiyon kültürü içinde kullanıldığında insan retinal hücre çizgileri. Ancak, memeli protein ekspresyon sistemleri Kararlı hücre çizgileri, pahalı bir büyüme ortamı ve alt-tabaka destekli transfeksiyon prosedürleri 23 nesil gerektirmiştir.

Memeli hücre transfeksiyonu, kalsiyum fosfat 24,25, katiyonik polimerler (DEAE-dekstran, polibren, polilisin, polyethylimine (PEI)) ya da pozitif yüklü katyonik lipozomlar 26-29 dahil olmak üzere sayısız maddelerin yardımı ile elde edilmektedir. PEI, bir polikatyonik yüklü, doğrusal ya da DNA ile kararlı bir kompleks oluşturur ve endositoz dallı bir polimer (25 kDa) 26 dır. Endozomun asitleştirme üzerine, PEI sitoplazma 26,30 içine endozomlarda DNA salım yırtılmasına yol şişmeye düşünülmektedir.

Suspensi yakın zamana kadar, geçici transfeksiyonkültürü, hücre kültürü 29 ek olarak, ardından önceden DNA / PEI kompleks formasyon ile gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, Würm ve çalışma arkadaşları, in situ 31,32 bir DNA / PEI kompleks oluşturduğu HEK293 hücrelerinde rekombinant protein üretim için optimize edilmiş bir yüksek verimli bir protokol bildirilmiştir. Bu kültür ortamı içine hazırlanmasını, kompleks sterilizasyon ve tamponu değiştirmek kaçınılmalıdır. Önemli verim artışları 33 neden ifade arttırıcı plazmidler dahil ederek daha ileri optimizasyon. Burada, bu ilerlemelere üzerine inşa ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntemdir. İfade koşulları da N-glikan bileşimin etkisi için değiştirilebilir.

Bir ara aşamasında N-glikan işlem durur bir gen silme ile HEK293S hücre çizgisi, (GIcNAc 2 Adam 5) 34 2, N-asetilglukozamin bakiyelerine artı beş mannoz kalıntılarının oluşturduğu homojen N-glikanların proteinlerin ekspresyonuna yol açar 35. Bu hücreler,N-asetilglukosaminiltransferaz I transferaz (GntI) alt N-glikan işleme 36,37 için gerekli olan geni içermezler. Kifunensine, sialik asit analoglarının ve fukoz analog ve 2-deoksi-2-floro-fukoz içeren glıkosıltransferaz inhibitörlerinin kullanımı benzer etkiler ve N-glikan işlem 38-41 sınırları vardır.

Protokol Burada bildirilen, Şekil 1 'de gösterildiği gibi 42,43 pGEn2 vektörü kullanır PEI yardımıyla geçici memeli hücreleri çizgileri (HEK293F ya HEK293S hücreleri) transfeksiyon, ve uygun bir şekilde glikosile protein, yüksek verimlerle geri kazanılması. Bu sistem, sağlamdır ve rekombinant proteinlerin büyük titrelerinin üretimi için izotop işaretleme ve glikan mühendisliği de dahil olmak üzere çeşitli faktörler barındırabilir.

Protokol

Bu protokol, HEK293F ya HEK293S hücreleri kullanılarak ekspresyon için yeterlidir.

1. Hücre kurulması

  1. Kültür Aşılama
    Not: Tüm kültür işleme prosedürleri BSL-2 tesisinde yapılabilir ve her bir madde, su çözeltisi içerisinde% 70 etanol ile püskürtülerek sterilize edilmelidir biyo-güvenlik kabinine getirdi.
    1. 135 rpm, 80% nemde kuluçka çalkalayıcı çalıştırın ve% 8.0 CO2 ve 37 ° C'de ilave edildi. Çalışma için en az 1 saat önce biyogüvenlik kabini UV lambası "açık" konuma getirin. 1 saat boyunca 37 ° C'de su banyosu içinde sızdırmaz Orta A ve B Orta şişe Prewarm.
    2. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile püskürtme ile havalandırılmış bir kap, pipetler, Pipetler, ve önceden ısıtılmış Ortam şişe ile 125 ml'lik bir Erlenmeyer flasks büyüme sterilize edin. Biyogüvenlik kabini bu öğeleri yerleştirin. Not: 125 ml Erlenmeyer kültür şişesi kapsayan sadece dış plastik sterilize ve ne zaman ben o zaman sadece kaldırmakbiyogüvenlik kabini içinde s.
    3. Çalkalanarak karıştırılır (bundan sonra taze kültür ortamı olarak da adlandırılır) yavaşça 30 ml kültür için 26 Orta A ml ve orta B 3 ml (final kültürü% 10) geri çekilmesi ve 125 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içine aktarın kültürü ve.
    4. Buz üzerine kültür odasına taşımak -80 ° C'de donduruldu HEK293F hücreleri içeren hücre aktarılarak, bir şişe. Not: HEK293F hücreleri 1 x 10 7 hücre / ml bir yoğunlukta temin edilmektedir.
    5. (Yaklaşık bir dakika sürer ve hücreler tamamen çözülmüş edilmemelidir) kısmen hücreleri Çözülme 37 ° C'de su banyosunda hafifçe ısıtın flakon. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile flakon dışında sterilize ve biyogüvenlik kabini içine taşıyın.
    6. 1 ml bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonu (yaklaşık olarak 0.7 mi) geri çekilmesi ve taze kültür ortamı 29 ml içeren 125 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içine aktarın. Kültür şişesi kapağını kapatın ve kuluçkaya çalkalayıcı içine taşıyın.
  2. Hücre Bakım: Hücre Yoğunluğu, Canlılık ve Hücre Passages Kontrol
    1. Aşağıdaki protokolü takip ederek kültür çözülme 24 saat sonra hücrelerin yoğunluğu kontrol ediniz. Not: Hücreler,>% 80 temel hücre büyümesini ve canlılığını sağlamak için çözündürüldükten sonra 24 saat için büyütülmüştür.
    2. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile kültür şişesi sterilize ve biyogüvenlik kabini içine taşıyın.
    3. 1 ml pipet ve pipet kullanarak yavaşça steril bir 0.5 mi Eppendorf tüpüne süspansiyon kültürünün ve transfer 100 ul çıkarın. Kapatın ve mümkün olduğunca çabuk çalkalayıcı geri kültür şişesi aktarın.
    4. Hücrelerin 7.5 ul bir Tripan Mavisi Çözüm 7.5 ul karıştırın. Hücre / Trypan mavi karışımı 7.5 ul şiddetle karıştırın ve sayma slayt aktarın.
    5. Otomatik hücre sayacı açın ve yükleme odasına sayma slayt yerleştirin. Otomatik okuyucu devreye girer ve hücreler birimlerinde otomatik sayılırml yüzde canlılığı başına hücre sayısı
    6. 0.3 x 10 6 canlı hücre / ml hücre yoğunluğunda taze kültür ortamına transfer için gerekli olan donör kültür hacminin belirlenmesi.
      Not: Yardımcı Malzemeler örnek bir hesaplama bakın.
    7. Adımları tekrarlayın 1.1.2 ve üstü "1,1 Kültür Aşılama" protokol 1.1.3 taze kültür ortamı için gerekli malzemeleri hazırlamak.
    8. Taze 125 ml kültür şişesine Orta A (23 mi) ve orta B (3 mi) aktarın. Biyogüvenlik kabini gelen Orta A ve B Orta stok şişeleri çıkarın.
      Not: Ortam şişelerin Stoklar HEK 293F hücreleri ile aynı anda biyo-güvenlik kabini tutulmamalıdır. Bu stok ortam şişeleri kirletici olasılığını sınırlamaktadır.
    9. Inkübatör HEK293 hücre kültürü çıkarın ve su çözeltisi içinde% 70 etanol ile püskürtülür. (4 ml hücre kısım çekilme, yeni bir pipet kullanarak, bu hacim göre t belirlendio kültürden adım 1.2.6) ve taze kültür ortamı içeren şişeye aktarın.
    10. 1.1.1 göre ayarlanır inkübatör çalkalayıcı ile biyogüvenlik kabini kültürleri hem aktarın. 2-3 x 10 6 canlı hücre / ml'lik bir yoğunluğa, yaklaşık hücreleri büyütün.
      Not: Hücrelerin yaklaşık iki katına süresi 32 saattir. Bu yoğunluğa ulaşması 3-4 gün sürer. İlk transfeksiyon öncesinde hücrelerin istikrarlı büyüme modeline sahip 3-4 geçişleri için inkübe hücreleri.

2. Transfeksiyonu için malzemeler hazırlayın

  1. HEK293 Hücreler hazırlanması (Gün 1)
    1. Transfeksiyondan önce taze Ortam Maddesi B 24 hr 1 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunluğa Alt kültür hücreleri, 1.2 Adım göre yöntem.
      Not: transfeksiyon kültür hacmi hücre sayısına bağlı olacaktır. Büyük transfeksiyon hacimleri (> 20 ml) bu aşamada kültürün daha büyük bir hacim gerektirir.
  2. St HazırlamaMalzemelerin ocks
    1. 25 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) ve 150 mM NaCI (pH 7.5) ihtiva eden bir tampon maddesi içinde 1 mg / ml'lik bir konsantrasyonda, doğrusal polietilenimin (PEI) bir stok çözelti hazırlayın. Tamamen PEI çözülür; Bu oda sıcaklığında 30-60 dakika sürebilir. Uzun süreli kullanım için -20 ° C'de 0.22 mcM şırınga filtresi ve mağaza üzerinden sterilize edin.
    2. (2.2.2.1-2.2.2.4 adımlara göre) steril plazmid DNA hazırlayın. Plazmid inşaat prosedürü başka 42 tarif edilmiştir. DNA hazırlığı için kısa bir prosedür burada açıklanmıştır:
      1. LB ortamı (Tryptone- 10 g / L, çekilmifl, 5 g / L ve sodyum, klorid 10 g / L maya) ile takviye edilmiş 100 ug / 1 L pGEn2 vektörü ile transforme edilmiş, kimyasal olarak-kompetan Escherichia coli hücrelerinin bir kültürü büyütün ml ampisilin. E. E. coli olmayan bir nemlendirilmiş, çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de yetiştirilir.
      2. Boya üretimi uygun pGEn2 kodlayan vektörün hedef plazmid DNA saflaştınlırfacturer DNA'sı arıtma protokolü.
      3. Plazmid DNA sonra tam steriliteden emin olmak için biyo-güvenlik kabini içinde DNA ekstraksiyon prosedürleri nihai izopropanol çökelme ve yeniden süspansiyon haline getirme adımlarını gerçekleştirmek.
      4. 10.000 x elüt DNA ve santrifüj (plazmit hazırlama teçhizatı belirtilen) izopropanol hacmi ekleme 10 dakika boyunca örn. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile, DNA kabın dışında sterilize ve biyo-güvenlik kabini içine aktarın. Bir pipet kullanarak izopropanol süpernatant atın DNA pelet hava-kurulayın. Kuruduktan sonra, steril bir 10 mM Tris tamponu, pH 8.0 içinde pelletini.
    3. Su içinde 220 mM valproik (VPA) asidin bir stok çözelti hazırlayın ve steril bir 0.22 mikron filtre içinden geçirilerek sterilize edilir. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de çözelti saklayın.

3. Bir geçici transfeksiyon oluşturulması

  1. Transfeksiyon (Gün 0)
    1. Yukarıdaki "1.2. Hücre Bakım" 1.2.5 arasındaki adımları 1.2.2 izleyerek hücre yoğunluğunu kontrol edin. Transfeksiyon (canlılık>% 95 2.5-3.0 x 10 6 canlı hücre / ml), hücrelerin miktarının belirlenmesi. Yardımcı Malzeme örnek bir hesaplama bakın.
    2. Steril bir serolojik bir pipet kullanarak 250 ml'lik bir santrifüj tüpüne önceki basamakta (burada 67 mi) içinde hesaplanan süspansiyon kültür hücreleri, hacim aktarın. 100 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj ile hücreler toplanır.
    3. Bu arada, taze transfeksiyon kültür ortamı yukarıdaki "1.1. Kültür Aşılama" na göre adım 1.1.3 Aşağıdaki hazırlar. Bir örnek hesaplaması için Ek Malzemeleri bakın. Ayrıca, steril bir 15 ml tüp taze kültür ortamı transfer 5 mi kenara ayırın.
    4. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile tüplerin dışında sterilizasyon ve th dekante için steril bir pipet kullanın sonra biyo-güvenlik kabinine pelet hücreleri ihtiva eden ve transfer tüplerikültür aracı kapsayan e yüzer.
    5. Kuvvetlice yukarı pipetleme ve taze kültür ortamına ve taze transfeksiyon kültür ortamı ile şişeye transfer 10 ml kullanarak aşağı pelet hücreleri tekrar süspansiyon (yukarıdaki adım 3.1.3 hazırlanmış). Bacalı hücre kültürü şişesi kapağını kapatın ve sallama ile 15 dk-1 saat (1.1.1 ayarlandığı gibi) inkübatör şişeyi taşıyın.
    6. Bu süre boyunca, plazmid DNA ve 0.5 ug / ul nihai konsantrasyona kadar (yukarıdaki adım 3.1.3 çekilen 5 mi hacmi kullanılarak) taze kültür ortamı kullanılarak PEI stokları seyreltin. Yardımcı Malzeme örnek hesaplamalar DNA ve PEI miktarını belirlemek için bkz. Biyogüvenlik kabini içine dağılmış hücreleri ile kültür şişesi aktarın.
    7. Mikro-pipet kullanılarak kültür plazmid DNA (0.5 ug / ul 300 ul) ilave edilir ve yumuşak el çalkalanarak karıştırılır. PEI kültürüne (0.5 ug / ul 900 ul) ekleyin, hafifçe sallayarak karıştırın. Taze cul 3.8 ml ekleyin24 saat süre ile kuluçka çalkalayıcı yukarıdaki aşama 3.1.3, ve transfer şişeden Ture ortam.
    8. Adım 1.1 göre biyogüvenlik kabini temizleyin.
  2. (50 ml transfeksiyon hacmi için) seyreltme (Gün 1)
    1. 24 saat süre ile transfekte kültürü inkübe edin.
    2. 1 ml steril bir pipet kullanılarak serolojik ve steril bir 50 ml'lik bir tüpe transfer (2.2.3 aşamasına göre hazırlandı. VPA) önceden ısıtılmış 220 mM Valproik asit 1 ml çekin.
    3. 5,0 önceden ısıtılmış Orta B ml önceden ısıtılmış ve orta A 44 ml çekin ve VPA 4,4 mM'lik bir son konsantrasyona sahip taze kültür ortamı 50 ml hazırlamak için, steril bir serolojik bir pipet kullanarak VPA çözeltisine Bu ekleyin.
    4. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile balonun dış sterilize sonra biyogüvenlik kabini transfekte kültür taşı hazırlanan seyreltme orta ekleyebilir ve kuluçkaya karıştırıcısı geri şişeyi aktarın.
  3. İfade ve Hasat (Gün 2-6)
    1. (5-6 gün transfeksiyondan beri toplam) ilave 4-5 gün boyunca inkübe hücreleri.
    2. Adım 1.2.2 Aşağıdaki kültür ortamının hacimde çekin. 1.2.5 için. SDS-PAGE ile her gün protein ifadesini analiz etmek için alikotları hücreleri canlılığını izlemek ve kaydetmek için, 1 ml steril bir serolojik pipet kullanarak yukarıdaki ", 1.2. Hücre Bakım" bölümünde anlatılan (aşağıda Bölüm 5).
    3. 5 dakika boyunca 1000 g'de pil, orta santrifüjle 5-6 gün sonra hasat hücreleri. Hücre canlılığı% 50'nin altına (adımlara bakın 1.2.2-1.2.5) düşerse Ayrıca, süpernatant hasat.
    4. Salgılanan protein içerecek Süpernatantı dökün. HEK hücre pelet% 10 çamaşır suyu 5 ml ekleyin ve biyolojik tehlike olarak atın.

4. Protein Saflaştırma

  1. Protein-A sefaroz ve 5 ml olan bir kolon hazırlanmıştır. Tampon A (20 mM 3- (5 kolon hacmi ile sütun dengeye N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS) pH 7.4, 100 mM NACl).
  2. Kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için yüksek hızda (10 dakika boyunca 14000 g) sonra ifade edilmiş protein toplanan süpernatant santrifüjleyin. Yeni bir tüpe içine dekante edilerek toplanır. Biyolojik tehlike olarak pelet atın.
  3. Süpernatan 10 ul tablet toplamak ve buna ek olarak, SDS-PAGE ile analiz örnek için her bir protein saflaştırma adımında küçük numune toplamak (Kısım 5 tarif edilmiştir). Açıklık süpernatant yükleyin ve akışını toplamak.
  4. Tampon A 3-kolon hacminde sütun yıkanır ve 100 mM glisin, pH 3.0, 5-kolon hacminde proteinini ayrıştırmak. Hızla pH'ını nötrleştirmek üzere bir buçuk 1 M TRIS tampon hacmi, 8.0 pH içeren tüplerde eluat toplayın.
  5. Ileride kullanmak üzere tampon A ve mağaza 10 kolon hacmi ile sütun yıkayın.
  6. Tampon A ile 10 kDa molekül ağırlıklı bir kesim santrifüjlü filtre tampon, en az bir 10-kat fazla ile elüt protein değişimi. Not: yıkanarak örneği konsantre etmeyinçok düşük hacimli elüt tampon maddesi içinde (<2 mi) eklendi. Tampon A ile tampon değişimi santrifüj filtreleri kullanın
  7. Mağaza bir sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de bir protein saflaştırıldı.
    Not: süpematan içinde ifade edilen protein, proteinin özellikleri temelinde veya afinite etiketleri kullanılarak seçilen afinite sütunu ile saflaştırılabilir. Tipik bir saflaştırma işlemi için, Protein A kolonu, bir poli-histidin etiketi ile eksprese edilen proteinler için kullanılabilir IgG Fc fragmanları veya veya nikel kolonu kullanılabilir. Burada, bir protein A kolonu IgG1-Fc saflaştırma aşamalarının bir açıklamasıdır.

SDS-PAGE ile Proteininin Analizi 5.

  1. 2x yükleme tamponu (0.125 M Tris, pH 8.0,% 4 SDS,% 10 β-merkaptoetanol,% 20 gliserol ve% 0.01 bromofenol mavisi) eşit hacmi ile her bir numunenin alikotları (7.5 ul) ile seyreltilir.
  2. Bir ısıtma bloğu ya da su banyosu kullanılarak 5 dakika boyunca 90 ° C'de karışım kaynatılır. 10.000 g fo numuneler santrifüjr, 1 dak. Işaretleyici protein 5 ul ve atılabilir bir ucu olan bir 20 ul pipet kullanarak analizler için numune 14 ul hazırlanan jel yükleyin.
  3. 60 dakika boyunca 25 miliamperde bir jel çalıştırın. Elektroforez adımı tamamlandıktan sonra, 5 dakika süre ile, su ve mikrodalga 1 L bir kaba jel aktarın.
  4. Su içinde boyama çözeltisi (% 40 etanol,% 10 asetik asit ve% 0.1 Coomassie parlak mavi) 2 saat süre ile ve destain ile jel leke.

Kütle Spektrometresi 6. glukanlardır Analizi

  1. Daha önce açıklandığı gibi 44 glikanlar analiz edin. Kısaca, IgG1-Fc bölgesinin 75 ug daha sonra glıkanların 45 serbest bırakılması için PNGaseF tedavi, tripsinize edilmiştir. Çıkış glıkanlar permetilatlı ve matris-yardımlı lazer dezorpsiyon iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOFMS) kullanılarak analiz edildi.

Özel Senaryolar 7. Protokol Düzeltmeler

  1. 15 N- Proteinler Etiketleme(50 ml transfeksiyon hacmi) Amino Asitler etiketli
    1. Tek bir steril cam şişe içine, her bir amino asidin 5 mg koyun. Su otoklavlanır 4 ml (tamamen Lys ve Phe'den aksine, çözünür değildir Tyr unutmayın) ile süspanse edin. 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavda tutarak çözelti sterilize edin. Çözelti 50-60 ° C'ye, yaklaşık soğumaya bırakın.
    2. 50 ml'lik transfeksiyon hacmi için, "3,1 geçici transfeksiyon Kurulması" na göre adım 3.1.3 izleyin. Uygun hacimli bir örnek için ek malzemeler bölümüne bakın.
    3. Transfeksiyon için, yukarıda hazırlanmış olarak etiketlenmiş amino asit kalıntısı ile sübstitüe edilmiş taze kültür ortamı kullanılarak "3. geçici transfeksiyon Kurulması", aşağıdaki aşamaları takip edin.
    4. Transfeksiyondan 24 saat sonra, kültür seyreltme gününde, önceden ısıtılmış Orta B 5.0 mi, önceden ısıtılmış Orta A 40 ml ve amino asit karışımı taze otoklavlanmış 4 ml lik bir geri (adım 7.1.1 gibi hazırlanmıştır. Yukarıda) ve 1 ekleyinmi VPA 4,4 mM'lik bir son konsantrasyona sahip taze bir kültür ortamı sulandırma 50 ml hazırlamak için, VPA çözeltisi stok solüsyonu önceden ısıtılmış. Steril bir pipet kullanılarak transfeksiyon serolojik kültürü için bu orta ekleyin.
    5. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile balonun dış sterilize sonra biyogüvenlik kabini transfekte kültürü aktarın hazırlanan seyreltme orta ekleyebilir ve kuluçkaya karıştırıcısı geri şişeyi aktarın.
      Not: Orta bir kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz bir ortamdır. Bu nedenle, farklı bir formülasyonu hazırlamak mümkündür. Belirli amino asitler yoksun özel bir Orta A hazırlık edinmek için satıcınızla görüşün. Ancak, biz tam bir ayrılma orta takviyesi sonrası ozmolaritenin ayarlanmasını gerektirir çünkü yalnızca birkaç seçme artıkları yoksun orta kullanmayı tercih tüm amino asitler dışarı sol olması mümkündür. Biz takviye edilebilir ve osmolarite ayarlaması gerektirmez Lys-Tyr-Phe bırakma orta seçti. Furthermore, Orta serbestçe orta bileşenlerin konsantrasyonları paylaşmak olmayan bir tedarikçisi; başarı ile Lys, Tyr ve Phe'den için 100 mg / L, her kullanılır. Transfeksiyonu ve sentezleme ortamı hacimleri eklenmiş amino asitler için hesap ayarlanmalıdır. İşte izotop etiketleme için yukarıdaki protokole ayarlamalar vardır
  2. Küçük molekül ile Transfeksiyon Ek
    1. Otoklavlanmış su kullanılarak 2-deoksi-2-floro-l-fukoz 100 mM stok çözelti hazırlayın ve 0.22 uM filtre kullanılarak bu çözüm sterilize edin.
    2. 50 ml'lik bir kültür için transfeksiyonu ve seyreltme ortamı fukoz analog çözeltisi (250 uM) 125 ul ilave edin. Not: toplam kültür hacmi! Ashton sadece% 0.25 için bu konsantrasyon hesapları ornatığına ekleyerek glikan işleme küçük molekül inhibitörleri kullanarak ifadeyi değiştirmek mümkündür, çünkü başka ses ayarı yapmak için ihmal. Burada 2-deoksi-da dahil olmak üzere koşullarını tarif2-floro-l-fukoz, glıkan fukosilasyonu bir inhibitörü. Bu transfeksiyon seyreltme ortamı içinde 250 uM bir konsantrasyonda fukoz analog ekleyerek fukosilasyonu olarak>% 90 azalma bulmuşlardır.

Sonuçlar

Üst düzey protein ekspresyonu ve saflık

Bu optimize edilmiş ifade sistemi glikosile proteinlerin yüksek verimle üretilen. Tipik bir desen IgG1-Fc (Şekil 1) ifadesi gösterilir. Bu durumda, gün 0, ham bir ortam içinde çözülebilen sentezleme fraksiyonu kullanılarak analiz edilir 5. günde protein ekspresyonu kadar Gün 1 (seyreltme) eklenmiştir transfeksiyon gün ve daha sonra, kültür gündür. K...

Tartışmalar

Bu protokol, HEK293F veya S hücrelerinin kısa süreli transfection ile protein ifadesini gösterir. Barb ve Moremen laboratuarlarında kurulan optimum transfeksiyon koşulları yüksek verim elde etmek için transfeksiyon hücre yoğunluğu ve reaktif konsantrasyonları kritik bir kombinasyonunu kullanır. Bu protokolü uygulayan Kritik hususlar şunlardır: (tutarlı kültür süreleri katlama) ile transfeksiyon öncesinde istikrarlı bir kültür muhafaza etmek; % 95'den daha büyük hücre yaşayabilirliği ile...

Açıklamalar

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Teşekkürler

Bu çalışma mali hibe K22AI099165 (AWB) tarafından, P41GM103390 (KWM) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri P01GM107012 (KWM) ve Iowa State Üniversitesi Biyokimya, Biyofizik ve Moleküler Biyoloji Roy J. Carver Bölümü fonları tarafından desteklenen . Bu çalışmanın içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinet NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shakerINFORS HTMultitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium Life Technologies12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium SIGMA14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10B
10 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10J
25 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blue Solution Thermo Scientific SV30084.01
Counting slides Bio-Rad145-0011
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc.23966Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μMFisher Scietific09-719A
Trisaminomethane (Tris base)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
Yeast extractFluka Analytical 92144
Sodium chlorideBDH chemicalsBDH8014
Plasmid Purification KitQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
CentrifugeThermo Scientific EW-17707-65
Protein A-Sepharose columnSIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycineFisher ScietificBP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters MilliporeUFC901096
Sodium dodecyl sulfateALDRICHL3771
Beta-mercaptoethanolALDRICHM6250
GlycerolSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Acetic Acid, Glacial Fisher Scietific64-19-7
coomassie brilliant blue Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N labeled L-TyrosineALDRICH332151
15N labeled L-LysineALDRICH592900
Unlabeled L-PhenylalanineSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-GlucoseALDRICH389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose SANTA CRUZ Biotechnologysc-283123

Referanslar

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Erratum


Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 106glikoproteinimm nglobulin GFc resept rrekombinant proteinleriinsan HEK293F ve HEK293S h creler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır