Procédure d'enregistrement polygraphique pour la mesure du sommeil chez la souris

Résumé

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

Résumé

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

Introduction

Les progrès techniques ont souvent précipité sauts quantiques dans la compréhension des processus neurobiologiques. Par exemple, la découverte de Hans Berger en 1929 que les potentiels électriques enregistrés à partir du cuir chevelu humain ont pris la forme d'ondes sinusoïdales, dont la fréquence est directement liée au niveau de l'éveil du sujet, a conduit à des progrès rapides dans la compréhension de veille-sommeil la réglementation, dans les deux animaux et les humains. ¹ A ce jour l'electroencephlogram (EEG), en collaboration avec l'électromyogramme (EMG), ie., l'activité électrique produite par les muscles squelettiques, représente les données «colonne vertébrale» de presque tous expérimentale et clinique évaluation visant à établir une corrélation entre comportement et la physiologie de l'activité des neurones corticaux en se comportant animaux, y compris les humains. Dans la plupart des laboratoires de recherche du sommeil de base, ces enregistrements EEG sont effectuées en utilisant un système à base de câble (Figure 1) dans laquelle acquis dATA est soumis hors ligne le modèle et le spectre d'analyse [par ex., l'application de la transformée de Fourier rapide (FFT)] pour déterminer l'état de l'objet de la vigilance en cours d'enregistrement. ^{2, 3} Sommeil se compose de mouvements oculaires rapides (REM) et non-REM (NREM) sommeil. Le sommeil paradoxal est caractérisé par une basse tension rapide EEG, le mouvement des yeux aléatoire, et atonie musculaire, un état dans lequel les muscles sont effectivement paralysés. Sommeil paradoxal est également connu comme le sommeil paradoxal, car l'activité cérébrale ressemble à celle de l'état de veille, tandis que le corps est en grande partie déconnecté du cerveau et semble être en sommeil profond. En revanche, les neurones sont stimulés au cours du sommeil lent, mais il n'y a aucun mouvement de l'oeil. Le sommeil de NREM humain peut être divisé en 4 étapes, de sorte que l'étape 4 est appelé sommeil profond ou le sommeil lent et qui est identifié par les grandes ondes cérébrales lentes, avec une activité delta entre 0,5 à 4 Hz dans l'EEG. D'autre part, une subdivision entre les phases de sommeil lent dans de plus petits animaux, comme des rats unend souris, n'a pas été établie, principalement parce qu'ils ne disposent pas de longues périodes consolidés de sommeil comme on le voit chez les humains.

Au fil des ans, et sur la base de l'EEG interprétation, plusieurs modèles de régulation veille-sommeil, à la fois sur la base de circuits et humorale, ont été proposées. La base neuronale et cellulaire du besoin de sommeil ou, alternativement, «lecteur de sommeil," toujours pas résolue, mais a été conceptualisée comme une pression homéostatique qui construit pendant la période de la veille et est dissipée par le sommeil. Une théorie est que les facteurs endogènes somnogenic accumulent pendant l'éveil et que leur accumulation progressive est le fondement de sommeil pression homéostatique. Alors que la première hypothèse formelle que le sommeil est régulé par des facteurs humoraux a été crédité au travail de Rosenbaum publiée en 1892 ^4, il était Ishimori ^{5, 6 et} Piéron ⁷ qui indépendamment, et il ya plus de 100 ans, a démontré l'existence de produits chimiques favorisant le sommeil. Les deux chercheurs ont proposé, et en effet prouvé que les substances hypnogènes ou «hypnotoxins» étaient présents dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) de chiens privés de sommeil. ⁸ cours du siècle passé plusieurs substances hypnogènes putatifs supplémentaires impliquées dans le processus homéostatique du sommeil ont été identifiés (pour revue, voir réf. 9), y compris la prostaglandine (PG) D _2, ¹⁰ cytokines, ¹¹ adénosine, ¹² anandamide, ¹³ et le peptide urotensine II. ¹⁴

Les travaux expérimentaux par Economo ^{15, 16,} Moruzzi et Magoun ^17, et d'autres dans les résultats précoces et mi-20 ^{e siècle} produites qui a inspiré les théories sur circuit de sommeil et l'éveil et, dans une certaine mesure, éclipsé la théorie humorale alors en vigueur dormir. À ce jour, plusieurs «modèles de circuits» ont été proposées, chaque informés par des données de qualité et de quantité variable (pour revue, voir réf. 18). Un modèle, Par exemple, propose que le sommeil lent est généré par l'inhibition de l'adénosine-médiation de la libération d'acétylcholine des neurones cholinergiques dans le cerveau antérieur basal, une zone consisiting principalement du noyau de la branche horizontale de la bande diagonale de Broca et l'inominata substance. ¹⁹ Un autre modèle populaire de la réglementation de sommeil / éveil décrit un mécanisme de commutation bascule sur la base des interactions mutuellement inhibitrices entre les neurones somnifères dans la région préoptique ventrolatérale et les neurones de sillage induisant dans le tronc de l'hypothalamus et le cerveau. ^{18, 20, 21} En outre, pour la commutation dans et hors de sommeil paradoxal, une interaction réciproque inhibiteur similaire a été proposé pour les zones dans le tronc cérébral, qui est le gris ventrale périaqueducale, latéral pontique calotte, et le noyau sublaterodorsal. ²² Collectivement, ces modèles se sont avérés précieux heuristiques et cadres d'interprétation importantes offertes pour des études en recherche sur le sommeil; cependant, un yet meilleure compréhension des mécanismes et des circuits moléculaires régulant le cycle veille-sommeil, il faudra une connaissance plus complète de ses composants. Le système d'enregistrement polygraphique détaillé ci-dessous devrait aider à atteindre cet objectif.

Protocole

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par la Commission institutionnelle Expérience animale de l'Université de Tsukuba.

1. Préparation des électrodes et des câbles pour EEG / EMG Recordings

1. Préparer EEG / EMG électrode d'enregistrement selon le mode opératoire suivant.
   Remarque: L'électrode est jetable et peut être utilisée que pour une animal. Planifiez soigneusement la configuration de câblage pour tous les connecteurs. Placer des marques sur les connecteurs pour l'orientation correcte.
   1. Soudez chaque broche d'une tête à 4 broches à un fil d'acier inoxydable de 2 cm. En bref, tenir une extrémité du fil à la broche, placer un fer à souder chaud sur l'articulation fil broches, et faire fondre la soudure pour assurer que juste assez de soudure fonctionne bien dans l'articulation. Soyez prudent de ne pas appliquer trop de chaleur à la broche; autrement, la matière plastique autour des broches fondra.
   2. Soudez l'extrémité libre de chacun des 2 fils attachés à l'en-tête de la broche à la têted'une vis en acier inoxydable de 1,0 mm de diamètre. En bref, maintenir l'extrémité libre du fil à fil en dessous de la tête de vis, placer un fer à souder chaud sur l'articulation fil-vis, et faire fondre la soudure pour assurer que juste assez de soudure fonctionne bien dans l'articulation. Les 2 fils avec vis servent électrodes d'enregistrement EEG, tandis que les 2 fils sans vis servent EMG électrodes d'enregistrement.
   3. Utilisez des ciseaux pour dépouiller 1 mm de l'isolant à l'extrémité des électrodes EMG pour augmenter la qualité du signal EMG.
   4. Couvrir complètement toutes les broches soudées avec de la colle époxy à l'aide d'une fine baguette de bois ou un cure-dent pour réduire le bruit électrique pendant les enregistrements EEG / EMG.
2. Préparer un câble pour connecter l'électrode avec la bague collectrice tel que décrit ci-dessous. Ce câble peut être réutilisé.
   1. Soudez chaque broche d'un connecteur FFC / FPC 4 broches avec un fil d'un câble plat 30 cm. En bref, maintenir l'extrémité dénudée du fil à la broche, placer un fer à souder chaudsur le joint fil broches, et faire fondre la soudure pour assurer que juste assez de soudure fonctionne bien dans l'articulation.
      Remarque: Choisissez la longueur du câble plat qui est approprié pour la hauteur de la cage de l'animal expérimental utilisé pour les enregistrements EEG / EMG.
   2. Solder sertir prises à une extrémité des fils sur l'autre extrémité du câble plat. En bref, maintenez une prise de sertissage à l'extrémité libre dénudée du fil, placer un fer à souder chaud sur le joint fil-socket, et faire fondre la soudure à veiller à ce que suffisamment de soudure tout se passe bien dans l'articulation.
   3. Insérez chaque Crimp Socket dans une position 4 sertir logement.
   4. Couvrir complètement les douilles avec de la colle époxy sertissage en utilisant une fine baguette de bois ou un cure-dent.

2. implantation d'électrodes dans le chef de la souris (Durée: env. 20 min)

1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un stérilisateur à billes à chaud avant la chirurgie. Anesthésier une souris mâle (10 - âgé de 20 semaines, les 20 - 30 g)avec une injection intraperitoneale de pentobarbital (50 mg / kg). Après avoir vérifié que la souris est profondément anesthésié en pinçant un orteil, raser les cheveux sur la tête et le cou avec une tondeuse.
2. Déplacez la souris sur le cadre stéréotaxique, et fixer la tête entre les 2 bars de l'oreille. Appliquez de la vaseline sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Nettoyer la peau rasée avec de l'alcool et de couper le long de la ligne médiane avec un scalpel pour exposer le crâne. Clip de la peau pour garder la zone chirurgicale ouverte.
3. En utilisant un couteau de carbure (taille de forage: 0,8 mm de diamètre), percer 2 trous dans le crâne, l'un sur l'aire corticale frontale (1 mm en avant de bregma, 1,5 mm latéralement de la ligne médiane) et l'autre sur la zone pariétale ( 1 mm en avant de lambda, 1,5 mm latéralement à la ligne médiane) de l'hémisphère droit, selon coordonnées stéréotaxiques de Paxinos et Franklin. ²³
4. En utilisant le tournevis d'un bijoutier, en acier inoxydable de lieu d'enregistrement EEG vis dans les trous et faire 2 - 2,5 tours pour chaque screw pour le positionnement péridurale sur le cortex.
   Note: Ne pas insérer des vis trop profondes pour éviter d'endommager le tissu cérébral. Vérifier que les vis sont bien fixés sur le crâne. Ceci est important d'avoir des signaux EEG stables pendant une longue période de plusieurs enregistrements (typiquement, plus de 1 mois). Vis ondulées produisent des artefacts EEG et peuvent se détacher avant la fin de l'horaire expérimental.
5. Fixez l'ensemble d'électrode (cf. Section 1.1, broches tournées vers le haut) avec de la colle instantanée sur le crâne et couvrir avec du ciment dentaire. Assurez bilatéralement petits trous avec une pince dans les trapèzes (cou) muscles et insérer les fils en acier inoxydable qui servent d'électrodes EMG dans les trous. Suturer la peau avec un fil de soie (d'un diamètre de 0,1 mm) pour éviter l'exposition du muscle.
6. Retirer la souris du cadre stéréotaxique. Administrer de l'ampicilline (100 mg / kg) et le méloxicam (1 mg / kg) par voie intrapéritonéale à la souris pour éviter l'infection bactérienne et de réduire la douleur post-chirurgicale, respectivement. Keep la souris sur un tapis de chaleur et de le surveiller jusqu'à ce qu'elle ait repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Maison de la souris individuellement lors de la récupération pour éviter l'élimination des électrodes par d'autres animaux, et administrer meloxicam (1 mg / kg) par voie intrapéritonéale le premier jour après la chirurgie.

3. Enregistrement et acquisition EEG / EMG données

1. Après une période de récupération de 1 semaine, chaque maison souris individuellement dans une cage expérimentale placé dans une chambre d'enregistrement insonorisé. Maintenir une température ambiante de 23 ± 1 ° C et contrôler automatiquement des cycles de 12 heures de lumière / 12-hr foncé (lumières allumées à 08h00, l'intensité d'éclairage ~ 100 lux).
2. Connectez l'ensemble d'électrodes EEG / EMG sur la tête de la souris à un câble d'enregistrement. Vérifiez que le câble d'enregistrement est relié à une bague collectrice (qui est conçu de telle sorte que les mouvements de la souris ne sont pas limités par la torsion du câble) et un amplificateur de signal EEG / EMG. Filtre EEG / EMG signaux (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), numériser à une cadence de 128 Hz d'échantillonnage d'un convertisseur analogique-numérique (A / D) et enfin enregistrer sur un ordinateur exécutant le logiciel d'enregistrement EEG / EMG (Tableau 'Matériaux', 4 ^ème entrée à partir du bas).
3. Habituer la souris pour 2 - 3 jours dans la chambre d'enregistrement. Si l'enregistrement EEG / EMG comprend les administrations de drogue par voie intrapéritonéale, gérer doucement la souris sur chaque jour de l'accoutumance au moment de l'administration du médicament.
4. Par la suite, lancer le logiciel EEG / EMG d'enregistrement (Tableau 'Matériaux', 4 ^ème entrée du bas).
   1. Sélectionnez l'onglet «Fichier des données d'informations» et cliquez sur la case à côté du nom de fichier. Entrez un nom de fichier et cliquez sur «Enregistrer».
   2. Sélectionnez l'onglet «condition d'enregistrement» et sélectionnez tous les canaux EEG / EMG qui seront enregistrées.
   3. Sélectionnez la fréquence d'échantillonnage (128 Hz) dans l'onglet «conditions d'enregistrement».
   4. Vérifiez si les canaux sélectionnés sont affichés correctement dans ee onglet «Canal de l'information».
   5. Sélectionnez l'onglet 'de réglage de la minuterie "et cliquez sur" Monitor "pour afficher EEG et EMG.
   6. Vérifiez si les signaux EEG / EMG sont affichés correctement.
   7. Sélectionnez l'onglet 'de réglage de la minuterie "et régler l'heure de l'horloge pour le début et la fin de l'enregistrement dans la zone du minuteur principal.
   8. Cliquez sur "Moniteur" de l'onglet "réglage de la minuterie» pour commencer l'enregistrement.
5. Enregistre des signaux EEG / EMG sous la ligne de base (ie., Le comportement de sommeil / éveil d'une souris de se comporter librement) et différentes conditions de traitement (par exemple., L'administration de caféine ou un placebo) pendant plusieurs jours. Euthanasier la souris avec une injection intraperitoneale de pentobarbital (200 mg / kg) après le dernier jour d'expérimentation.

4. Scoring of Behavioral État Basé sur EEG / EMG données

1. Démarrez le logiciel pour l'analyse EEG / EMG (Tableau 'Matériaux', 4 ^ème entrée du bas). Ouvrez les données brutes EEG / EMG (fichier .kcd) produites dans l'étape 3. Cliquez sur l'onglet «sommeil» et sélectionnez le temps Epoch. Sélectionnez 10 sec.
2. Cliquez sur l'onglet «sommeil» et sélectionnez «Multi-screening» de marquer automatiquement toutes les époques de 10 sec en 3 étapes (ie., Sommeil lent et le sommeil paradoxal, et l'éveil) sur la base des amplitudes des EEG et EMG et l'analyse spectrale de puissance de l'EEG. ³
3. Cliquez sur "l'état de la FFT pour EEG».
4. Définissez les paramètres de l'analyse spectrale de puissance [256 points de référence (correspondant à 2 secondes de l'EEG), la fonction de fenêtre de Hanning, et la moyenne des 5 spectres par époque]. ^{3 Cliquez sur} «OK».
5. Cliquez sur «Démarrer screening» pour commencer le dépistage automatique. Ouvrez les données marqués (fichier .RAF).
6. Consultez les résultats de l'examen automatique et, si nécessaire, corriger manuellement sur ​​la base des critères standard (voir les résultats représentatifs, figure 1B et tableau 1 ). ^{2, 3} Brièvement, cliquez et maintenez le bouton gauche de la souris sur une époque mal marqué et faites glisser le curseur sur la chaîne des époques mal marqués. Relâchez le bouton gauche de la souris et sélectionnez l'état comportemental correcte dans la fenêtre pop-up.
   Remarque: Parfois, les époques à la transition entre deux états vigilants sont difficiles à marquer sans ambiguïté, à un état. Dans de tels cas, l'époque devrait être marqué à l'état apparent et les mêmes critères doivent être appliqués à des époques similaires à travers l'expérience pour assurer la reproductibilité des données.

Résultats

Figure 1B illustre des exemples de l'EEG souris dans les différents états de vigilance. Comme le montre le tableau 1, les époques sont classés comme si le sommeil lent EEG montre grandes ondes cérébrales, avec un rythme lent de delta inférieure à 4 Hz et l'EMG ne dispose que d'un signal faible ou nulle. Époques sont classés comme le sommeil paradoxal si l'EEG montre rapides ondes cérébrales basse tension dans la gamme thêta e...

Discussion

Ce protocole décrit un set-up pour les enregistrements EEG / EMG qui permet l'évaluation de sommeil et l'éveil sous faible bruit, conditions de coût-efficaces et à haut débit. En raison de la petite taille de l'ensemble de tête de l'électrode EEG / EMG, ce système peut être combiné avec d'autres implants pour des expériences intra-cérébrales, y compris optogénétique (optique de l'implantation de la fibre) ou, en conjonction avec simultanée canule implantation, microperfusion de m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-pin header	Hirose	A3B-4PA-2DSA(71)
Ampicillin	Meiji Seika
Analog-to-digital converter	Contec	AD16-16U(PCIEV)
Caffeine	Sigma	C0750
Carbide cutter	Minitor	B1055
Crimp housing	Hirose	DF11-4DS-2C
Crimp socket	Hirose	DF11-30SC
Dental cement (Toughron Rebase)	Miki Chemical Product
Epoxy adhesive	Konishi	#16351
FFC/FPC connector	Honda Tsushin Kogyo	FFC-10BMEP1(B)
Flat cable	Hitachi Cable	20528-ST LF
Instant glue (Aron Alpha A)	Toagosei	N/A
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	N/A
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
Signal amplifier	Biotex	N/A
Sleep recording chamber	APL	N/A
SleepSign software	Kissei Comtec	N/A	for EEG/EMG recording/analysis
Slip ring	Biotex	N/A
Stainless steel screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 × 2.0
Stainless steel wire	Cooner Wire	AS633