Farelerde Uyku Ölçüm Basım Kayıt Prosedürü

Özet

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

Özet

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

Giriş

Teknik gelişmeler sık ​​sık nörobiyolojik süreçler anlayış atılımlar çöktürülmüş var. Örneğin, insan derisi kaydedilen elektrik potansiyelleri sinüs dalgalarının şeklini aldı 1929 yılında Hans Berger keşif, sıklığı, doğrudan konunun uyanıklık düzeyi ile ilgilidir, uyku-uyanıklık anlayışı hızlı ilerlemelere yol açmıştır hem hayvanlarda ve insanlarda hem de düzenleme. ¹ Bu gün electroencephlogram (EEG) için, elektromyogram (EMG), yani. ile birlikte, iskelet kasları tarafından üretilen elektriksel aktivite, neredeyse her deneysel ve klinik verileri "omurga" temsil insanlar dahil, hayvanlar davranıyor kortikal nöronların aktivitesi ile davranış ve fizyoloji ilişkilendirmek istiyor değerlendirmesi. En temel uyku araştırma laboratuvarlarında bu EEG kayıtları d edinilen burada bir kablo tabanlı sistemi (Şekil 1) kullanılarak gerçekleştirilenata desen ve spektrum analizi off-line tabi [örneğin., bir hızlı Fourier (FFT) algoritması dönüşümü uygulayarak] konunun uyanıklık durumu kaydediliyor belirlemek için. ^{2, 3} Uyku hızlı göz hareketi oluşur (REM) ve REM olmayan (NREM) uyku. REM uykusu hızlı bir düşük voltaj EEG, rastgele göz hareketi ve kas atonia, kaslar etkin bir felç olduğu bir devlet ile karakterizedir. Vücut beyinden ölçüde kesilir ve derin uykuda gibi görünüyor, oysa beyin aktivitesi, bu uyanıklık benzer, çünkü REM uykusunda da, paradoksal uyku olarak bilinir. Buna karşılık, motor nöronlar NREM uyku sırasında uyarılır ama hiçbir göz hareketi yoktur. EEG 4 Hz - İnsan NREM uykusu evre 4 derin uyku veya yavaş dalga uykusu denir ve 0.5 arasındaki delta aktivitesi ile Büyük, yavaş beyin dalgaları ile tanımlanır sayede 4 aşamada, ayrılabilir. Öte yandan, sıçanlar a gibi küçük hayvanlarda NREM uykusu fazlar arasında, bir alt bölümü,nd fareler, insanlarda görüldüğü gibi onlar uyku uzun konsolide dönemleri yok çünkü çoğunlukla kurulmamıştır.

Yıllar geçtikçe, ve EEG yorumuna dayanarak, uyku-uyanıklık düzenlemenin çeşitli modeller, devre ve humoral tabanlı hem de ileri sürülmüştür. Nöral ve uyku ya da alternatif olarak, gerek hücresel temeli "uyku sürücü" çözümsüz kalır, ama uyanık döneminde inşa eder ve uyku ile harcanmış bir homeostatik basıncı olarak kavramsallaştırma edilmiştir. Bir teoriye göre endojen somnogenic faktörler uyanıklık sırasında ve kademeli birikimi uyku homeostatik basınç destekleyen olduğunu birikir olmasıdır. Humoral faktörler tarafından düzenlenir uyku ilk resmi hipotez 1892 ⁴ yayınlanan Rosenbaum'un çalışmaları alacak olsa da, bu Ishimori ^{5, 6} ve bağımsız pieron ⁷ oldu ve 100 yıl önce, uyku teşvik kimyasalların varlığını gösterdi. Her iki araştırmacılar hypnogenic maddeler veya 'hypnotoxins' uykusuz köpeklerin beyin omurilik sıvısı (BOS) mevcut olduğunu, önerilen ve gerçekten kanıtladı. ⁸ Geçtiğimiz yüzyılda uyku homeostatik süreçte rol birkaç ek varsayımsal hypnogenic maddeler tespit edilmiştir (inceleme için, ref. 9), prostaglandin (PG) D _2, ^10, sitokinler, adenosin ^{11, 12} anandamid, ^{13 ve} Ürotensin II peptidi de dahil olmak üzere. ¹⁴

Belli bir dereceye kadar uyku ve uyanıklık ve devre tabanlı teoriler ilham erken ve orta-20 ^yüzyılda üretilen bulgular Economo ^{15, 16,} MORUZZI ve Magoun ^17, ve diğerleri tarafından deneysel çalışmalar, daha sonra hakim hümoral teorisini gölgesinde uyku. Bugüne kadar, birkaç "Devre modeller" Her (inceleme için, ref. 18) nitelik ve nicelik değişen verilerle haberdar öne sürülmüştür. Bir modelÖrneğin, yavaş dalga uykusu bazal ön, bir alan esas olarak Broca diyagonal bant ve substantia inominata yatay bacağının çekirdeğinin consisiting kolinerjik nöronların asetilkolin salımının adenosin aracılı inhibisyonu yoluyla oluşturulur önermektedir. uyku / uyanıklık regülasyonu ¹⁹ başka popüler bir model hipotalamus ve beyin sapındaki ventrolateral preoptik alanda uyku uyaran nöronlar arasındaki karşılıklı etkileşim ve inhibitör uyandırma uyaran nöronlar temelinde bir flip-flop anahtar mekanizmasını anlatır. ^{18, 20, 21} Ayrıca, ve REM uykusu üzerinden geçiş için, benzer bir karşılıklı etkileşim önleyici beyin sapında alanlar için önerilmiştir, bu ventral periakuaduktal gri yanal tegmentumda ve sublaterodorsal çekirdektir. ²² Toplu olarak, bu modeller değerli olduğu kanıtlanmıştır heuristics ve uyku araştırma çalışmaları için tanınan önemli açıklayıcı çerçeveler; Bununla birlikte, bir yeuyku-uyanıklık döngüsünü düzenleyen moleküler mekanizmaları ve devrelerin t dolgun anlayışı bileşenlerinin daha eksiksiz bir bilgi gerektirir. Aşağıda ayrıntılı Basım kayıt için sistem bu hedefe yardımcı olmalıdır.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Tsukuba Üniversitesi Kurumsal Hayvan Deney Komitesi tarafından onaylanmıştır.

EEG / EMG Recordings 1. Elektrotların hazırlanması ve Kablolar

1. Aşağıdaki prosedüre göre EEG / EMG kayıt elektrot hazırlayın.
   Not: Elektrot tek ve 1 hayvan için sadece kullanılabilir. Dikkatlice tüm bağlantı için kablo yapılandırmasını planlayın. Doğru yönlendirme için konnektörleri işaretleri yerleştirin.
   1. 2 cm paslanmaz çelik tel bir 4 pinli başlığın her pimi lehimleyin. Kısaca, pin telin bir ucunu tutun tel-pin eklem üzerine sıcak havyaya yerleştirin ve bu sadece yeterli lehim eklem içine sorunsuz sağlamak için bazı lehim eriyerek. Pin çok fazla ısı uygulamak için dikkatli olun; Aksi takdirde, pimleri etrafında plastik eriyecek.
   2. Kafasına iğne başlığına bağlı 2 teller her serbest ucunu lehim1.0 mm çapında paslanmaz çelik vida. Kısaca, vida başının altına Konuya telin serbest ucunu tutun tel vida eklem üzerine sıcak havyaya yerleştirin ve bu sadece yeterli lehim eklem içine sorunsuz sağlamak için bazı lehim eriyerek. Vida olmadan 2 teller EMG kayıt elektrotları olarak hizmet ise vidalarla 2 tel, EEG kayıt elektrotları olarak hizmet vermektedir.
   3. EMG sinyalinin kalitesini artırmak için EMG elektrotları sonunda yalıtım 1 mm kapalı şerit makas kullanın.
   4. Tamamen EEG / EMG kayıtları sırasında elektrik gürültüsünü azaltmak için ince bir tahta sopa ya da diş çekme kullanılarak epoksi yapıştırıcı ile tüm lehimli işaretçilerine kapsamaktadır.
2. Aşağıda tarif edildiği gibi kayma halkasına elektrodu bağlamak için bir kablo hazırlayın. Bu kablo, yeniden kullanılabilir.
   1. 30-cm düz kablonun bir tel ile bir 4-pin FFC / FPC bağlacının her iki pimi lehimleyin. Kısaca, pin tel soyulmuş ucunu tutun sıcak havyaya yerleştirmekTel-pin eklem üzerine ve yeterli lehim eklem içine sorunsuz bir şekilde yürütülebilmesi için bazı lehim eriyerek.
      Not: EEG / EMG kayıtları için kullanılan deneysel hayvan kafes yüksekliği için uygun olan yassı kablo uzunluğunu seçin.
   2. Lehim düz kablonun diğer ucundaki bir tel ucuna yuva kıvrım. Kısaca, tel elimden serbest ucuna bir kıvrım soket tutun tel soket eklem üzerine sıcak havyaya yerleştirin ve bu sadece yeterli lehim eklem içine sorunsuz sağlamak için bazı lehim eriyerek.
   3. Her bir mahfaza kıvrım 4-konumuna yuva kıvrım yerleştirin.
   4. Tamamen ince tahta sopa ya da diş çekme kullanılarak epoksi yapıştırıcı ile yuva kıvrım kapsamaktadır.

Fare Head Elektrotların 2. implantasyonu (Süre:. Yaklaşık 20 dk)

1. Ameliyat öncesi sıcak bir boncuk sterilizatör tüm cerrahi aletler sterilize edin. Bir erkek fare anestezisi (10-20 haftalık, 20-30 g)pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu (50 mg / kg) ile. Fare derinden bir ayak kısma anestezi olduğunu kontrol ettikten sonra, kesme makineleri ile baş ve boyun üzerinde saç tıraş.
2. Stereotaksik çerçeve için fareyi hareket ettirin ve 2 kulak çubukları arasındaki kafa düzeltmek. Kuruluğunu önlemek için gözleri vazelin sürün. Alkol ile traş-cildi temizlemek ve kafatası açığa çıkarmak için bir neşter ile orta hat boyunca kesmek. Açık cerrahi alana tutmak için cildi Clip.
3. (Matkap 2 delik kafatası içine, frontal kortikal alana bir (bregmaya 1 mm anterior, orta hatta 1,5 mm lateral) ve parietal alan üzerinde diğer: karbür kesici (0.8-mm çaplı matkap boyutu) kullanarak Paxinos ve Franklin stereotaksik koordinatlarına göre sağ yarımkürenin lambda 1 mm anterior lateral 1,5 mm orta hat için). ²³
4. Her bağırıyorum 2.5 döner - bir kuyumcuya vida sürücüsünü kullanarak, delikleri yer paslanmaz çelik EEG kayıt vida ve 2 yapmakkorteks üzerinde epidural konumlandırma için w.
   Not: beyin dokusunun zarar görmesini önlemek için çok derin vidayı takmayın. Vidalar sıkıca kafatası sabit olup olmadığını kontrol edin. Bu çoklu kayıtları (genellikle en fazla 1 ay) uzun bir süre boyunca sabit EEG sinyallerini olması önemlidir. Wiggly vidaları EEG eserler üretmek ve deneysel programının sona ermesinden önce kapalı gelebilir.
5. Elektrot düzeneğini Fix kafatası anında yapıştırıcı ile (bkz Bölüm 1.1, pim yukarı döndü) ve diş çimento ile kaplayın. Trapez (boyun) kaslar forseps ile bilateral küçük delik açın ve deliklere EMG elektrotları olarak hizmet paslanmaz çelik teller yerleştirin. Kas maruz kalmasını önlemek için ipek iplik (0.1 mm çap) ile cilt dikin.
6. Stereotaksik çerçeve fareyi çıkarın. Bakteriyel enfeksiyonu önlemek için fare, ampisilin (100 mg / kg) ve intraperitoneal olarak meloksikam (1 mg / kg) yönetir ve sırasıyla ameliyat sonrası ağrıyı azaltmak için. Keısı yastığı üzerinde fare ep ve sternum yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar onu izleriz. Ev ayrı kurtarma sırasında fare diğer hayvanlar tarafından elektrotların kaldırılmasını önlemek ve ameliyat sonrası birinci günde intraperitoneal meloksikam (1 mg / kg) yönetmek için.

3. Kayıt ve kavranması EEG / EMG Veri

1. 1 haftalık iyileşme dönemi, ev ses geçirmez bir kayıt odasına yerleştirilen deneysel kafeste tek tek her bir fare sonra. 12 saat ışık / 12 saat karanlık döngüleri kontrol otomatik olarak 23 ± 1 ° C ortam sıcaklığı korumak ve (aydınlatma yoğunluğu ~ 100 lux, 08:00 ışıklar).
2. Bir kayıt kablosu fare kafasına EEG / EMG elektrot düzeneğini takın. Kayıt kablosu (fare hareketleri kablo büküm ile sınırlı değildir böylece tasarlanmış) bir kayma halkası ve EEG / EMG sinyal yükseltici bağlı olduğundan emin olun. Filtre EEG / EMG sinyalleri (EEG, 0,5-64 Hz, EMG, 16-64 Hz), bir analog-dijital dönüştürücü (A / D) 128 Hz örnekleme hızında dijital ortama aktarmak ve nihayet EEG / EMG kayıt yazılımını çalıştıran bir bilgisayarda (Table 'Malzeme' ^4. girişi üzerine kayıt alttan).
3. Kayıt odasına 3 gün - 2 için fare alıştırmak. EEG / EMG kayıt intraperitoneal ilaç yönetimleri içeriyorsa, yavaşça ilaç uygulama sırasında her alışkanlık gününde fareyi anlaştım.
4. Daha sonra, EEG / EMG kayıt yazılımı (Table 'Materyalleri', alttan ^4. entry) başlatın.
   1. 'Veri dosya bilgileri' sekmesini seçin ve dosya adının yanındaki kutuyu tıklatın. Bir dosya adı girin ve 'Kaydet'i tıklayın.
   2. 'Kayıt koşul' sekmesini seçin ve kaydedilecek tüm EEG / EMG kanalları seçmek.
   3. 'Kayıt koşulu' sekmesinde örnekleme frekansı (128 Hz) seçin.
   4. Seçilen kanallar inci düzgün görüntülenen olup olmadığını kontrol edine 'Kanal bilgisi' sekmesi.
   5. 'Timer ayarı' sekmesini seçin ve EEG ve EMG görüntülemek için 'Monitor' tıklayın.
   6. EEG / EMG sinyalleri doğru görüntülenir olup olmadığını kontrol edin.
   7. 'Timer ayarı' sekmesini seçin ve 'Ana Timer' alanında kaydın başlangıcı ve sonu için saat saatini ayarlayın.
   8. Kayıt işlemini başlatmak için 'Zamanlayıcı ayarı' sekmesinde 'Monitor' tıklayın.
5. Başlangıçta altında Tutanak EEG / EMG sinyalleri (yani., Serbestçe davranmak fare uyku / uyanıklık davranışı) ve farklı tedavi koşulları (örn., Kafein idaresi veya sahte tedavisi) birkaç gün içinde. Son deney gününde sonra, pentobarbital intraperitonal enjeksiyon ile (200 mg / kg) ile fare öldürülür.

EEG / EMG Veri dayanarak Davranış Devletin 4. Puanlama

1. EEG / EMG analizi için yazılımını başlatın (Table 'Malzeme', alttan ^4. girişi). 3. adımda altında üretilen EEG / EMG ham verileri (.kcd dosyası) açın 'Sleep'in' sekmesini tıklayın ve Epoch zamanı seçin. 10 sn seçin.
2. 'Sleep'in' sekmesini tıklayın ve otomatik olarak 3 aşamaya 10 sn dönemini puanı 'Multi-tarama' seçeneğini (yani., NREM ve REM uyku, uyanıklık ve) EEG ve EMG ve güç spektral analizi genliklerinin temelinde EEG. ³
3. 'EEG için FFT koşulu tıklayın.
4. Güç spektral analiz parametrelerini ayarlayın [256 datum noktaları, Hanning pencere fonksiyonu ve çağın başına 5 spektrumları ortalamasına (2 EEG sn karşılık gelen)]. ³ 'Tamam'ı tıklayın.
5. Tıklayın, otomatik tarama başlatmak için 'Tarama Başlat'. Attı verileri (.raf dosyası) açın.
6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1B ve Tablo 1 (otomatik tarama sonuçlarını kontrol edin ve gerekirse standart kriterlere dayalı elle düzeltin ). ^{2, 3} Kısaca, tıklayın ve bir yanlış sonucu çağında sol fare tuşunu basılı tutun ve yanlış sonucu dönemini dize boyunca imleci sürükleyin. Sol fare tuşunu bırakın ve pop-up pencerede doğru davranış durumu seçin.
   Not: Bazen, iki uyanık devletler arasındaki geçişte dönemini, bir devlete açıkça puanı zordur. Bu gibi durumlarda, dönem görünüşte duruma atılır olmalı ve aynı kriterler verileri yeniden üretilebilirlik sağlamak için deney boyunca benzer dönemini uygulanmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1B farklı uyanıklık durumlarında fare EEG örneklerini göstermektedir. Tablo 1'de görüldüğü gibi EEG 4 Hz altındaki bir delta ritimle büyük, yavaş beyin dalgaları gösterir ve EMG sadece zayıf ya da hiç sinyal varsa, dönemini NREM uyku olarak sınıflandırılır. EEG 6 ve 10 Hz arasındaki teta aralığında hızlı alçak gerilim beyin dalgaları gösterir ve EMG düşük genlik gösterirse dönemini REM uykusu olarak sın?...

Tartışmalar

Bu protokol, düşük gürültü, düşük maliyetli ve yüksek verimli koşullarda uyku ve uyanıklık değerlendirilmesini sağlar EEG / EMG kayıtları için bir set-up açıklar. Nedeniyle EEG / EMG elektrot kafa grubunun küçük boyutu, bu sistem fare içine ilaçların optogenetics (fiber optik implantasyon) ya da, birlikte eş zamanlı kanül implantasyonu ile, mikroinfüzyon dahil içi beyin deneyleri için diğer implantlar ile kombine edilebilir İlave elektrik sinyalleri (örn., kontralateral EEG, e...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-pin header	Hirose	A3B-4PA-2DSA(71)
Ampicillin	Meiji Seika
Analog-to-digital converter	Contec	AD16-16U(PCIEV)
Caffeine	Sigma	C0750
Carbide cutter	Minitor	B1055
Crimp housing	Hirose	DF11-4DS-2C
Crimp socket	Hirose	DF11-30SC
Dental cement (Toughron Rebase)	Miki Chemical Product
Epoxy adhesive	Konishi	#16351
FFC/FPC connector	Honda Tsushin Kogyo	FFC-10BMEP1(B)
Flat cable	Hitachi Cable	20528-ST LF
Instant glue (Aron Alpha A)	Toagosei	N/A
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	N/A
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
Signal amplifier	Biotex	N/A
Sleep recording chamber	APL	N/A
SleepSign software	Kissei Comtec	N/A	for EEG/EMG recording/analysis
Slip ring	Biotex	N/A
Stainless steel screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 × 2.0
Stainless steel wire	Cooner Wire	AS633