تسجيل الطباعة الداخلي لقياس النوم في الفئران

Summary

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

Abstract

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

Introduction

في كثير من الأحيان التقدم التقني عجلت قفزات نوعية في فهم العمليات العصبية الحيوية. على سبيل المثال، اكتشاف هانس بيرغر في عام 1929 أن إمكانات الكهربائية المسجلة من فروة الرأس الإنسان اتخذت شكل موجات جيبية، والتردد الذي كان مرتبطا مباشرة إلى مستوى اليقظة من هذا الموضوع، وأدت إلى التقدم السريع في فهم النوم واليقظة تنظيم، في كل من الحيوانات والبشر على حد سواء. ^{1 لهذا} اليوم electroencephlogram (EEG)، بالتزامن مع كهربية (EMG)، أي، النشاط الكهربائي التي تنتجها العضلات والهيكل العظمي، يمثل البيانات "العمود الفقري" للما يقرب من كل التجريبية والسريرية تقييم تسعى إلى ربط السلوك وعلم وظائف الأعضاء مع نشاط الخلايا العصبية القشرية في التصرف الحيوانات، بما في ذلك البشر. في معظم المختبرات البحثية النوم الأساسية يتم تنفيذ هذه التسجيلات EEG باستخدام نظام قائم على كابل (الشكل 1) حيث حصل ديخضع آتا خارج الخط إلى نمط والطيف التحليل [على سبيل المثال، تطبيق تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس) خوارزمية] لتحديد حالة يقظة موضوع يتم تسجيلها. ^2، ويتكون ³ نوم حركة العين السريعة (REM) و غير REM (NREM) النوم. يتميز النوم REM التي كتبها a-الجهد المنخفض السريع EEG، حركة العين بشكل عشوائي، وارتخاء العضلات، وهي الدولة التي بالشلل العضلات بشكل فعال. ومن المعروف النوم REM أيضا النوم المتناقض، لأن نشاط الدماغ يشبه ذلك من اليقظة، في حين أن الجسد هو قطع إلى حد كبير من الدماغ ويبدو أن في نوم عميق. على النقيض من ذلك، يتم تحفيز الخلايا العصبية الحركية أثناء النوم NREM لكن ليس هناك حركة العين. ويمكن تقسيم النوم NREM البشري إلى 4 مراحل، حيث تسمى مرحلة 4 نوم عميق أو نوم الموجة البطيئة والتي حددها كبيرة، وموجات الدماغ بطيئة مع النشاط دلتا بين 0،5-4 هرتز في EEG. من ناحية أخرى، إحدى وحداتها بين مراحل النوم NREM في الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران لالثاني الفئران، لم يثبت، لأن معظمهم ليس لديهم فترات طويلة من النوم الموحدة كما رأينا في البشر.

على مر السنين، وعلى أساس تفسير EEG، عدة نماذج من تنظيم النوم واليقظة، سواء الدارة والقائم على الخلطية، وقد اقترحت. العصبية والأساس الخلوي للحاجة إلى النوم أو، بدلا من ذلك، "حملة النوم،" لا تزال دون حل، ولكن تم تصور كورقة ضغط استتبابي أن يبني خلال فترة الاستيقاظ ويتبدد قبل النوم. نظرية واحدة هي أن العوامل الذاتية somnogenic تتراكم أثناء اليقظة، وأن تراكمها التدريجي هو دعامة من النوم الضغط التماثل الساكن. في حين كان لها الفضل الأول الفرضية الرسمية أن النوم هو تنظمها العوامل الخلطية للعمل روزنباوم التي نشرت في عام 1892 ^4، وكان Ishimori ^{5 و 6 و} Pieron ⁷ الذين مستقل، ومنذ أكثر من 100 سنة، أظهرت وجود المواد الكيميائية التي تعزز النوم. اقترح كل من الباحثين، وثبت في الواقع، أن المواد منومة أو "hypnotoxins" كانت موجودة في السائل الدماغي الشوكي (CSF) من الكلاب بالحرمان من النوم. ⁸ وعلى مدى القرن الماضي عدة مواد منومة المفترضة إضافية المتورطين في عملية التماثل الساكن النوم تم تحديدها (للمراجعة، انظر المرجع 9)، بما في ذلك البروستاغلاندين (PG) D _2، ¹⁰ السيتوكينات، ¹¹ الأدينوزين، ¹² anandamide ^و 13 و الببتيد urotensin الثاني ^(14).

العمل التجريبي قبل إيكونومو ^{15، 16،} Moruzzi وMagoun ^17، وغيرهم في النتائج المبكرة والمتوسطة 20 ^ال تنتج القرن التي ألهمت النظريات القائمة على الدوائر النوم واليقظة، وإلى درجة معينة، طغت نظرية الخلطية ثم السائدة نوم. حتى الآن، العديد من "نماذج الدوائر" وقد اقترحت، كل علم بها بيانات نوعية وكمية متفاوتة (للمراجعة، انظر المرجع 18). نموذج واحدعلى سبيل المثال، يقترح أن يتم إنشاء نوم الموجة البطيئة من خلال بوساطة الأدينوزين تثبيط إطلاق سراح أستيل من الخلايا العصبية كوليني في الدماغ الأمامي القاعدية، وهي منطقة consisiting أساسا من نواة الطرف الأفقي للالفرقة قطري من بروكا وinominata substantia. ¹⁹ نموذج آخر شعبية لتنظيم النوم / الاستيقاظ يصف آلية تبديل الوجه بالتخبط على أساس التفاعلات المثبطة المتبادلة بين الخلايا العصبية الذي يحفز النوم في المنطقة أمام البصرية البطنية الوحشية والخلايا العصبية الذي يحفز أعقاب في جذع تحت المهاد والدماغ. ^{18، 20، 21} وعلاوة على ذلك، لتبديل الدخول والخروج من النوم REM، وقد اقترح تفاعل المثبطة بالتبادل مماثل لمناطق في جذع الدماغ، وهذا هو رمادي بطني المحيطة بالمسال، الجانبية جسري سقيفة، ونواة sublaterodorsal ²² بشكل جماعي، وقد أثبتت هذه النماذج قيمة الاستدلال والأطر التفسيرية المهمة الممنوحة للدراسات في مجال البحوث النوم. ومع ذلك، أنتمور أكمل فهم الآليات الجزيئية ودوائر تنظيم دورة النوم واليقظة تتطلب معرفة أكثر اكتمالا من مكوناته. ينبغي للنظام لتسجيل الطباعة المفصلة أدناه تساعد في تحقيق هذا الهدف.

Protocol

بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات قد وافقت عليها اللجنة تجربة المؤسسي الحيوان في جامعة تسوكوبا.

1. إعداد الأقطاب الكهربائية والكابلات EEG / EMG تسجيلات

1. إعداد EEG / EMG تسجيل الكهربائي وفقا للإجراءات التالية.
   ملاحظة: القطب هو المتاح، ويمكن استخدامها فقط ل1 الحيوان. تخطط بعناية التكوين الأسلاك لجميع الموصلات. وضع علامات على وصلات للالاتجاه الصحيح.
   1. لحام كل طرف من رأس دبوس 4 إلى 2 سم، أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ. وباختصار، عقد واحدة من نهاية السلك إلى دبوس، ضع حام الحديد الساخن على المفصل سلك دبوس، وتذوب بعض حام للتأكد من أن لحام يكفي يسير بشكل سلس في المفصل. يجب الحرص على عدم تطبيق الكثير من الحرارة إلى دبوس. وإلا فإن البلاستيك حول دبابيس تذوب.
   2. لحام خالية من نهاية كل من 2 الأسلاك المعلقة على رأس دبوس في الرأسمن 1.0 ملم القطر الفولاذ المقاوم للصدأ المسمار. وباختصار، عقد نهاية خالية من السلك إلى موضوع تحت رأس المسمار، ضع حام الحديد الساخن على الاسلاك المشتركة المسمار، وتذوب بعض حام للتأكد من أن لحام يكفي يسير بشكل سلس في المفصل. الأسلاك 2 مع مسامير بمثابة أقطاب تسجيل EEG، بينما الأسلاك 2 بدون مسامير بمثابة EMG أقطاب تسجيل.
   3. استخدام مقص لتجريدها من 1 ملم من العزل في نهاية الأقطاب EMG لزيادة جودة الإشارة EMG.
   4. تغطي تماما جميع دبابيس ملحوم مع الايبوكسي لاصقة باستخدام عصا خشبية أو الأسنان معول رقيقة للحد من الضجيج الكهربائي خلال التسجيلات EEG / EMG.
2. إعداد كابل لتوصيل القطب مع عصابة الانزلاق كما هو موضح أدناه. يمكن إعادة استخدامها هذا الكابل.
   1. لحام كل طرف من 4 دبوس FFC / الشركة العامة للفوسفات موصل بسلك من كابلات مسطحة 30 سم. وباختصار، عقد نهاية جردت من الأسلاك إلى دبوس، ضع حام الحديد الساخنعلى الاسلاك المشتركة دبوس، وتذوب بعض جندى لضمان ما يكفي فقط لحام يسير بشكل سلس في المفصل.
      ملاحظة: اختيار طول الكابل المسطح الذي يتناسب مع ارتفاع القفص حيوانات التجارب المستخدمة للتسجيلات EEG / EMG.
   2. لحام تجعيد مآخذ إلى غيض من الأسلاك على الطرف الآخر من كابل مسطح. وباختصار، عقد مأخذ تجعيد إلى نهاية خالية جردت من الأسلاك، ووضع لحام الحديد الساخن على المفصل سلك مأخذ، وتذوب بعض حام للتأكد من أن لحام يكفي يسير بشكل سلس في المفصل.
   3. إدراج كل تجعيد مأخذ الى موقف 4 تجعيد الإسكان.
   4. تغطية كامل تجعيد مآخذ مع الايبوكسي لاصقة باستخدام عصا خشبية أو الأسنان معول رقيقة.

2. زرع الأقطاب الكهربائية في الرأس ماوس (المدة: حوالي 20 دقيقة)

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في حبة تعقيم الساخن قبل الجراحة. تخدير ماوس الذكور (10-20 أسابيع من العمر، 20 - 30 غرام)مع حقنة داخل الصفاق من بنتوباربيتال (50 ملغ / كلغ). بعد التحقق من أن الفأر هو تخدير عميق معسر أخمص القدمين، حلاقة الشعر على الرأس والرقبة مع كليبرز.
2. تحريك الماوس إلى الإطار التجسيمي، وإصلاح الرأس بين القضبان الأذن 2. تطبيق الفازلين على العيون لمنع جفاف. تطهير الجلد حلق مع الكحول وقطع عليه على طول خط الوسط مع مشرط لفضح الجمجمة. مقطع الجلد للحفاظ على منطقة العمليات الجراحية المفتوحة.
3. باستخدام القاطع كربيد (حجم الحفر: 0.8 مم)، وحفر 2 ثقوب في الجمجمة، واحدة فوق المنطقة القشرية الأمامية (1 ملم الأمامي إلى bregma، 1.5 ملم الجانبي لخط الوسط) والآخر على المنطقة الجدارية ( 1 مم وفقا لإحداثيات التجسيمي من Paxinos وفرانكلين سابقة لامدا، 1.5 ملم الجانبي لخط الوسط) من النصف الأيمن، ²³
4. باستخدام مفك صائغ، والمكان الفولاذ المقاوم للصدأ مسامير EEG تسجيل في الثقوب وجعل 2-2،5 يتحول لكل screث لتحديد المواقع فوق الجافية على القشرة.
   ملاحظة: لا إدراج مسامير عميقة جدا لمنع تلف أنسجة المخ. تأكد من أن مسامير ثابتة بإحكام على الجمجمة. هذا من المهم أن يكون إشارات EEG مستقرة خلال فترة طويلة من التسجيلات متعددة (عادة أكثر من 1 في الشهر). مسامير بتلو تنتج القطع الأثرية EEG ويمكن أن تؤتي ثمارها قبل نهاية الموعد المحدد التجريبي.
5. إصلاح التجمع الكهربائي (راجع القسم 1.1، تحولت دبابيس أعلى) مع الغراء لحظة في الجمجمة، وتغطي مع الاسمنت الأسنان. جعل ثقوب صغيرة ثنائي مع ملقط في شبه المنحرفة (الرقبة) العضلات وإدراج الأسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ التي تشكل أقطاب EMG في الثقوب. خياطة الجلد مع خيط الحرير (0.1 مم) لتجنب التعرض للعضلة.
6. إزالة الماوس من الإطار التجسيمي. إدارة الأمبيسلين (100 ملغ / كلغ) وميلوكسيكام (1 ملغ / كلغ) البريتونى على الماوس لتجنب العدوى البكتيرية وتقليل الألم بعد الجراحة، على التوالي. كهEP الماوس على وسادة الحرارة ومراقبة حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. بيت الماوس بشكل فردي خلال الانتعاش لتجنب إزالة من الأقطاب الكهربائية من قبل الحيوانات الأخرى، وتدير ميلوكسيكام (1 ملغ / كلغ) البريتونى في اليوم الأول بعد الجراحة.

3. تسجيل والحصول EEG / EMG البيانات

1. بعد فترة نقاهة 1-الاسبوع، بيت كل فأر على حدة في قفص التجريبية وضعت في غرفة تسجيل عازلة للصوت. الحفاظ على درجة حرارة الغرفة من 23 ± 1 درجة مئوية، وتلقائيا السيطرة على دورات من 12 ساعة ضوء / 12 ساعة الظلام (أضواء على الساعة 08:00، شدة الإضاءة ~ 100 لوكس).
2. ربط التجمع الكهربائي EEG / EMG على رأسه الماوس إلى كابل تسجيل. تأكد من توصيل كابل لتسجيل حلقة الانزلاق (الذي تم تصميمه بحيث لا تقتصر حركات الماوس عن طريق التواء كابل) ومكبر للصوت إشارة EEG / EMG. مرشح EEG / EMG إشارات (EEG، 0،5-64 هرتز. EMG، 16-64 هرتز)، رقمنة بمعدل عينة من 128 هرتز قبل تحويل التناظرية إلى الرقمية (A / D) وسجل في النهاية على كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل EEG / EMG برنامج تسجيل (جدول 'المواد'، دخول 4 ^عشر من أسفل).
3. روض الماوس ل2-3 أيام في غرفة تسجيل. إذا كان تسجيل EEG / EMG يشمل الإدارات المخدرات داخل الصفاق، والتعامل بلطف الماوس في كل يوم التعود على وقت تناول الدواء.
4. وفي وقت لاحق، بدء EEG / EMG تسجيل برنامج (جدول 'المواد'، دخول ^ال 4 من الأسفل).
   1. حدد علامة التبويب "ملف بيانات المعلومات" وانقر على المربع بجانب اسم الملف. أدخل اسم الملف ثم انقر فوق "حفظ".
   2. حدد علامة التبويب "تسجيل حالة" وتحديد جميع القنوات EEG / EMG التي سيتم تسجيلها.
   3. حدد تردد أخذ العينات (128 هرتز) في علامة التبويب "حالة تسجيل.
   4. معرفة ما اذا كان يتم عرض القنوات المختارة بشكل صحيح في ال"معلومات قناة" علامة التبويب البريد.
   5. حدد علامة التبويب "إعداد الموقت" وانقر على "مراقب" لعرض EEG وEMG.
   6. معرفة ما اذا كان يتم عرض إشارات EEG / EMG بشكل صحيح.
   7. حدد علامة التبويب "إعداد الموقت" وتعيين وقت على مدار الساعة لبداية ونهاية التسجيل في المجال 'الموقت الرئيسية.
   8. انقر على "مراقب" في علامة التبويب "إعداد الموقت" لبدء التسجيل.
5. سجل EEG / EMG إشارات تحت خط الأساس (أي.، سلوك النوم / اعقاب ماوس يتصرف بحرية) والشروط معاملة مختلفة (على سبيل المثال، إدارة الكافيين أو المعاملة صورية) على مدى عدة أيام. الموت ببطء الفأر مع حقنة داخل الصفاق من بنتوباربيتال (200 ملغ / كلغ) بعد يوم تجريبي الماضي.

4. تحديد درجات السلوكية الدولة بناء على EEG / EMG البيانات

1. بدء برنامج لتحليل EEG / EMG (جدول 'المواد'، دخول ^ال 4 من الأسفل). فتح البيانات الخام EEG / EMG (ملف .kcd) المنتجة في إطار الخطوة 3. انقر فوق علامة التبويب "النوم"، ثم حدد الوقت الحقبة. تحديد 10 ثانية.
2. انقر فوق علامة التبويب "النوم" وحدد "متعدد فحص" ليسجل تلقائيا كل العهود 10 ثانية إلى 3 مراحل (أي.، NREM والنوم REM، واليقظة) على أساس سعة من EEG وEMG والتحليل الطيفية من EEG. ³
3. انقر على "حالة الاتحاد الفرنسي للتنس للEEG".
4. تعيين المعلمات لتحليل الطيفية [256 نقطة مسند (الموافق 2 ثانية من EEG)، هانينج وظيفة النافذة، ومتوسط ​​5 الأطياف في عصر]. ^{3 انقر على} "موافق".
5. انقر فوق "ابدأ الفحص" لبدء الفحص التلقائي. فتح البيانات وسجل (ملف .raf).
6. تحقق نتائج الفحص التلقائي، وإذا لزم الأمر، تصحيحها يدويا على أساس المعايير القياسية (انظر ممثل النتائج، 1B الشكل والجدول 1 ). ^{2، 3} لفترة وجيزة، انقر فوق والاستمرار على زر الماوس الأيسر على عصر تسجيل بشكل غير صحيح واسحب المؤشر عبر سلسلة من العهود تسجيل بشكل غير صحيح. الافراج عن زر الماوس الأيسر واختر الدولة السلوكية الصحيحة في نافذة منبثقة.
   ملاحظة: أحيانا، العهود في الانتقال بين دولتين يقظة يصعب يسجل بشكل لا لبس فيه لدولة واحدة. في مثل هذه الحالات، يجب أن يكون سجل العصر للدولة المزعومة وينبغي أن تطبق نفس المعايير على العهود مماثلة في كافة مراحل التجربة لضمان استنساخ البيانات.

النتائج

يوضح الشكل 1B أمثلة من الماوس EEG في دول اليقظة مختلفة. كما هو مبين في الجدول رقم 1، تصنف العهود كما النوم NREM إذا تبين EEG كبيرة، وموجات الدماغ بطيئة مع إيقاع الدلتا أقل من 4 هرتز وEMG ليس لديها سوى إشارة ضعيفة أو معدومة. تصنف العهود كما ال?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول مجموعة المتابعة للتسجيلات EEG / EMG التي تسمح للتقييم النوم واليقظة تحت ضجيج منخفض وظروف فعالة من حيث التكلفة، والإنتاجية العالية. ونظرا لصغر حجم الرأس الكهربائي EEG / EMG التجمع، وهذا النظام يمكن الجمع بين غرسات أخرى لإجراء التجارب داخل الدماغ، بما في ذ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-pin header	Hirose	A3B-4PA-2DSA(71)
Ampicillin	Meiji Seika
Analog-to-digital converter	Contec	AD16-16U(PCIEV)
Caffeine	Sigma	C0750
Carbide cutter	Minitor	B1055
Crimp housing	Hirose	DF11-4DS-2C
Crimp socket	Hirose	DF11-30SC
Dental cement (Toughron Rebase)	Miki Chemical Product
Epoxy adhesive	Konishi	#16351
FFC/FPC connector	Honda Tsushin Kogyo	FFC-10BMEP1(B)
Flat cable	Hitachi Cable	20528-ST LF
Instant glue (Aron Alpha A)	Toagosei	N/A
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	N/A
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
Signal amplifier	Biotex	N/A
Sleep recording chamber	APL	N/A
SleepSign software	Kissei Comtec	N/A	for EEG/EMG recording/analysis
Slip ring	Biotex	N/A
Stainless steel screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 × 2.0
Stainless steel wire	Cooner Wire	AS633