JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Аннотация

Искусство получения рекомбинантных белков со сложными пост-трансляционных модификаций представляет собой серьезную проблему для исследований структуры и функции. Быстрое создание и высокое извлечение из временно трансфецированных клеточных линий млекопитающих обращается этот барьер и является эффективным средством выражения белки, которые, естественно, направлен через ER и Гольджи-опосредованной секреторной пути. Вот один протокол для экспрессии белка с использованием человеческого и HEK293F HEK293S клеточные линии, трансфицированные экспрессирующий вектор млекопитающего, предназначенный для высоких урожаев белка. Применимость этой системы продемонстрировали с помощью трех представительных гликопротеинов, которые выразили при урожайности между 95-120 мг очищенного белка восстановленного на литр культуры. Эти белки являются человеческий FcγRIIIa и крыс α2-6 сиалилтрансферазу, ST6GalI, как выражается с N-концевой GFP слияния, а также немодифицированного человеческого иммуноглобулина G1 Fc. Это надежные системы ИМПlizes бессывороточной среды, что является гибкой для выражения изотопно обогащенных белков и углеводов для структурных исследований с использованием масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Кроме того, в состав N-гликанов может быть настроена путем добавления небольшого молекулу, чтобы предотвратить определенные модификации гликанов таким образом, чтобы не уменьшить выход.

Введение

Производство высокие урожаи соответствующим сложенными и посттрансляционно модифицированных белков человека для детального анализа структуры и функции остается серьезной проблемой. Большое количество систем экспрессии доступны, которые производят рекомбинантные белки с нативной как функции и поведение. Бактериальные системы экспрессии, преимущественно кишечной палочки штамма, представляют собой наиболее доступных и широко используемых инструментов в научно-исследовательской сфере, в связи с простотой этих систем экспрессии, хотя дрожжи, растения, насекомых и млекопитающих систем также описаны 1-4. Тем не менее, большинство из этих систем не способны соответствующим посттрансляционной модификации белков-мишеней. Фундаментальный интерес лабораториях Барб и Moremen производит эукариотических белков с соответствующей гликозилирования. Многие белки человека требуют соответствующего гликозилирования для правильного функционирования (см 5).

Эукариотическийгликозилирования техника обширна и способны сделать широкий спектр модификаций, в том числе как аспарагин (N) - и серина / треонина (О) -связанной сложные гликаны 6. Считается, что> 50% человеческих белков N-гликозилированные 7. Гликаны являются важными компонентами многих белков, включая терапевтические моноклональные антитела, эритропоэтин, и факторов свертывания крови, как фактор IX, чтобы назвать несколько. Хотя несколько методов существуют, чтобы подготовить соответствующим образом N-гликозилирования белков и варьируются от чисто синтетических 8-10, чтобы chemoenzymatic 11-14 или восстановление из инженерных рекомбинантных системах 15-20, не удивительно, что системы человека выражение до сих пор доказано, что самый надежный методы для генерации человеческих белков.

Многие терапевтические человека гликопротеины производятся в рекомбинантных системах, использующих клетки млекопитающих. Системы следует отметить яичника китайского хомячка (СНО), мышиной миеломы (ns0), хомячка Kidneу (ВНК), человеческого эмбриона почек (НЕК-293) и сетчатки клеточных линий человека, которые используются в адгезии или суспензионной культуры для производства белка 4,21,22. Тем не менее, системы экспрессии белка млекопитающего требовали генерацию стабильных клеточных линий, дорогих питательной среды и подложки помощь процедур трансфекции 23.

Млекопитающих трансфекции клеток достигается с помощью многочисленных агентов, включая фосфатов кальция 24,25, катионных полимеров (DEAE-декстран, полибрен, полилизин, polyethylimine (PEI)) или положительно заряженных катионные липосомы 26-29. PEI является поликатионное, загружают, линейный или разветвленный полимер (25 кДа), который формирует 26 стабильный комплекс с ДНК и эндоцитоз. При подкислении эндосомы, PEI, как полагают, набухают, что приводит к разрыву эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму 26,30.

До недавнего времени, временная трансфекция в suspensiна культуру проводилась по предварительной ДНК / PEI комплексообразования с последующим добавлением к культуре клеток 29. Тем не менее, Würm и соавторы сообщили весьма эффективный протокол, оптимизированный для рекомбинантного белка в клетках НЕК293, которые сформировали комплекс ДНК / PEI в месте 31,32. Это препарат, избежать стерилизации комплекса, и буфера обмена в культуральной среде. Дальнейшая оптимизация путем включения экспрессии плазмиды, повышающих привели к значительным увеличением доходности 33. В этом метод, который основывается на этих авансов и широко применим. Условия экспрессии также могут быть изменены, чтобы повлиять на состав N-гликанов.

Клеточная линия HEK293S, с делеции гена, что останавливает N-гликана обработки на промежуточном этапе, приводит к экспрессии белков с единых N-гликанов, состоящих из 2 N-ацетилглюкозамина остатков плюс пять остатков маннозы (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Эти клеткине хватает N-ацетилглюкозаминил трансферазы I (GntI) ген, который требуется для последующего N-гликанов обработки 36,37. Применение ингибиторов гликозилтрансферазы включая kifunensine, аналогов сиаловой кислоты и фукозы аналоговых и 2-дезокси-2-фтор-фукозы имеет подобные эффекты и ограничения N-гликанов обработки 38-41.

Протокол сообщалось здесь, использует вектор pGEn2, как показано на рисунке 1 42,43, PEI трансфекции помощь переходные в клетки линий (HEK293F или HEK293S клеток), а также восстановление с высоким выходом соответственно гликозилированный белок. Эта система является надежной и может использоваться для различных факторов, включая изотопной метки и гликановой техники для производства больших титров рекомбинантных белков.

протокол

Этот протокол является достаточным для выражения с использованием либо HEK293F или HEK293S клетки.

1. Создание сотовый

  1. Культура Прививка
    Примечание: Все процедуры манипулирования культуры должно осуществляться в BSL-2 объекта, и каждый пункт принес в кабинет биобезопасности должны быть стерилизованы путем распыления с 70% этанола в водном растворе.
    1. Используйте инкубатор шейкер при 135 оборотах в минуту, 80% влажности и при 8,0% CO 2 и 37 ° С. Включите "на" УФ лампы шкафа биобезопасности, по меньшей мере 1 ч до начала работы. Prewarm запечатанные среды А и B средний бутылки в водяной бане при 37 ° С в течение 1 часа.
    2. Стерилизация 125 мл колб Эрленмейера роста с вентилируемой крышкой, пипеток, дозаторов, и предварительно нагретой бутылки медиа опрыскиванием 70% -ным этанолом в водном растворе. Поместите эти элементы в шкафу биобезопасности. Примечание: Стерилизовать только внешний пластик покрытия 125 мл Эрленмейера культуральной колбы, а затем удалить, только когда яс внутри шкафа биобезопасности.
    3. Для культуры 30 мл, 26 мл вывести среды А и 3 мл среды В (10% от окончательной культуры) и передачи в Эрленмейера культуры колбу 125 мл и осторожно перемешать путем встряхивания (далее называется как свежей культуральной среды).
    4. Передача один флакон клеток, содержащих клетки, HEK293F замораживали при -80 ° С, на лед и перейти к комнатной культуре. Примечание: HEK293F клетки работают при плотности 1 х 10 7 клеток / мл.
    5. Теплый флакон осторожно водяной бане при 37 ° С для частичного оттаивать клетки (это занимает около одной мин и клетки не должны быть полностью размораживают). Стерилизовать снаружи флакона с 70% этанола в водном растворе и переместить его в шкафу биобезопасности.
    6. Используя 1 мл пипетки, вывести клеточной суспензии (приблизительно 0,7 мл) и передать в 125 мл колбу Эрленмейера, содержащую 29 мл свежей культуральной средой. Закройте крышку культуры колбу и переместить его в инкубированной шейкере.
    7. Обслуживание датчика: Проверьте сотовый плотность, жизнеспособности и клеточной Проходы
      1. Проверка плотности клеток после 24 ч оттаивания культуры, следуя протокол ниже. Примечание: Клетки выращивали в течение 24 часов после размораживания, чтобы обеспечить рост клеток эфирные и жизнеспособность> 80%.
      2. Стерилизовать культуры колбу с 70% этанола в водном растворе и переместить его в шкафу биобезопасности.
      3. С помощью пипетки 1 мл пипетки и медленно снять 100 мкл суспензии культуры и передачи в стерильный 0,5 мл трубки Эппендорф. Закрыть и передачи культуральной колбы обратно в шейкере, как можно скорее.
      4. Смешайте 7,5 мкл трипанового синий раствор с 7,5 мкл клеток. Смешайте энергично 7,5 мкл клеточной / Трипановый синий смеси и перенести его на счетной слайда.
      5. Включите автоматический счетчик клеток и поместите подсчета слайд в загрузочную камеру. Авто читатель активируется и клетки подсчитывали автоматически в единицахчисла клеток на мл и процентов жизнеспособности
      6. Определить объем культуры доноров, необходимого для перевода в свежей культуральной средой при плотности клеток 0,3 × 10 6 живых клеток / мл.
        Примечание: См пример расчета в дополнительных материалах.
      7. Повторите шаги 1.1.2 и 1.1.3 протокола "1.1 Культура Прививка" выше, для получения материалы, необходимые для свежей культуральной среды.
      8. Теплоноситель A (23 мл) и питательную среду В. (3 мл) в 125 мл свежего культуральной колбы. Удалить фондовые бутылки среде А и среднего B от биобезопасности кабинета.
        Примечание: Запасы СМИ бутылок не должны храниться в шкафу биобезопасности в то же время, как клетки НЕК 293F. Это ограничивает возможность загрязнения фондовый среднего бутылки.
      9. Удалить культуру клеток НЕК293 из инкубатора и распылить с 70% -ным этанолом в водном растворе. Используя новую пипетку, вывести аликвоту клеток (4 мл, этот объем был определен в соответствии тО шагом 1.2.6) из культуры и передать его в колбу, содержащую свежую питательную среду.
      10. Перевести обе культур из шкафа биобезопасности в инкубатор шейкере в соответствии с 1.1.1. Рост клеток к приближенному плотности 2-3 × 10 6 живых клеток / мл.
        Примечание: Примерное время удвоения клеток 32 ч. Это займет 3-4 дней, чтобы достичь этого плотность. Инкубируйте клетки в течение 3-4 пассажей иметь стабильный характер роста клеток до первой трансфекции.

    2. Подготовка материалов для трансфекции

    1. Подготовка клеток НЕК293 (день 1)
      1. Субкультуры клетки до плотности 1 х 10 6 клеток / мл в свежей среде B 24 ч до трансфекции в соответствии с шагом 1.2.
        Примечание: объем трансфекции культуры будет зависеть от числа клеток. Объемах, трансфекции (> 20 мл) потребуется больший объем культуры на данном этапе.
    2. Подготовка Stocks Материалов
      1. Подготовка исходного раствора линейного полиэтиленимина (PEI) в концентрации 1 мг / мл в буфере, содержащем 25 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) и 150 мМ NaCl (рН 7,5). Растворите PEI полностью; это может занять 30-60 мин при комнатной температуре. Стерилизовать через 0,22 мкм шприцевой фильтр и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного использования.
      2. Подготовьте стерильную ДНК плазмиды (в соответствии с шагами 2.2.2.1-2.2.2.4). Порядок плазмиды конструкция описана в другом месте 42. Краткий порядок подготовки ДНК объясняется здесь:
        1. Выращивают культуру химически компетентных клеток кишечной палочки, трансформированных вектором pGEn2 в 1 л LB среды (Tryptone- 10 г / л, дрожжевой выводами для 5 г / л и хлоридно-натриевой 10 г / л) с добавлением 100 мкг / мл ампициллина. Е. палочка выращивают при 37 ° С в увлажненной без встряхивания, инкубатор.
        2. Очищают pGEn2 вектор, кодирующий целевой ДНК плазмиды в соответствии с МануДНК очистки протокол изготовителе в.
        3. Для обеспечения полной стерильности плазмидной ДНК, выполните окончательные изопропанол осадков и ресуспендирование шаги процедуры экстракции ДНК внутри шкафа биобезопасности.
        4. Добавить объем изопропанола (указанный в наборе плазмидной ДНК), чтобы элюированной ДНК и центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин. Стерилизовать снаружи контейнера ДНК с 70% этанола в водном растворе и передать его в шкафу биобезопасности. Откажитесь изопропанольного супернатант с помощью пипетки и воздушно-сухой осадок ДНК. После высыхания, ресуспендируют осадок в буфере стерильной 10 мМ Трис, рН 8,0.
      3. Подготовка исходного раствора 220 мМ вальпроевой (VPA) кислоты в воде и стерилизуют путем прохождения через стерильный фильтр 0,22 мкм. Хранить раствор при -20 ° С до дальнейшего использования.

    3. Установление временной трансфекции

    1. Трансфекция (день 0)
      1. Проверьте плотность клеток, выполнив действия 1.2.2 через 1.2.5 »1.2. Обслуживание датчика" выше. Определить количество клеток для трансфекции (2,5-3,0 × 10 6 живых клеток / мл с жизнеспособностью> 95%). См пример расчета в дополнительных материалах.
      2. Передача объем суспензии культивируемых клеток, рассчитанных на предыдущем шаге (здесь 67 мл) до 250 мл центрифужную пробирку с использованием стерильного серологические пипетки. Собирают клетки центрифугированием в течение 5 мин при 100 х г в.
      3. В то же время, подготовить свежий трансфекции культуральную среду следующим шагом 1.1.3 в соответствии с "1.1. Культура Прививка" выше. См дополнительных материалов для расчета образца. Кроме того, передача 5 мл свежей культуральной среды в стерильную пробирку 15 мл и отложите в сторону.
      4. Передача пробирки, содержащие осажденные клетки в корпус биологической безопасности после стерилизации снаружи трубок с 70% -ным этанолом в водном растворе и использовать стерильной пипетки переливать гое супернатант, состоящий из отработанного культуральной среде.
      5. Энергично ресуспендирования клеток путем осаждают пипетированием вверх и вниз с помощью 10 мл свежей культуральной средой и передачи в колбу со свежей культуральной среде трансфекции (полученного на стадии 3.1.3 выше). Винт колпачка на вентилируемый клеточной культуральной колбы и колбу переместить в инкубатор (как указано в 1.1.1) в течение 15 мин-1 час при встряхивании.
      6. В течение этого времени, разбавить плазмидной ДНК и PEI запасов с использованием свежую культуральную среду (используя объем 5 мл выведены из шага 3.1.3 выше) до конечной концентрации 0,5 мкг / мкл. См образец расчеты в дополнительные материалы, чтобы определить количество ДНК и PEI. Передача культуральной колбы с рассредоточенными клеток в шкафу биобезопасности.
      7. Добавить плазмидной ДНК (300 мкл 0,5 мкг / мкл) к культуре с использованием микро-пипетки и перемешать, осторожно вручную встряхивании. Добавить PEI (900 мкл 0,5 мкг / мкл) к культуре, перемешать осторожно встряхивая. Добавить 3,8 мл свежей кульры среднего, с шага 3.1.3, выше и передачи колбу в инкубатор шейкере в течение 24 часов.
      8. Очистите биозащитой в соответствии со стадией 1.1.
    2. Разведение (День 1) (Для объема трансфекции 50 мл)
      1. Инкубируйте культуру, трансфицированных в течение 24 часов.
      2. Вывод 1 мл предварительно нагретой 220 мМ Вальпроевая кислота (VPA; подготовлен в соответствии с шагом 2.2.3.) С использованием стерильных 1 мл серологические пипетки и перенести его на стерильную пробирку на 50 мл.
      3. Вывод 5,0 мл предварительно нагретого среднего B и 44 мл предварительно нагретого среде А и добавить к раствору VPA с использованием стерильного серологические пипетки, с получением 50 мл свежей культуральной среды с конечной концентрацией 4,4 мМ VPA.
      4. Перемещение трансфи- культуру в биозащитой после стерилизации внешний вид колбу с 70% -ным этанолом в водном растворе, добавить подготовленную среда разведения и передачи колбу обратно в инкубируют шейкере.
    3. Экспрессия и урожая (Дни 2-6)
      1. Инкубируйте клетки в течение дополнительных 4-5 дней (всего 5-6 дней, так как трансфекции).
      2. Вывод аликвоты культуральной среды следующий шаг 1.2.2. в 1.2.5. описано в "1.2. Обслуживание датчика", выше, с использованием стерильного 1 мл серологические пипетки, следить за жизнеспособность клеток и сохранить аликвоты для анализа экспрессии белка в каждый день по SDS-PAGE (см раздел 5, ниже).
      3. Урожай клетки после 5-6 дней центрифугированием клетки плюс среда при 1000 г в течение 5 мин. Кроме того, урожай супернатант, если жизнеспособность клеток падает ниже 50% (см шаги 1.2.2-1.2.5).
      4. Слейте надосадочную, который будет содержать секретируемый белок. Добавьте 5 мл 10% отбеливателя в НЕК клеточного осадка и отбросить как Biohazard.

    4. Белки очистки

    1. Подготовка колонки 5 мл протеин-А-сефарозе. Равновесие колонки 5 объемами колонки буфера А (20 мМ 3- (N-морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS), рН 7,4, 100 мМ NACл).
    2. Центрифуга собранных супернатанта с экспрессированного белка на высокой скорости (14000 г в течение 10 мин) для удаления остатков клеточного дебриса. Сбор декантацией в чистую пробирку. Откажитесь от гранул как Biohazard.
    3. Сбор 10 мкл аликвоту супернатанта и дополнительно собрать небольшой образец на каждой стадии очистки белка анализа образца в ДСН-ПААГ (описано в разделе 5). Загрузите осветленный супернатант и собрать поток через.
    4. Промыть колонку с объемами 3-колонки буфера А и элюируют протеин с объемами 5-столбцов 100 мМ глицина, рН 3,0. Собирают элюат в пробирки, содержащие одну половину объема 1 М Трис-буфере, рН 8,0 быстро нейтрализовать рН.
    5. Промыть колонку с 10 объемами колонки буфера А и магазин для будущего использования.
    6. Буфер обмена элюированный белок с по меньшей мере 10-кратным избытком буфера А с использованием 10 кДа молекулярной массой среза фильтров центробежные. Примечание: Не сосредоточиться элюированную образец дляочень малый объем (<2 мл) в элюированной буфера. Используйте центробежные фильтры для обмена буфер буфером А.
    7. Магазин не очищенного белка при 4 ° С до следующего использования.
      Примечание: белок, экспрессируемый в надосадочной жидкости, могут быть очищены аффинной столбцов, выбранных на основании свойств белка или использования аффинных меток. Для типичного процедуры очистки, белок А колонки могут быть использованы для IgG Fc или его фрагментов или столбце никеля может быть использован для белков, экспрессируемых с поли-гистидина тега. Здесь приведено описание стадий очистки для IgG1-Fc с использованием колонку с белком А.

    5. Анализ белка в ДСН-ПААГ

    1. Развести Аликвоты (7,5 мкл) каждого образца с равным объемом 2х буфера для загрузки (0,125 М Трис, рН 8,0, 4% SDS, 10% бета-меркаптоэтанол, 20% глицерин, и 0,01% голубой бромфениловый).
    2. Варить смесь при 90 ° С в течение 5 мин, используя нагревательный блок или водяной бане. Центрифуга образцов при 10000 г FOR 1 мин. Загрузка подготовленную гель с 5 мкл маркера белка и 14 мкл образцов для анализа с использованием 20 мкл пипетки с одноразовый наконечник.
    3. Запустите один гель при 25 мА в течение 60 мин. После электрофореза шаг является полным, передавать гель в контейнер с 1 л воды и микроволновой печи в течение 5 мин.
    4. Пятно гель с красящим раствором (40% этанола, 10% -ной уксусной кислоты и 0,1% кумасси бриллиантовым синим) в течение 2 ч и destain в воде.

    6. Гликаны Анализ масс-спектрометрии

    1. Анализ гликаны, как описано выше 44. Вкратце, 75 мкг IgG1-Fc был трипсином, а затем обрабатывают помощью PNGазы F для выхода гликанах 45. Дата выхода гликаны перметилированный и проанализированы с помощью матрицы-активированная лазерная десорбция ионизации-время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOFMS).

    7. Корректировка протокол для специальных сценариев

    1. Мечения белков с 15 N-меченых аминокислот (для объема трансфекции 50 мл)
      1. Разлить 5 мг каждой аминокислоты в одном стерильном стеклянный флакон. Ресуспендируют с 4 мл воды автоклавного (обратите внимание, Тир не полностью растворить, в отличие от Lys и Phe). Стерилизацию автоклавированием раствора путем при 121 ° С в течение 15 мин. Дайте раствору остыть примерно до 50-60 ° С.
      2. Для объема трансфекции 50 мл, выполните шаг 3.1.3 в соответствии с "3.1 Создание временной трансфекции". Смотрите раздел Дополнительные материалы для примера с соответствующими объемами.
      3. Для трансфекции, следуют этапы "3. Установление временной трансфекции" с помощью свежую культуральную среду, замещенную меченых аминокислотных остатков, полученного выше.
      4. Через 24 часа трансфекции в день разбавления культуры, вывести 5,0 мл предварительно нагретого среднего B 40 мл предварительно нагретой среде А и свежей автоклавного 4 мл аликвоты смеси аминокислот (полученного, как на стадии 7.1.1. Выше) и добавить 1мл предварительно нагретого исходного раствора раствор VPA с получением 50 мл свежей культуральной среды растворения с конечной концентрацией 4,4 мМ VPA. Добавить эту среду трансфекции культуры, используя стерильную пипетку серологический.
      5. Передача трансфи- культуру в биозащитой после стерилизации внешний вид колбу с 70% -ным этанолом в водном растворе, добавить подготовленную среда разведения и передачи колбу обратно в инкубируют шейкере.
        Примечание: Средние А представляет собой химического состава, не содержащей сыворотки среде. Таким образом, можно приготовить другой состав. Связаться с поставщиком для получения пользовательского подготовку СРЕДНЕЙ, что не хватает некоторых аминокислот. Можно иметь все аминокислоты опущены, однако, мы предпочитаем использовать носитель, который не хватает только несколько избранных остатки, потому что полная отсева средней потребует регулировки осмолярности после добавки. Мы выбрали отсева среду Lys-Tyr-Phe, которые могут быть дополнены и не требуют регулировки осмолярности. Марихуанаrthermore, среда Поставщик не свободно обмениваться концентрации компонентов среды; мы использовали 100 мг / л каждый для Lys, Tyr и Phe с успехом. Объемы трансфекции и экспрессии среды должны быть скорректированы с учетом добавленных аминокислот. Вот корректировки выше протокола для изотопной метки
    2. Дополнение трансфекции с низкомолекулярных
      1. Подготовьте 100 мМ исходного раствора 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы с использованием автоклавного воды и стерилизовать этот раствор с использованием фильтра 0,22 мкм.
      2. Для культуры 50 мл, добавляют 125 мкл (при 250 мкм) фукозы аналогового решения трансфекции и разбавления сред. Примечание: Мы пренебречь выполнить любую дополнительную регулировку громкости, потому что добавление заместитель в этой концентрации составляет лишь 0,25% от общего объема культура .Это можно изменить выражение, используя низкомолекулярные ингибиторы гликановой обработки. Здесь мы опишем условия для включения 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы, ингибитор гликановой фукозилирования. Мы обнаружили,> снижение фукозилирования 90% путем добавления фукозы аналог при концентрации 250 мкМ в трансфекции и разбавления сред.

Результаты

Экспрессия белка высокого уровня и чистоты

Эта оптимизированная система экспрессии генерируется высокий выход гликозилированного белков. Типичный образец показан в выражении IgG1-Fc (рисунок 1). В этом случае день 0 в день транс...

Обсуждение

Этот протокол иллюстрирует экспрессию белка с помощью переходного трансфекции HEK293F или S клеток. Оптимальные условия трансфекции, установленные в лабораториях Барб и Moremen использовать критическую комбинацию плотности клеток и реагентов концентрации для достижения высокой эффективн?...

Раскрытие информации

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Благодарности

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке грантами K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) и P01GM107012 (KWM) из Национального института здоровья, и средств от Роя Дж Carver Департамента биохимии, биофизики и молекулярной биологии в Университете штата Айова , Содержание данной работы является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Biosafety cabinet NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shakerINFORS HTMultitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium Life Technologies12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium SIGMA14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented CapCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10B
10 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10J
25 ml Disposable serological pipetteFisher Scietific13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blue Solution Thermo Scientific SV30084.01
Counting slides Bio-Rad145-0011
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc.23966Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μMFisher Scietific09-719A
Trisaminomethane (Tris base)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
Yeast extractFluka Analytical 92144
Sodium chlorideBDH chemicalsBDH8014
Plasmid Purification KitQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
CentrifugeThermo Scientific EW-17707-65
Protein A-Sepharose columnSIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycineFisher ScietificBP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters MilliporeUFC901096
Sodium dodecyl sulfateALDRICHL3771
Beta-mercaptoethanolALDRICHM6250
GlycerolSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Acetic Acid, Glacial Fisher Scietific64-19-7
coomassie brilliant blue Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N labeled L-TyrosineALDRICH332151
15N labeled L-LysineALDRICH592900
Unlabeled L-PhenylalanineSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-GlucoseALDRICH389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose SANTA CRUZ Biotechnologysc-283123

Ссылки

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Erratum


Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

106GFcHEK293F HEK293S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены