نظام حقن الضغط للتحقيق في الجهاز العصبي من معالجة المعلومات في استيقظ يتصرفون المكاك القرد اللحاء

Summary

Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.

Abstract

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.

Introduction

In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine¹. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies², as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals³ and systemic pharmacological manipulations in humans⁴. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems^5,6 and can lead to changes in neural activity³.

Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug⁷. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules⁸, correlating with the tip diameter⁹ of the micropipette as well as with the concentration⁸ of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used¹⁰, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.

Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley¹¹ for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain¹²) to a defined brain area¹³ while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette¹³. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly¹⁴ and intracellularly^15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see¹⁷ for a comparison of recent pressure injection systems).

An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.

The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.

Protocol

أجريت رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للقوانين الألمانية التي تنظم رعاية الحيوانات والتي وافقت عليها الحكومة المحلية من براونشفايغ، سكسونيا السفلى، ألمانيا.

ملاحظة: كما يتم تنفيذ التجربة في الجسم الحي، لا بد من الحفاظ على أعلى معايير النظافة الممكنة. ، والعمل كلما كان ذلك ممكنا في ظل ظروف معقمة.

1. إعداد نظام حقن / تسجيل

1. تعقيم الأنبوب الذي يربط micropipette مع الحقنة. استخدام أقصر طول أنبوب ممكن في انشاء التجريبية بين مضخة حقن ونظام تسجيل الكهربية.
2. تنظيف أنابيب دليل من نظام تسجيل باستخدام الأسلاك التنظيف. تغمس في زيت السيليكون معقمة وإطعامهم من خلال أنابيب دليل الفردية عدة مرات.
3. إدراج micropipette زجاج الكوارتز في أنبوب دليل واحد من نظام التسجيل. انظر الشكل 1A.
4. بعد تحديد micropipette فينظام تسجيل، ونعلق أنبوب معقم لمسمار معدني من micropipette. اعتن بنفسك؛ على الرغم من أن micropipette يتم إصلاحها في نظام يمكن أن كسر بسهولة عندما ربط الأنبوب. استخدام اثنين من ملاقط معقمة لممارسة الضغط متساو على دبوس وأنبوب.
5. استخدام الغراء سوبر السائل لاغلاق تقاطع بين أنبوب وmicropipette. الانتظار على الأقل 3 ساعة للالغراء لتتصلب قبل ملء micropipette مع السائل.
6. إدراج الميكروية (على سبيل المثال، زجاج الكوارتز معزول البلاتين التنغستن) في مواقع أخرى من نظام تسجيل قبل أو بعد الإدراج micropipette.

2. إعداد المواد

1. تعقيم 1.5 مل أنابيب microcentrifuge للتخزين في وقت لاحق من حلول الحقن باستخدام الأوتوكلاف أو غيرها من الإجراءات يمكن الاعتماد عليها.
2. تزن المقابل هيدروكلوريد مادة سكوبولامين لإعداد 5 مل من محلول المولي 0.1. تذوب في محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم).
3. في ظل ظروف معقمة طنا الدخان غطاء محرك السيارة، تصفية الحل باستخدام فلتر حقنة مع قطر المسام كبيرة بما فيه الكفاية، على سبيل المثال، 0.2 ميكرون.
4. تحت غطاء الدخان، قسامة الحل في كميات كافية لتجربة واحدة، على سبيل المثال، لسكوبولامين، 500 ميكرولتر في العقيمة أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. استخدام أنابيب المظلمة لحماية المادة من الضوء. بدلا من ذلك، والتفاف الأنابيب في رقائق الألومنيوم. لسكوبولامين، تخزين الحل لمدة تصل إلى 14 يوما في 4 درجات مئوية.

3. إعداد اليومي لنظام حقن / تسجيل

ملاحظة: عندما تقام في نظام التسجيل، يتم تخزين الأقطاب وmicropipette في محلول أنزيم (Tergazyme،٪ الحل 1 مع الماء منزوع الأيونات) بين التسجيلات. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية قبل كل تسجيل.

1. جمع أنبوب من المادة المراد حقنها. السماح لها للوصول إلى RT إذا المبردة.
2. إزالة نظام حقن / تسجيل من الحل الانزيم وشطف الأقطابوmicropipette مع الماء منزوع الأيونات لتنظيف تماما من حل الانزيم.
3. إزالة الغطاء الأمامي للنظام تسجيل من أجل التحقق بصريا الختم بين micropipette وأنبوب.
4. تطبيق زيت السيليكون المعقم في الفجوة دليل أنبوب (انظر الشكل 1A) ونصائح من الأقطاب الكهربائية وmicropipette من أجل تليين النظام للحركة على نحو سلس.
5. تحقق نصائح من الأقطاب الكهربائية وmicropipette باستخدام المجهر للتأكد من أنها سليمة. محاذاة الأقطاب وmicropipette تحت المجهر بحيث تمتد خارج من أنابيب دليل بنفس الطول. طردهم في أنابيب دليل، ووقف في أقرب وقت لأنها لم تعد مرئية. ويعرف هذا كما وضع القطب الصفر. تعيين عمق الأقطاب وmicropipette إلى 0 في البرنامج.
6. ملء محقنة معقمة بمحلول ملحي معقم وادخال الإبرة في أنبوب، مع الحرص على عدم اختراق جدار الأنبوب. دفع micropipette من الأنبوب دليل للVISUمراقبة آل من تدفق المخدرات.
7. دافق لا يقل عن 2 ملحي معقم مل من خلال أنبوب وmicropipette لضمان عدم وجود الهواء لا تزال في حقنة أو في الأنبوب. لا تنطبق الكثير من الضغط على المكبس من الحقنة. ضمان تقاطع بين أنبوب وmicropipette غير مختومة. إذا تسرب واضح، وإعادة الغراء تقاطع (راجع الخطوة 1.5) وتأجيل تسجيل.
8. ملء محقنة معقمة جديدة مع الحل ليتم حقنه وتبادلها مع برميل من الحقنة المالحة، أي، والحفاظ على إبرة حقنة مليئة المالحة في الأنبوب. تأكد من أن يتم نقل أية الهواء في النظام. وأفضل طريقة لتحقيق هذا عن طريق ملء المركز إبرة مع المياه المالحة بعد إزالة برميل مليئة المالحة.
9. مسح نظام مع 250 ميكرولتر من الحل ليتم حقنه، من أجل إزالة الملوحة من الأنبوب.
10. باستخدام برنامج التحكم في المحركات، سحب أسلاك وmicropipette في guidetubesto عمق -500 ميكرون على الأقل.
انخفاض عصابة دليل أنبوب (الشكل 1A) إلى الجزء السفلي من الأنابيب دليل للحفاظ على الوضع النسبي الثابتة الخاصة بهم.
11. تنظيف قاعدة النظام مع الإيثانول، وبخاصة عندما سوف أتطرق غرفة تسجيل القرد.
12. إغلاق نظام التسجيل عن طريق استبدال الغطاء الأمامي وتشديد الخناق.

4. التحقق من نظام حقن

ملاحظة: على الرغم من أن شركة معايرة النظام، فمن المستحسن للتحقق من صحة كميات إخراجه مع المواد المستخدمة في انشاء التجريبية (الأنابيب والحقن وغيرها).

1. إعداد النظام كما هو موضح في الخطوة 3، مع أقطاب وmicropipette الممتدة من الأنابيب دليل. ينصح عمق ميكرون ما لا يقل عن 7000 لتجنب فقدان حجم القياس بسبب التصاق على طول السطح الخارجي من micropipette والأقطاب الكهربائية.
2. وضع نظام تسجيل في الموقف الذي سيتم استخدامه في أثناء التجربة ووضع syrinجنرال الكتريك في مضخة حقن مكروي. إصلاح الحقنة في مكان باستخدام الشريط المطاطي وقبضة قابل للتعديل (انظر الشكل 1A). حرك جزء متحرك من المضخة إلى أن يصبح ثابتا في مكانه وراء المكبس من الحقنة.
3. استخدام وحدة المحركات التي تسيطر عليها البرنامج، إخراج كمية كبيرة بما يكفي لقياسها بدقة، على سبيل المثال.، 1000 NL. فمن الأفضل لاستخدام خطوة واحدة لإخراج الحجم الكلي لتفادي آثار عمل شعري على طول سطح micropipette. سرعات منخفضة جدا (1 NL / ثانية) يمكن أن يؤدي أيضا لهذا الغرض أثناء إجراء التحقق من الصحة.
4. جمع الحجم الكلي في وعاء وضعت تحت micropipette، أو جمع بعناية انخفاض طرد مباشرة من غيض من micropipette. تقدير حجم طرد باستخدام ماصة أو عن طريق وزنها مع مقياس الدقة.
5. كرر الإجراء عدة مرات لتأكيد القياسات.

5. الحادة تسجيلات

1. تعيين موضع س صمن نظام تسجيل. هذا يحدد النقطة التي أنابيب دليل تصل إلى الأم الجافية داخل غرفة تسجيل مزروع مزمنة. تأكد من سحب الأنابيب دليل تماما (دليل أنبوب ض 0 موقف).
2. جعل النظام تسجيل في الموقف ووضع حقنة في مضخة حقن مكروي. إصلاح الحقنة في مكان باستخدام الشريط المطاطي وقبضة قابل للتعديل (انظر الشكل 1A). حرك جزء متحرك من المضخة إلى أن يصبح ثابتا في مكانه وراء المكبس من الحقنة. إذا كان قطرة من مادة غير مرئية في غيض من أنابيب دليل، وإزالة بعناية باستخدام برعم القطن المعقم.
3. إعداد الحيوان للتسجيل وفقا للإجراءات المختبر (انظر ¹⁸ للحصول على إرشادات سبيل المثال).
4. جبل آمن نظام تسجيل على غرفة تسجيل القرد.
5. ببطء يدويا خفض أنابيب الدليل إلى غرفة تسجيل حتى يتم الوصول إلى الجافية، ثم دفع الأقطاب الكهربائية باستخدام موتوربرنامج ntrol.
6. كما أنه ليس من الممكن قياس مقاومة من micropipette، أولا مع محرك كهربائي وتحقق ممانعات بشكل منتظم على أعماق مختلفة. بعد تنفيذ عملية اختراق الجافية بنجاح دون الإضرار الأقطاب، دفع micropipette.
7. دفع الأقطاب وmicropipette إلى عمق القطب الهدف الذي من المتوقع أن يتم العثور على منطقة الدماغ من الفائدة. ببطء دفع الكهربائي حتى أنها قريبة بما فيه الكفاية لتسجيل نشاط وحدة واحدة، كما يتضح من جيدة لنسبة الإشارة إلى الضوضاء في الإشارات المسجلة. الأهم من ذلك، وضع القطب تسجيل وmicropipette في نفس العمق لضمان الحد الأدنى من المسافة بين القطب وmicropipette.
   1. إذا كان ذلك ممكنا، والحفاظ على الأقطاب وmicropipette في هذا العمق لتسجيل كامل. ومع ذلك، إذا كان الطريق الوحيد للحفاظ على جودة الإشارة من خلية سجلت هي لتحريك الأقطاب، ثم دفع الأقطاب وmicropipetteفي وقت واحد للحفاظ على المسافة بينهما.

6. الاهتمام المكاني العمل

1. في سلسلة من المحاكمات والحاضر اثنين تتحرك أنماط نقطة على الشاشة، وضع واحد في مجال تقبلا من الخلايا العصبية المسجلة وخارج الآخر منه، جنبا إلى جنب مع نقطة تثبيت قدمت مركزيا ان الحيوان لديه لمنقر طوال كل محاكمة ^{19، 20.}
   ملاحظة: يتم تدريب قرد للرد على تغيير الاتجاه في نمط نقطة ملقن (الحدث الهدف)، في حين تجاهل أي تغيير الاتجاه في نمط نقطة أخرى، ويكافأ مع قطرة من السائل لكل الانتهاء بنجاح من محاكمة ^{19، 20.} كشرط السيطرة الحسية، القرد أن يقدم تقريرا تغيير الإنارة من نقطة التثبيت بينما تتجاهل كل من يتحرك أنماط نقطة (انظر الشكل 2 للحصول على وصف أكثر تفصيلا لهذه المهمة).

7. التلاعب الدوائية في حين تسجيل

ملاحظة: على الرغم من أن القرد هو أداء هذه المهمة، وحقن مادة بطريقة كتلة الحكيم. يتم تحديد ثلاث كتل متتالية: السيطرة، الذي يعمل بمثابة خط الأساس. حقن خلالها يتم إخراج مادة. والانتعاش، وخلالها خلايا استهدفت بعودة الحقن لخط الأساس.

1. خلال كتلة الحقن، حقن كمية محددة سلفا من المادة على فترات منتظمة على سبيل المثال، 2 NL كل دقيقة بمعدل 2 نيكولا لانغ / ثانية. على سبيل المثال، استخدام سكوبولامين هيدروكلوريد. يتم التحكم في عملية الحقن باستخدام البرامج التي توفر خيارات مختلفة. على سبيل المثال، استخدم الدالة خطوة لتحديد حجم الحقن، ثم اضغط على زر حقن كل دقيقة وفقا لساعة من تسجيل البرامج.
   ملاحظة: مدة الدقيق للكتلة الحقن هي جوهر وتجربة تعتمد، على سبيل المثال، للاستخدام سكوبولامين 2 الحقن نيكولا لانغ كل دقيقة لمدة 10 دقيقة (20 NL في المجموع). فمن الأفضل عدم دفع الأقطاب والدوري micropipetteنانوغرام كتلة الحقن.
2. لاحظ الوقت ومحاكمة خلالها يتم حقن مادة، وعمق الأقطاب وmicropipette، فضلا عن كمية من مادة طرد.
3. اتبع كتلة حقن مع كتلة الانتعاش، حيث يتم حقن أي مادة. مدة كتلة الانتعاش مادة معينة وتحتاج إلى تعريف في اختبارات ما قبل. مراقبة والحفاظ على جودة التسجيل للوحدات واحدة مختارة حتى نهاية كتلة الانتعاش.
4. كرر ثلاث كتل لطالما جودة التسجيل والدافع للقرد تسمح.

8. إجراءات المشاركة تسجيل

1. بعد تسجيل البيانات، سحب أسلاك وأنابيب micropipette في دليل وثم التراجع عن أنابيب دليل يدويا. إزالة نظام تسجيل من غرفة تسجيل القرد. الافراج عن حقنة من مضخة حقن ونقل النظام إلى المنطقة تمهيدا للتنظيف.
2. التعامل مع الحيوان(بما في ذلك تنظيف غرفة تسجيل ¹⁸⁾ وفقا للإجراءات القياسية للمختبر وإعادته إلى منشأة سكنية.
3. شطف خارج الأنابيب دليل مع بيروكسيد الهيدروجين (3٪)، ثم مع الماء منزوع الأيونات. الأقطاب الكهربائية محرك الأقراص وmicropipette من أنابيب دليل، شطف مع بيروكسيد الهيدروجين والماء ثم منزوع الأيونات.
4. تبادل برميل من الحقنة مع برميل حقنة مليئة المالحة عقيمة، والحفاظ على إبرة في أنبوب. تدفق أنبوب وmicropipette مع 1-2 مل من المياه المالحة. بعد التنظيف، وإزالة برميل وملئه بالهواء. أعد برميل في إبرة وتجفيف أنبوب وmicropipette من الداخل عن طريق دفع بلطف الهواء من خلال.
5. تخزين أنابيب دليل، أسلاك طويلة وmicropipette مغمورة في محلول أنزيم لتجنب جفاف وكذلك ضمان توزيع المواد العضوية.

النتائج

الشكل 2 يصور مهمة الاهتمام المكاني القرد أداؤها في الوقت الذي أجرى عملية الحقن. تم تدريب القرد لحضور إما إلى التحفيز تقع ضمن مجال تقبلا من الخلايا العصبية المسجلة (حضور في)، والتحفيز تقع خارج مجال تقبلا (حضور التدريجي) أو نقطة تثبيت (حضور الإصلاح). تسمح هذه الظروف مقارنة بين نشاط الخلايا العصبية في الدول الإنتباه مختلفة.

ويبين الشكل 3 الوقت الرسم البياني شبه التحفيز من الخلايا العصبية العينة في تجربة تستخدم سكوبولامين، وهو خصم الكوليني المسكارينية. يوضح مؤامرة قمع استجابة أثناء الحقن سكوبولامين مقابل عدم حقن، عند تقديم نمط تتحرك في الاتجاه المفضل الخلية داخل الحقل تقبلا العصبون وحضره الحيوان. وتمثل أول قمم اثنين من الخلايا العصبية9؛ ق ردا على داخل وإزاحة جديلة المكانية، والذي يظهر داخل مجالها تقبلا. وأعقب ذلك ردا على النمط المتحرك الذي يظهر على الشاشة 500 مللي ثانية بعد ظهور جديلة. المنطقة المظللة رمادي يصور فترة التحليل المستخدمة لحساب متوسط ​​معدل اطلاق النار على كل محاكمة. المنطقة الخضراء يسلط الضوء على تأثير القمعية من حقن سكوبولامين على معدل إطلاق الخلية. معارض المنطقة الخضراء الداكنة قمع في فترة التحليل.

ويبين الشكل 4A تأثير سكوبولامين على متوسط ​​معدل إطلاق الخلايا العصبية العينة في كل الظروف الإنتباه الثلاثة. انخفض معدل العصبون اطلاق النار لمدة الظروف الاهتمام المكانية (انتباه داخل أو خارج مجال تقبلا من الخلايا العصبية تسجيل) فضلا عن حالة حسية (الانتباه في مرحلة التثبيت) بعد الحقن الأول من كتلة حقن (مظللة الرمادي قريبا هيأ) وخلال كتلة الانتعاش زادت بعد تأخير لنفس المستوى الذي كان عليه قبل الحقن.

ويبين الشكل 4B عنصر تحكم تسجيل من عينة الخلايا العصبية الثانية التي تم حقن محلول ملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪)، وذلك باستخدام نفس البروتوكول بالنسبة للحقن سكوبولامين. خلال حقن منع لم يلاحظ أي تغير في معدل إطلاق الخلايا العصبية بالمقارنة مع كتلة التحكم.

الشكل 1. مجموعة المتابعة تستخدم للتلاعب الدوائية في حين تم تسجيل. (A) يصور مضخة حقن مكروي ونظام تسجيل الكهربية مجهزة الأقطاب وmicropipette. يظهر الفجوة guidetube، حيث يتم إدراج زيت السيليكون لتليين الأقطاب وmicropipette، الموسع. (ب) يعرض مثال micropipette (أعلاه)وتسجيل الكهربائي (أدناه). للمقارنة حجم، سنت يورو (القطر: 16 ملم). يتم وضع تحت الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شخصية تصميم 2. العمل لتوجيه الاهتمام المكاني. تم تدريب القرود للكشف عن تغيير اتجاه الحركة في نمط نقطة ملقن. وضعت جديلة سواء داخل الحقل تقبلا العصبون (حضور في)، كما هو مبين في الشكل، أو خارجها (حضور التدريجي). كعنصر تحكم الحسية، تم تدريب القرد للكشف عن تغيير الإنارة من نقطة تثبيت (حضور الإصلاح). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

< IMG بديل = "الشكل 3" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg" />
ويظهر الشكل 3. تأثير سكوبولامين خصم على اطلاق النار معدل الساعة الرسم البياني شبه حافزا للعصبون عينة للحضور في حالة (انتباه داخل الحقل تقبلا من الخلايا العصبية المسجلة) خلال كتلة الحقن وخلال كتلة التحكم. محور س يصور الوقت بالمللي ثانية بعد ظهور جديلة والمحور الصادي يظهر معدل اطلاق النار في السنابل / ثانية. المنطقة الرمادية يصور فترة التحليل (300-800 مللي بعد ظهور التحفيز) المستخدمة لحساب معدل اطلاق بلغ متوسط ​​محاكمة. تظهر المنطقة المظللة الخضراء قمع في اطلاق معدل عبر شرطين. اللون الأخضر الداكن يسلط الضوء على قمع في فترة التحليل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ديزيل / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/>
الرقم 4. تأثير سكوبولامين والمالحة على اطلاق المعدل. (A) خصم حقن سكوبولامين. يظهر معدل اطلاق بلغ متوسط ​​محاكمة خلية عينة من الشكل (3) على مدى التجربة لتحفيز المفضل لجميع الظروف الإنتباه الثلاثة. محور س يصور وقت بدء المحاكمة في دقائق ويظهر المحور ص معدل اطلاق الوحدة في المسامير في ثواني. حرف ( حضور في، حضور-إصلاح، حضور التدريجي) تمثل نسبة إطلاق الخلايا العصبية في غضون فترة التحليل في كل محاكمة أجريت بنجاح، وخطوط أفقية (الخط المتصل: حضور في خط منقط: حضور الإصلاح، خط متقطع: من حضوره الخروج) تظهر متوسط ​​معدل إطلاق النار ل ثلاثة BL تجريبية مختلفةocks (السيطرة، وحقن، والانتعاش). معارض المنطقة المظللة الرمادية كتلة الحقن، بدءا من الحقنة الأولى والمنتهي في 1 دقيقة بعد آخر حقنة. خلال الحقن كتلة 2 NL 0.1 سكوبولامين المولي تم حقن كل دقيقة مع سرعة الحقن من 2 نيكولا لانغ / ثانية. (ب) حقن المالحة. يظهر معدل اطلاق النار من خلية العينة على مسار التجربة السيطرة على التحفيز المفضل لجميع الظروف الإنتباه الثلاثة. رمادي المنطقة المظللة يتصور كتلة من الحقن بالمحلول الملحي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا لدينا هو موضح بالتفصيل كيفية تنفيذ الحقن موثوقة ودقيقة والتسجيلات وحيدة الخلية ذات جودة عالية مع "قبالة الجاهزة للاستخدام" نظام حقن الضغط. في حين أن هذا الأسلوب من تسليم المخدرات قد سبق استخدامها في التصرف القرود (إعادة النظر في ^17)، ونظام المقدمة هنا مزاياه، استعرض أدناه.

كما هو موضح في الشكل رقم 4A، النظام المذكور هنا يمكن أن توفر قياس ثابت للنشاط الخلايا العصبية واحد مع وبدون الحقن الدوائية في المنطقة المجاورة مباشرة للموقع تسجيل. كما هو مبين في الشكل 4B، وحقن تحكم جوهر، المالحة، لا يؤدي إلى تغيير في اطلاق المعدل. توضح هذه السيطرة إلى أن عملية الحقن نفسها لديها أي تأثير ملموس على خصائص إطلاق الخلايا العصبية المسجلة.

التكوين المكاني من الخلايا العصبية، وتسجيل الكهربائي، وmicropipette هو من الأهمية أهمية في هذه التجارب. على الرغم من أن القياس الدقيق من مراكزها النسبية في الأنسجة أثناء تسجيل غير ممكن، يمكن أن نعتبر والسيطرة على المصادر المحتملة للالتباين. أولا، خلال حقن حجم هناك خطر يتمثل في أن الخلايا العصبية من الفائدة قد نزحوا بعيدا عن القطب تسجيل، مما يؤثر على استقرار الإشارات المسجلة. ولهذا السبب فإنه من الحكمة أن المقارنة بين معدل إطلاق النار قبل وبعد كتلة حقن للتحقق الاستقرار إشارة. ثانيا، تكوين دليل أنبوب من نظام تسجيل يحدد المسافة بين الأقطاب وmicropipette (على سبيل المثال، 305 ميكرون في نظام 3-قناة مركزية المستخدمة في هذه التجربة). كما يوفر نظام السيطرة على الموقف دقيقة لعمق الأقطاب وmicropipette في الأنسجة، والمسافة بينهما يمكن التقليل من معايرة بعناية عمق نسبي قبل التسجيل (الخطوة 3.5)، وابقائها على عمق مشترك خلال التسجيلات.

والأنف والحنجرة "> القيود المحتملة
بالإضافة إلى مراقبة الجودة في المنزل من قبل الشركة المصنعة، يحتاج النظام ليتم التحقق من صحتها في ظل ظروف المختبر، ومختلف العلامات التجارية للأنابيب والحقن وما يمكن أن تستخدم ويمكن أن يؤدي إلى اختلافات في حجم طرد. على الرغم من أن النظام يمكن أن تستخدم لحقن كميات صغيرة جدا كما هو الحال في التجربة هو موضح هنا، وهذه هي أقل من الحد الأدنى وحدة التخزين التي يمكن التحقق من صحة بسبب القيود قياس العملية في بيئة معملية عادية. ومع ذلك، حقن كميات أكبر يمكن أن تستخدم للاستدلال على العلاقة بين حجم المعرفة من قبل البرنامج وحجم طرد من قبل الأجهزة. إذا تم استخدام أنابيب شفافة، وهو فحص بصري إضافي لعملية حقن ممكن عن طريق قياس تشريد علامة بصرية.

إدراج micropipette في النظام هو أكثر تطلبا من الإدراج الكهربائي، وقطر من micropipette أكبر قليلا والمواد أكثر هشاشة. بالإضافة الى،الانضمام إلى أنبوب إلى دبوس من micropipette يمثل تحديا لأنها تنطوي على مخاطر عالية من كسر الجزء العلوي من micropipette. ومع ذلك، فإن مدى الحياة من micropipette تحميلها بنجاح هو عدة أشهر، حتى مع الاستخدام اليومي.

في الواقع، نحن لم تواجه بعد انسداد في نظام حقن أثناء التنظيف بعد تسجيل للنظام. ومع ذلك، لا "على الانترنت" الاختيار هو ممكن، وهناك خطر من أن انسداد المادي (مثل الأنسجة في الطرف micropipette) قد يمنع حقن مادة. لذا قد يكون من المستحسن لتحليل البيانات متحفظ، مثل بما في ذلك إلا تلك الخلايا في مزيد من التحليل أن تظهر تغيرات كبيرة في اطلاق معدلات بين السيطرة وحقن كتل من التجربة.

وعلى الرغم من قطرها صغير، والميكروية والماصات محل أنسجة المخ ويمكن أن تسبب بعض تلف الأنسجة المحلية. وهذا يمكن أن يكون الحد الأدنى عن طريق وضع غيض من عشر يدوياأنابيب دليل البريد فقط فوق الأم الجافية. الأقطاب ثم اختراق الجافية ويستدل intactness من خلال قياس ممانعات على الانترنت. بعد ذلك، يتم إدراج micropipette. عند استخدام هذا الأسلوب، فمن المستحسن إزالة العادية للأنسجة فوق الجافية إلى زيادة خفض خطر الكهربائي أو ماصة الكسر.

بالمقارنة مع الطرق البديلة
النظام المستخدم هنا يظهر مزايا واضحة مقارنة مع أنظمة حقن الضغط الأخرى. ميزة واحدة قوية هي قطر من micropipette (حوالي 100 ميكرون)، وهو نصف حجم تحقيقات الأخرى المتاحة ¹⁷ وبالتالي يقلل من تلف الأنسجة العصبية. وعلى النقيض من التصاميم السابقة، ويعمل النظام الحالي يفصل مكانيا القطب تسجيل وmicropipette. على الرغم من أن أنظمة أخرى توفر مسافة صغيرة بين القطب وماصة، النظام المذكور هنا يسمح التغييرات عمق مستقلة من الأقطاب الكهربائية وماصة، وبالتالي permitting المسافات النسبية المتغيرة ضمن جلسة تسجيل. الأهم من ذلك، أي حل وسط بشأن جودة التسجيل يجب ان يتم، ونظام حقن هو امتداد لجهاز تسجيل المعمول بها. في حين يستخدم فقط micropipette واحد، وبالتالي واحدة مادة في هذا البروتوكول، فمن الممكن لحقن عدة مواد في إجراء التجارب واحد. ولتحقيق ذلك، عدة بال micropipettes يمكن الخيوط في أنابيب دليل منفصلة ومتصلة إلى الحقن التي شنت في مضخات حقن الفردية. وأخيرا، والسيطرة على نظام غير سهلة، كما هو مطلوب برنامج كمبيوتر واحد فقط لدفع الأقطاب وmicropipette، ولأداء حقن الضغط أثناء التجربة.

مقارنة حقن الضغط على الرحلان الشاردي، وهناك مزايا والعيوب النسبية. على سبيل المثال، حقن ضغط يتطلب كميات أكبر لإدخالها في الأنسجة من الرحلان الشاردي، مما يزيد من خطر النزوح الخلايا العصبية. بروتو الحالييستخدم عمود مجلدات في مجموعة NL، ونحن نادرا ما شهدت تغييرات ملحوظة في جودة الإشارة خلية سجلت في. ويتيح هذا النظام أيضا كميات أكبر ليتم حقنه، وهي مفيدة محتملة للتلاعب السلوكية ولكن يمكن أن تؤثر على استقرار تسجيل العصبية. وهناك ميزة واضحة لحقن الضغط على الرحلان الشاردي هي طائفة واسعة من المواد القابلة للاستخدام حيث لا يوجد متطلبات لاستخدام المواد المشحونة. ومع ذلك، يجب أن يتم التحقق قيم الرقم الهيدروجيني ومقارنة بين المواد التجريبية والضابطة (على سبيل المثال، مالحة).

وقد يثور سؤال لماذا لاستخدام أسلوب الراسخة الحقن الضغط بدلا من التقنيات الحديثة مثل علم البصريات الوراثي لمعالجة النشاط العصبي. على الرغم من أن راسخة في القوارض، وغير ثابتة علم البصريات الوراثي بشكل صحيح في القرود. على وجه الخصوص، فإنه لا يسمح بعد التلاعب المحلي للخلايا انتقائية لنوع ناقل عصبي معين. وعلى المدى الطويل، ونحن نرىإمكانات كبيرة لمجموعة من المزايا من التلاعب الدوائية مع مزايا التلاعب optogentic في توضيح الأساس العصبي للوظائف الإدراكية.

هنا أظهرنا كيف حقن ضغط يمكن استخدامها لمعالجة دوائيا منطقة محظورة محليا في الدماغ من مستيقظا، ويتصرف القرود. نأمل أن هذا الأسلوب يلهم علماء آخرين للتحقيق مساهمات neuromodulatory لديناميات نشاط الخلايا العصبية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(-)-Scopolamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339.81 g/mol
NaCl 0.9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzyme detergen
Hydrogen peroxide	Roth		Used in 3% solution with deionized water
Ethanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Deionized water
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Syringe and needle
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Quarzglass micropipette	Thomas Recording
Recording electrode	Thomas Recording		quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ  and 0.3-0.5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superglue
Silicon oil	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Syringe filter
Multichannel Micro Injection System	Thomas Recording		multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump
McLab	custom		internal lab software to control stimulus presentation