Procedimento de gravação Polygraphic para medição Sleep in Mice

Resumo

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

Resumo

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

Introdução

Os avanços técnicos, muitas vezes precipitado saltos quânticos na compreensão dos processos neurobiológicos. Por exemplo, a descoberta de Hans Berger em 1929 que potenciais elétricos gravados a partir do couro cabeludo humano tomou a forma de ondas senoidais, cuja frequência foi diretamente relacionada com o nível de vigília do sujeito, levou a avanços rápidos na compreensão de sono-vigília regulação, tanto em animais e humanos. ¹ Para este dia o electroencephlogram (EEG), em conjunto com o eletromiograma (EMG), ie., a atividade elétrica produzida pelos músculos esqueléticos, representa os dados "espinha dorsal" de quase todas as experimental e clínica avaliação que visa correlacionar o comportamento e fisiologia com a actividade de neurónios corticais em comportando animais, incluindo os seres humanos. Na maior parte dos laboratórios de pesquisa de base de sono de EEG estas gravações são efectuadas por utilização de um sistema à base de cabo (Figura 1), em que d adquiridaATA é sujeito fora de linha com o padrão e o espectro de análise [por exemplo., a aplicação de uma transformada de Fourier rápida (FFT)] para determinar o estado de vigilância do objecto a ser gravado. ^{2, 3} sono consiste de movimento rápido dos olhos (REM) e não-REM (NREM). O sono REM é caracterizado por uma rápida baixa tensão EEG, o movimento dos olhos aleatório, e atonia muscular, um estado em que os músculos estão efetivamente paralisado. Sono REM é também conhecido como o sono paradoxal, porque a actividade cerebral assemelha-se do estado de vigília, enquanto que o corpo é em grande parte desconectada do cérebro e parece estar em sono profundo. Em contrapartida, os neurônios motores são estimulados durante o sono NREM, mas não há nenhum movimento do olho. NREM humano pode ser dividido em 4 etapas, sendo que a fase 4 é chamado de sono profundo ou sono de ondas lentas e é identificado por ondas cerebrais grandes e lentos com atividade delta entre 0,5-4 Hz no EEG. Por outro lado, uma subdivisão entre as fases de sono NREM, em pequenos animais, como os ratos de umaND ratinhos, não foi estabelecida, principalmente porque eles não têm períodos longos de sono consolidado como pode ser visto nos seres humanos.

Ao longo dos anos, e com base na interpretação do EEG, vários modelos de regulação do sono-vigília, ambos circuitos ou à base humoral, foram propostos. O neural e bases celulares da necessidade de sono ou, em alternativa, "movimentação do sono," continua por resolver, mas tem sido conceituada como uma pressão homeostática que constrói durante o período de vigília e é dissipada pelo sono. Uma teoria é que os fatores endógenos somnogenic acumular durante a vigília e que a sua acumulação gradual é a base de sono pressão homeostática. Enquanto a primeira hipótese formal de que o sono é regulado por fatores humorais foi creditado ao trabalho de Rosenbaum publicado em 1892 ^4, foi Ishimori ^{5, 6 e} Pieron ⁷ que de forma independente, e mais de 100 anos atrás, demonstrou a existência de produtos químicos para promover o sono. Ambos os pesquisadores propuseram, e de fato provado, que as substâncias hipnogênicos ou 'hypnotoxins' estavam presentes no cerebral fluido espinhal (CSF) de cães privados de sono. ⁸ Ao longo do século passado várias substâncias hipnogênicos putativos adicionais implicados no processo homeostático do sono foram identificados (para revisão, ver ref. 9), incluindo prostaglandina (PG) D _2, ¹⁰ citocinas, ¹¹ adenosina, anandamida ^{12, 13} e o péptido de urotensina II. ¹⁴

O trabalho experimental por Economo ^{15, 16,} Moruzzi e Magoun ^17, e outros nos resultados produzidos início e meados de ^século 20 que inspirou teorias baseados em circuitos de sono e vigília e, até certo ponto, ofuscou a teoria humoral então prevalecente de dorme. Até à data, vários "modelos de circuito" têm sido propostas, cada informados por dados de diferentes graus de qualidade e quantidade (para revisão, ver ref. 18). Um modelo, Por exemplo, propõe que o sono de ondas lentas é gerado através da inibição mediada por adenosina da libertação de acetilcolina a partir de neurónios colinérgicos no prosencéfalo basal, uma área constituídos com, principalmente, do núcleo do membro horizontal da banda diagonal de Broca e o inominata substância. ¹⁹ Outro modelo popular de regulação do sono / vigília descreve um mecanismo interruptor flip-flop com base em interações mutuamente inibitórios entre os neurônios indutores do sono na área pré-óptica ventrolateral e neurônios indutores de vigília no tronco hipotálamo e cérebro. ^{18, 20, 21} Além disso, para a comutação de entrada e saída de sono REM, uma interacção mutuamente inibidora semelhante foi proposta para as zonas no tronco cerebral, que é a cinza ventral periaquedutal, tegmento da ponte lateral e núcleo sublaterodorsal. ²² Em conjunto, estes modelos têm provado serem valiosos heurísticas e oferecidas estruturas interpretativas importantes para estudos de pesquisa do sono; no entanto, um yet mais completa compreensão dos mecanismos moleculares e circuitos que regulam o ciclo vigília-sono vai exigir um conhecimento mais completo de seus componentes. O sistema de registo polygraphic detalhado abaixo devem ajudar neste objetivo.

Protocolo

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Experimentação Animal da Universidade de Tsukuba.

1. Preparação de eletrodos e cabos de EEG / EMG Recordings

1. Prepare eléctrodo de registo de EEG / EMG de acordo com o seguinte procedimento.
   Nota: O eléctrodo é descartável e pode ser usado somente para um animal. Planejar cuidadosamente a configuração de fiação para todos os conectores. Coloque marcas nos conectores para a orientação correta.
   1. Solde cada pino de um cabeçalho de 4 pinos para um fio de aço inoxidável de 2 cm. Em breve, segure uma extremidade do fio para o pino, coloque um ferro de solda quente para o conjunto do fio-pin, e derreter um pouco de solda de solda para garantir que apenas o suficiente corre sem problemas na articulação. Tenha cuidado para não aplicar muita calor para o pino; caso contrário, o plástico em torno dos pinos vai derreter.
   2. Soldar a extremidade livre de cada um de 2 fios ligados ao cabeçalho pino na cabeçade um parafuso de aço inoxidável de 1,0 mm de diâmetro. Em breve, segure a extremidade livre do fio para o segmento abaixo da cabeça do parafuso, coloque um ferro de solda quente para o conjunto do fio de rosca, e derreter um pouco de solda de solda para garantir que apenas o suficiente corre sem problemas na articulação. Os 2 fios com parafusos servem como eletrodos de registro EEG, enquanto que os 2 fios sem parafusos servir como EMG eletrodos de registro.
   3. Utilize uma tesoura para retirar 1 mm do isolamento na extremidade dos eléctrodos EMG para aumentar a qualidade do sinal de EMG.
   4. Completamente cobrir todos os pinos soldados com adesivo epóxi usando uma vara ou dente de madeira palheta fina para reduzir o ruído elétrico durante as gravações EEG / EMG.
2. Preparar um cabo para a ligação do eléctrodo com o anel de deslizamento, tal como descrito abaixo. Este cabo pode ser reutilizado.
   1. Solde cada pino de um conector FFC / FPC 4 pinos com um fio de um cabo plano de 30 cm. Em breve, segure a extremidade descascada do fio para o pino, coloque um ferro de solda quentepara o conjunto do fio-pin, e derreter um pouco de solda para garantir que apenas solda suficiente corre sem problemas na articulação.
      Nota: Escolha o comprimento do cabo plano que é apropriado para a altura da gaiola animal experimental usado para gravações de EEG / EMG.
   2. Solda friso tomadas a uma ponta de um dos fios sobre a outra extremidade do cabo chato. Em breve, realizar uma tomada friso para a extremidade livre listrada do fio, coloque um ferro de solda quente para o conjunto do fio-socket, e derreter um pouco de solda para garantir que apenas solda suficiente corre sem problemas na articulação.
   3. Insira cada tomada em um friso de 4 posições friso habitação.
   4. Completamente cobrir o friso soquetes com adesivo epóxi usando uma vara ou dente de madeira palheta fina.

2. Implantação de eletrodos na cabeça de rato (Duração: Aprox. 20 min)

1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em um esterilizador quente talão antes da cirurgia. Anestesiar um rato do sexo masculino (10 - 20 semanas de idade, 20 - 30 g)com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Depois de verificar que o rato está profundamente anestesiados por beliscar um dedo do pé, raspar o cabelo na cabeça e no pescoço com clippers.
2. Mova o mouse para o quadro estereotáxico, e fixar a cabeça entre as 2 barras de ouvido. Aplique vaselina sobre os olhos para prevenir o ressecamento. Limpar a pele raspada com álcool e cortá-la ao longo da linha média com um bisturi para expor o crânio. Clipe da pele para manter a área cirúrgica aberta.
3. Utilizando um cortador de carboneto de (tamanho da broca: 0,8 mm de diâmetro), broca 2 furos no crânio, uma sobre a área cortical frontal (1 mm anterior ao bregma, 1,5 mm lateral à linha média) e o outro através da zona parietal ( 1 milímetro anterior à lambda, 1,5 mm lateral a linha média) do hemisfério direito, de acordo com coordenadas estereotáxica de Paxinos e Franklin. ²³
4. Usando uma chave de fenda de um joalheiro, aço inoxidável lugar EEG gravação parafusos nos furos e fazer 2 - 2,5 voltas para cada screw para o posicionamento peridural sobre o córtex.
   Nota: Não insira parafusos demasiado profundas para evitar danos ao tecido cerebral. Verifique se os parafusos estão firmemente fixos no crânio. Isto é importante para ter sinais de EEG estáveis ​​durante um longo período de várias gravações (tipicamente, mais de 1 mês). Parafusos Wiggly produzir artefatos de EEG e pode sair antes do final do calendário experimental.
5. Fixe o conjunto do eléctrodo (cf. Seção 1.1, pinos voltados para cima) com cola instantânea ao crânio e cobrir com cimento dental. Faça bilateralmente pequenos orifícios com uma pinça nos (pescoço) trapézio e inserir os fios de aço inoxidável, que servem como eletrodos EMG nos orifícios. Suturar a pele com um fio de seda (0,1 mm de diâmetro) a fim de evitar exposição do músculo.
6. Retirar o mouse do quadro estereotáxico. Administrar ampicilina (100 mg / kg) e meloxicam (1 mg / kg) por via intraperitoneal para o rato a fim de evitar a infecção bacteriana e para reduzir a dor pós-cirúrgica, respectivamente. Keep o mouse sobre uma almofada de calor e monitorá-lo até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Casa do rato individualmente durante a recuperação para evitar a remoção dos eléctrodos por outros animais, e administrar meloxicam (1 mg / kg) por via intraperitoneal no primeiro dia após a cirurgia.

3. Registro e aquisição de EEG / EMG Dados

1. Após um período de recuperação de 1 semana, cada ratinho casa individualmente em uma gaiola experimental colocado numa câmara de registo à prova de som. Manter uma temperatura ambiente de 23 ± 1 ° C e controlar automaticamente ciclos de 12 h de luz-/ 12 horas escuro (luzes acesas às 08:00, a intensidade de iluminação ~ 100 lux).
2. Conecte o conjunto de eléctrodos EEG / EMG na cabeça do rato para um cabo de gravação. Assegure-se que o cabo de gravação está ligada a um anel de deslizamento (que é concebido de modo a que os movimentos do rato não são limitados por torção do cabo) e um amplificador de sinal de EEG / EMG. Filtro de EEG / sinais EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizar a uma taxa de amostragem de 128 Hz por um conversor analógico-digital (A / D) e, finalmente, gravar em um computador com o software de gravação de EEG / EMG ('Materiais' mesa, 4 ^th entrada a partir de baixo).
3. Habituar o mouse para 2 - 3 dias na câmara de gravação. Se a gravação EEG / EMG inclui as administrações de drogas intraperitoneal, manusear com cuidado o mouse em cada dia de habituação no momento da administração da droga.
4. Posteriormente, iniciar o software de EEG / EMG de gravação ('Materiais' mesa, 4 ^th entrada de baixo).
   1. Selecione a guia "Arquivo de dados de informação" e clique na caixa ao lado do nome do arquivo. Digite um nome de arquivo e clique em "Salvar".
   2. Selecione a guia "condições de gravação" e selecione todos os canais de EEG / EMG que serão gravados.
   3. Selecione a frequência de amostragem (128 Hz), na secção 'condição de gravação'.
   4. Verifique se os canais selecionados são exibidos corretamente no thguia e 'As informações do canal ".
   5. Selecione a guia 'Ajuste do timer' e clique em 'Monitor' para exibir EEG e EMG.
   6. Verifique se os sinais de EEG / EMG são exibidos corretamente.
   7. Selecione a guia 'Ajuste do timer "e defina a hora do relógio para o início eo fim da gravação na área de' Main Temporizador '.
   8. Clique em 'Monitor' no separador 'Ajuste do timer' para iniciar a gravação.
5. Gravar sinais de EEG / EMG sob basal (ie., O comportamento de sono / vigília de um rato comportando livremente) e diferentes condições de tratamento (por exemplo., A administração de cafeína ou tratamento simulado) durante vários dias. Eutanásia o rato com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital (200 mg / kg) após o último dia do experimento.

4. A pontuação de Estado Comportamental Baseado em EEG / EMG Dados

1. Inicie o software para análise de EEG / EMG ('Materiais' mesa, 4 ^th entrada da parte inferior). Abra os dados brutos EEG / EMG (arquivo .kcd) produzidos sob a etapa 3. Clique na guia 'Sleep' e selecione o tempo Epoch. Select 10 seg.
2. Clique na guia 'Sleep' e selecione 'Multi-screening "para marcar automaticamente todas as épocas 10 seg em 3 fases (ie., NREM e sono REM, e vigília), com base em as amplitudes de EEG e EMG e análise espectral de potência do EEG. ³
3. Clique em 'condição FFT para EEG ".
4. Defina os parâmetros para a análise espectral de potência [256 pontos de referência (correspondente a 2 segundos do EEG), função de janela Hanning, ea média de 5 espectros por época]. ^{3 Clique em} 'OK'.
5. Clique em "Iniciar Rastreio» para iniciar a triagem automática. Abra os dados marcados (arquivo .raf).
6. Confira os resultados da triagem automática e, se necessário, corrigi-los manualmente com base nos critérios padrão (veja os resultados representativos, Figura 1B e Tabela 1 ). ^{2, 3} Resumidamente, clique e segure o botão esquerdo do mouse sobre uma época incorretamente marcou e arraste o cursor sobre a seqüência de épocas incorretamente marcou. Solte o botão esquerdo do mouse e selecione o estado comportamental correta na janela pop-up.
   Nota: Ocasionalmente, épocas na transição entre dois estados vigilantes são difíceis de marcar inequivocamente a um estado. Em tais casos, a época deve ser marcado para o estado aparente e os mesmos critérios devem ser aplicados para épocas semelhantes ao longo da experiência para assegurar a reprodutibilidade dos dados.

Resultados

A Figura 1B ilustra exemplos de EEG o rato nos diferentes estados de vigilância. Como mostrado na Tabela 1, são classificados como épocas sono NREM se o EEG mostra ondas cerebrais grandes, com um ritmo lento delta inferior a 4 Hz e o EMG tem apenas uma fraco ou nenhum sinal. Épocas são classificados como sono REM se o EEG mostra ondas cerebrais rápidas de baixa tensão na faixa teta entre 6 e 10 Hz ea EMG apresenta baixa amplitude....

Discussão

Este protocolo descreve um set-up para gravações de EEG / EMG que permite a avaliação de sono e vigília sob low-noise, condições de custo-eficazes e de alto rendimento. Devido ao pequeno tamanho do conjunto de cabeça de eléctrodo de EEG / EMG, este sistema pode ser combinado com outros implantes para experiências intra-cerebrais, incluindo Optogenetics (implante de fibra óptica) ou, em conjunto com a implantação da cânula simultânea, Microinfusion de drogas no rato cérebro. ³¹ Além disso, a c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-pin header	Hirose	A3B-4PA-2DSA(71)
Ampicillin	Meiji Seika
Analog-to-digital converter	Contec	AD16-16U(PCIEV)
Caffeine	Sigma	C0750
Carbide cutter	Minitor	B1055
Crimp housing	Hirose	DF11-4DS-2C
Crimp socket	Hirose	DF11-30SC
Dental cement (Toughron Rebase)	Miki Chemical Product
Epoxy adhesive	Konishi	#16351
FFC/FPC connector	Honda Tsushin Kogyo	FFC-10BMEP1(B)
Flat cable	Hitachi Cable	20528-ST LF
Instant glue (Aron Alpha A)	Toagosei	N/A
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	N/A
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
Signal amplifier	Biotex	N/A
Sleep recording chamber	APL	N/A
SleepSign software	Kissei Comtec	N/A	for EEG/EMG recording/analysis
Slip ring	Biotex	N/A
Stainless steel screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 × 2.0
Stainless steel wire	Cooner Wire	AS633