Um sistema de injeção de pressão para a investigação da neurofarmacologia de Processamento de Informação em Despertai Behaving Macaque Cortex

Resumo

Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.

Resumo

The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.

Introdução

In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine¹. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies², as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals³ and systemic pharmacological manipulations in humans⁴. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems^5,6 and can lead to changes in neural activity³.

Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug⁷. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules⁸, correlating with the tip diameter⁹ of the micropipette as well as with the concentration⁸ of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used¹⁰, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.

Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley¹¹ for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain¹²) to a defined brain area¹³ while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette¹³. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly¹⁴ and intracellularly^15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see¹⁷ for a comparison of recent pressure injection systems).

An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.

The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.

Protocolo

cuidados com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com cuidados com os animais leis alemãs do BCE e aprovados pelo governo distrital de Braunschweig, Lower Saxony, Alemanha.

Nota: Como a experiência é realizada in vivo, é crucial para manter os mais elevados padrões de higiene possíveis. Sempre que possível, trabalhar em condições estéreis.

1. Preparar o sistema de injeção / Gravação

1. Esteriliza-se o tubo que liga a micropipeta com a seringa. Use o menor comprimento do tubo possível no set-up experimental entre a bomba de injeção e sistema de gravação eletrofisiológico.
2. Limpar os tubos de guia do sistema de gravação usando fios de limpeza. Mergulhá-los em óleo de silicone estéril e alimentá-los através dos tubos de guia individuais várias vezes.
3. Inserir a micropipeta de vidro de quartzo em um tubo de guia do sistema de gravação. Veja a Figura 1A.
4. Depois de corrigir a micropipeta emo sistema de gravação, conecte o tubo estéril para o pino de metal da micropipeta. Cuidar; embora a micropipeta é fixo no sistema, ele pode facilmente quebrar quando colocar o tubo. Use duas pinças estéreis para aplicar pressão igual no pino e tubo.
5. Use cola super líquidos para selar a junção entre o tubo e micropipeta. Espere pelo menos 3 horas para a cola para endurecer antes de encher o micropipeta com líquido.
6. Inserir microeléctrodos (por exemplo, vidro de quartzo isolados de tungsténio platina) nas outras posições do sistema de gravação, antes ou após a inserção micropipeta.

2. Preparação da Substância

1. Esterilizar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga para posterior armazenamento de soluções de injecção utilizando uma autoclave ou outro procedimento fiável.
2. Pesa-se o cloridrato de escopolamina substância correspondente para preparar 5 ml de uma solução 0,1 molar. Dissolve-se em solução salina estéril (NaCl a 0,9%).
3. Sob condições de estéril ind exaustor de fumos, filtrar a solução através de um filtro de seringa com suficientemente grande diâmetro de poro, por exemplo, de 0,2 um.
4. Sob o exaustor de fumos, alíquota da solução em quantidades suficientes para uma única experiência, por exemplo, por escopolamina, 500 ul em tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,5 mL. Use tubos escuros para proteger a substância da luz; alternativamente, enrole tubos em papel de alumínio. Para escopolamina, armazenar a solução durante até 14 dias a 4 ° C.

3. Preparação diário do sistema de injecção / Gravação

Nota: Quando montado no sistema de gravação, os eléctrodos e micropipeta são armazenados em uma solução de enzima (Tergazyme, solução a 1% com água desionizada) entre as gravações. Os seguintes passos devem ser realizados antes de cada gravação.

1. Recolher um tubo de a substância a ser injectada. Permitir que ele para chegar a RT se refrigerado.
2. Retirar o sistema de injecção / gravação a partir da solução de enzima e enxaguar eléctrodose micropipeta com água desionizada para limpar completamente da solução de enzima.
3. Remova a tampa frontal do sistema de registo, a fim de verificar visualmente a vedação entre micropipeta e tubo.
4. Aplicar o óleo de silicone estéril para a abertura do tubo guia (ver Figura 1A) e pontas dos eléctrodos e micropipeta, a fim de lubrificar o sistema para um movimento suave.
5. Confira dicas de eléctrodos e micropipeta usando um microscópio para garantir que eles estão intactos. Alinhar os eléctrodos e a micropipeta sob o microscópio de modo que elas se estendem para fora dos tubos de guia com o mesmo comprimento. Levá-los para os tubos de guia, parando assim que eles não são mais visíveis. Isto é definido como a posição zero do eletrodo. Definir a profundidade dos eletrodos e micropipeta a 0 no software.
6. Encher uma seringa estéril, com solução salina estéril e inserir a agulha no interior do tubo, tendo o cuidado de não perfurar a parede do tubo. Conduzir a micropipeta para fora do tubo guia para visucontrole al do fluxo de substâncias.
7. Lave, pelo menos, 2 ml de solução salina estéril através do tubo da micropipeta e para assegurar que não permanece ar na seringa ou no tubo. Não aplicar demasiada pressão ao êmbolo da seringa. Assegurar a junção entre o tubo e é selado micropipeta. Se a fuga é visível, re-cola a junção (veja o passo 1.5) e adiar a gravação.
8. Encha uma nova seringa estéril, com a solução a ser injectada e trocá-lo com o tambor da seringa salina, isto é, manter a agulha da seringa cheia com solução salina no tubo. Certifique-se de que nenhum ar é transferido para o sistema. Este é melhor conseguido através do enchimento do centro da agulha com solução salina após a remoção do tambor cheio de solução salina.
9. Lavar o sistema com 250 ul da solução a ser injectada, a fim de remover completamente a solução salina do tubo.
10. Utilizando o software de controlo do motor, retrair e eléctrodos de micropipeta no guidetubesto uma profundidade de pelo menos -500 uM.
11. Baixa o anel de tubo de guia (Figura 1A) para a parte inferior dos tubos de guia para manter a sua posição relativa fixa.
12. Limpe a base do sistema com etanol, em especial quando se vai tocar câmara de gravação do macaco.
13. Feche o sistema de gravação, substituindo a tampa frontal e apertar os parafusos.

4. Validação do Sistema de Injeção

Nota: Embora a empresa calibra o sistema, é recomendado para validar os volumes ejectadas com os materiais utilizados no conjunto experimental (tubos, seringas, etc.).

1. Prepara-se o sistema tal como descrito na etapa 3, mantendo-se os eléctrodos e micropipeta estendidos para fora dos tubos de guia. Uma profundidade de pelo menos 7.000 uM é recomendado para evitar a perda de volume de medição devido a aderência ao longo da superfície exterior da micropipeta e eléctrodos.
2. Colocar o sistema de gravação na posição em que vai ser utilizado no durante a experiência e colocar o Syringe na bomba de microinjecção. Fixar a seringa no local usando a faixa de borracha e aderência ajustável (ver Figura 1A). Deslize a parte móvel da bomba até que ela esteja firmemente no lugar por trás do êmbolo da seringa.
3. Usando a unidade de motor controlado por software, ejectar um volume suficientemente grande para ser medido com precisão, por exemplo., 1000 NL. É preferível utilizar um único passo para ejectar o volume total a fim de evitar efeitos de acção capilar ao longo da superfície da micropipeta. Velocidades muito baixas (1 nl / s) também pode conduzir a este efeito durante o processo de validação.
4. Recolhe-se o volume total, em um recipiente colocado sob a micropipeta, ou recolha cuidadosamente gota a ejectado directamente a partir da ponta da micropipeta. Estimar o volume ejetado usando uma pipeta ou por pesagem, com uma balança de precisão.
5. Repita o procedimento várias vezes para confirmar as medições.

5. Recordings aguda

1. Definir a posição xydo sistema de gravação. Isto define o ponto no qual os tubos de guia atingir a dura-máter no interior da câmara de gravação cronicamente implantado. Certifique-se os tubos de guia estão retraídos completamente (tubo guia posição z 0).
2. Traga o sistema de gravação para a posição e coloque a seringa na bomba de microinjecção. Fixar a seringa no local usando a faixa de borracha e aderência ajustável (ver Figura 1A). Deslize a parte móvel da bomba até que ela esteja firmemente no lugar por trás do êmbolo da seringa. Se uma gota de substância é visível na ponta dos tubos de guia, remova-o cuidadosamente com um cotonete estéril.
3. Prepare o animal para a gravação de acordo com o procedimento do laboratório (ver ^18, por exemplo, orientações).
4. De forma segura montar o sistema de gravação na câmara de gravação do macaco.
5. Lentamente, abaixe manualmente os tubos de guia para a câmara de gravação até que a dura é atingido, em seguida, conduzir os eletrodos utilizando o co motorasoftware ntrol.
6. Como não é possível medir a impedância da micropipeta, primeiro carro com eletrodos e verificar suas impedâncias regularmente em diferentes profundidades. Após uma penetração da dura-máter é realizada com sucesso, sem danificar os eletrodos, o avanço da micropipeta.
7. Conduzir os eléctrodos e a micropipeta com a profundidade eléctrodo alvo em que a área do cérebro de interesse deverá ser encontrado. Lentamente avanço do eléctrodo até que esteja perto o suficiente para registar a actividade de uma única unidade, tal como evidenciado por uma boa razão sinal-para-ruído no sinal gravado. Importante, posicionar o eléctrodo de registo e a micropipeta com a mesma profundidade para assegurar a distância mínima entre o eléctrodo e micropipeta.
   1. Se possível, mantenha os eletrodos e micropipeta a essa profundidade para toda a gravação. No entanto, se a única maneira de manter uma qualidade de sinal da célula registada é mover os eléctrodos, em seguida, conduzir os eléctrodos e a micropipetasimultaneamente para manter a distância entre eles.

6. atenção espacial Task

1. Numa série de ensaios, apresentam dois padrões de pontos que se deslocam sobre a tela, uma posicionada no interior do campo receptivo do neurónio gravado e o outro lado de fora da mesma, em conjunto com um ponto de fixação apresentado centralmente que o animal tem que foveate ao longo de cada ensaio ^{19, 20.}
   Nota: O macaco é treinado para responder a uma mudança de direcção no padrão de pontos com pistas (o evento de destino), ignorando qualquer mudança de direcção do outro padrão de pontos, e é recompensado com uma gota de líquido para cada conclusão bem sucedida de um processo ^{19, 20.} Como uma condição de controlo sensorial, o macaco tem que se apresentar uma mudança de luminância do ponto de fixação, ignorando ambos os padrões de pontos em movimento (ver Figura 2 para uma descrição mais detalhada da tarefa).

7. manipulação farmacológica durante a gravação

Nota: Enquanto o macaco está realizando a tarefa, injetar a substância de um modo em blocos. Três blocos consecutivos são definidos: controlo, que actua como uma linha de base; injecção, durante o qual a substância é ejectado; e a recuperação, durante os quais as células alvo por injecção o retorno à linha de base.

1. Durante um bloco de injecção, injectar uma quantidade predefinida de substância, a intervalos regulares, por exemplo., 2 nl a cada minuto a uma taxa de 2 nl / s. Para este exemplo, usar cloridrato de escopolamina. O processo de injeção é controlado através de software que fornece várias opções. Por exemplo, usar a função etapa para definir o volume de injecção, e pressione o botão de injecção cada minuto de acordo com o relógio do software de gravação.
   Nota: A duração exacta do bloco de injecção é experimentar substância e dependente, por exemplo, para uso escopolamina 2 injecções de nl a cada minuto durante 10 min (20 nl no total).. É preferível não fazer avançar os eletrodos e duri micropipetang do bloco de injeção.
2. Registar o tempo e o ensaio durante o qual a substância é injectada, a profundidade dos eléctrodos e micropipeta, bem como a quantidade de substância ejectado.
3. Siga o bloco de injecção com um bloco de recuperação, em que nenhuma substância é injetada. A duração do bloco de recuperação é substância específica e precisa ser definido no pré-testes. Monitorizar e manter a qualidade de gravação das unidades individuais seleccionados até ao fim do bloco de recuperação.
4. Repita os três blocos por tanto tempo quanto a qualidade de gravação e motivação do macaco permitir.

8. Procedimentos Pós Gravação

1. Após a gravação de dados, retraia eletrodos e micropipeta para os tubos de guia e, em seguida, retirar manualmente os tubos de guia. Retirar o sistema de gravação a partir da câmara de gravação do macaco. Libertar a seringa da bomba de injecção e transferir o sistema para a área de preparação para a limpeza.
2. Lidar com o animal(incluindo a limpeza da câmara de gravação ¹⁸⁾ de acordo com os procedimentos padrão do laboratório e retorná-lo para a instalação de alojamento.
3. Lavar o exterior dos tubos de guia com peróxido de hidrogénio (3%) e depois com água desionizada. eléctrodos de accionamento e micropipeta fora dos tubos de guia, lavar com água oxigenada e água, em seguida deionizada.
4. Trocar o cilindro da seringa com um tambor de uma seringa cheia com solução salina estéril, mantendo a agulha no tubo. Lavar o tubo e a micropipeta com 1-2 ml de solução salina. Após a lavagem, retire o cano e preenchê-lo com o ar. Insira novamente o tambor para dentro da agulha e secar o tubo e a micropipeta a partir do interior, pressionando suavemente ar através.
5. Armazenar os tubos de guia, os eléctrodos alongados e micropipeta imersos na solução de enzima a fim de evitar secagem, bem como para assegurar que a repartição de material orgânico.

Resultados

A Figura 2 representa a tarefa espacial atenção o macaco realizada enquanto o processo de injecção foi realizada. O macaco foi treinado para atender tanto o estímulo localizado dentro do campo receptivo do neurônio gravado (assistir-in), o estímulo localizado fora do campo receptivo (assistir-out) ou no ponto de fixação (assistir-fix). Estas condições permitem uma comparação da actividade neuronal em diferentes estados de atenção.

A Figura 3 mostra um histograma tempo peri-estímulo de um neurónio amostra em uma experiência usando a escopolamina, um antagonista colinérgico muscarínico. A trama mostra a supressão da resposta durante a injeção de escopolamina versus sem injeção, quando um padrão movendo-se em direção preferencial da célula é apresentado dentro de campo receptivo do neurônio e é atendido pelo animal. Os primeiros dois picos representam o neurónio9; s resposta à dentro e deslocamento da sugestão espacial, que aparece dentro de seu campo receptivo. Isto é seguido pela resposta ao padrão de movimento que aparece na tela de 500 ms após o início cue. O cinza área sombreada representa o período de análise utilizado para calcular a taxa média de queima para cada julgamento. A área verde destaca a influência supressiva da injeção de escopolamina na taxa de disparo da célula. A região verde escuro mostra a supressão dentro do período de análise.

A Figura 4A mostra o efeito da escopolamina sobre a taxa de disparo do neurónio média da amostra em cada uma das três condições de atenção. taxa do neurónio de disparo para as duas condições atenção espacial (atenção, dentro ou fora do campo receptivo do neurónio de gravação), bem como para a condição sensorial (atenção no ponto de fixação) caiu logo após a primeira injecção do bloco de injecção (sombreado cinzento estamosa) e o bloco durante a recuperação aumentada, após um atraso ao mesmo nível que antes da injecção.

A Figura 4B mostra um controlo de gravação a partir de um segundo neurónio amostra em que soro fisiológico (0,9% NaCl) foi injectada, utilizando o mesmo protocolo como para a injecção de escopolamina. Durante a injecção de bloquear não foi observada nenhuma alteração na taxa de disparo do neurónio de comparação com o bloco de controlo.

Figura 1. Set-up usado para manipulação farmacológica durante a gravação. (A) mostra a bomba de microinjecção e o sistema de gravação eletrofisiológico equipado com eletrodos e micropipeta. A diferença guidetube, em que o óleo de silicone é inserida para lubrificar os eléctrodos e micropipeta, é mostrada ampliada. (B) Exibe um exemplo micropipeta (acima)e eléctrodo de registo (abaixo). Para comparação do tamanho, um centavo de euro (diâmetro: 16 mm). É colocado debaixo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Projeto de tarefas para guiar a atenção espacial. Monkeys foram treinados para detectar uma mudança da direcção de movimento no padrão de pontos cued. A sugestão foi seja colocado dentro do campo receptivo do neurónio (assistir-in), como mostrado na figura, ou fora dela (assistir-out). Como controle sensorial, o macaco foi treinado para detectar uma mudança de luminância do ponto de fixação (assistir-fix). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Influência da escopolamina antagonista na taxa de disparo. O histograma tempo peri-estímulo para um neurônio amostra é mostrado para o attend-in condição (atenção dentro do campo receptivo do neurônio gravado) durante o bloco de injecção e durante o bloco de controle. O eixo dos x representa o tempo em milissegundos após o início do taco e o eixo y mostra a taxa de disparo em espigas / seg. A área cinzenta representa o período de análise (300-800 ms após o início do estímulo) usado para calcular a taxa de disparo média-julgamento. A área sombreada verde mostra a supressão na taxa de disparo nas duas condições. A cor verde escuro realça a supressão dentro do período de análise. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Efeito da escopolamina e solução salina na taxa de disparo. Injecção de escopolamina (A) antagonista. A taxa de disparo média-ensaio da célula de amostra a partir da Figura 3 ao longo da experiência é mostrado para o estímulo preferida para todas as três condições de atenção. O eixo x representa a hora de início de teste em minutos e o eixo dos Y mostra a taxa de disparo da unidade de espigas por segundo. símbolos ( assistir-in, assistir-fix, assistir-out) representam taxa de disparo do neurônio dentro do período de análise em cada prova realizada com sucesso, e as linhas horizontais (linha sólida: assistir-in, linha pontilhada: assistir-fix, linha tracejada: assistir-out) mostram taxa média de disparo para o três bl experimental diferenteocks (controle, injeção, de recuperação). A cinza área sombreada mostra o bloco de injecção, começando com a primeira injecção e que termina 1 min após a última injecção. Durante a injecção bloco 2 nL de 0,1 molar escopolamina foram injectados cada minuto com uma velocidade de injecção de 2 nl / s. (B) injeção de solução salina. A taxa de disparo de uma célula de amostra ao longo da experiência de controlo é mostrado para o estímulo preferida para todas as três condições de atenção. Cinza área sombreada visualiza o bloco de injeção de solução salina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui temos ilustrado em detalhes como realizar injeções fiáveis ​​e precisos e gravações de uma única célula de alta qualidade com um sistema de injeção de pressão "off-the-shelf". Embora este método de administração de fármaco tenha sido previamente usado em comportando macacos (revisto em ^17), o sistema aqui apresentado tem vantagens, analisados ​​a seguir.

Como ilustrado na Figura 4A, o sistema aqui descrito pode fornecer uma medição única estável de actividade neuronal com e sem injecções farmacológicos na vizinhança directa do local da gravação. Como mostrado na Figura 4B, a injecção de uma substância de controlo, soro fisiológico, não conduzir a uma mudança na taxa de disparo. Este controlo demonstra que o próprio processo de injecção não tem nenhuma influência mensurável sobre as propriedades de disparo dos neurónios gravados.

A configuração espacial do neurónio, eléctrodo de registo, e micropipeta é de fundamental importância nestas experiências. Embora uma medida precisa de suas posições relativas no tecido durante a gravação não for possível, pode-se considerar e controle para possíveis fontes de variação. Em primeiro lugar, durante a injecção do volume existe um risco de que o neurónio de interesse pode ser deslocada para fora do eléctrodo de registo, que afectam a estabilidade de sinais gravados. Por essa razão, é prudente para comparar a taxa de disparo antes e depois do bloco de injecção para verificar a estabilidade de sinal. Em segundo lugar, a configuração do tubo de guia do sistema de registo define a distância entre os eléctrodos e micropipeta (por exemplo., 305 uM no sistema de três-canal concêntrico utilizado nesta experiência). À medida que o sistema proporciona um controlo preciso para a posição de profundidade de eléctrodos e micropipeta no tecido, a distância entre eles pode ser minimizado através da calibração cuidadosamente profundidade relativa antes de gravar (passo 3.5), e mantendo-os a uma profundidade comum durante gravações.

ent "> limitações potenciais
Além de in-house de controle de qualidade pelo fabricante, o sistema precisa ser validado em condições de laboratório, como diferentes marcas de tubos, seringas etc. pode ser usado e pode levar a diferenças nos volumes ejetados. Embora o sistema possa ser utilizada para injectar volumes muito pequenos como na experiência mostrada aqui, estes são a seguir o volume mínimo que pode ser validado devido aos limites de medição práticos num ambiente normal de laboratório. No entanto, os volumes de injecção de maior dimensão pode ser usada para inferir a relação entre o volume definido pelo software e o volume ejectado pelo hardware. Se são utilizados tubos transparentes, um controlo visual adicional do processo de injecção é possível através da medição do deslocamento de um marcador visual.

Inserindo a micropipeta para o sistema é mais exigente do que a inserção do eléctrodo, como o diâmetro da micropipeta é ligeiramente maior e o material é mais frágil. Além,juntar o tubo para o pino da micropipeta é um desafio uma vez que implica um elevado risco de quebrar a parte superior da micropipeta. No entanto, o tempo de vida de uma micropipeta carregado com êxito é de vários meses, mesmo com o uso diário.

Na prática, significa que ainda não encontrou um bloqueio no sistema de injecção durante a limpeza pós-gravação do sistema. No entanto, nenhuma verificação de "on-line" é possível, e há um risco de que um bloqueio físico (tal como o tecido na ponta da micropipeta) pode evitar a injecção de substâncias. Portanto, pode ser aconselhável para analisar os dados de forma conservadora, como incluindo apenas as células em uma análise mais aprofundada que apresentam alterações significativas em disparar as taxas entre controle e injeção de blocos do experimento.

Apesar de seu pequeno diâmetro, microeletrodos e pipetas irá deslocar o tecido cerebral e pode causar algum dano tecidual local. Isto pode ser minimizado por posicionamento manualmente a ponta do thtubos e guia logo acima da dura-máter. Os eletrodos em seguida, penetrar na dura-máter e sua intactness é inferida medindo suas impedâncias online. Em seguida, a micropipeta é inserido. Ao usar esta abordagem, a remoção regular do tecido da dura-máter acima é recomendada para reduzir ainda mais o risco de eléctrodo ou pipeta ruptura.

Comparação dos métodos alternativos
O sistema utilizado aqui mostra vantagens claras em comparação com outros sistemas de injeção de pressão. Uma grande vantagem é o diâmetro da micropipeta (aproximadamente 100 uM), que é metade do tamanho de outras sondas disponíveis ¹⁷ e, portanto, minimiza os danos de tecido neural. Em contraste com modelos anteriores, o atual sistema emprega espacialmente separados eletrodo de registro e micropipeta. Embora outros sistemas fornecem uma distância menor entre o eletrodo e pipeta, o sistema descrito aqui permite mudanças de profundidade independentes de eletrodos e pipeta, portanto, permitting distâncias relativas variável dentro de uma sessão de gravação. Mais importante, nenhum compromisso quanto à qualidade de gravação tem de ser feita, como o sistema de injecção é uma extensão de um dispositivo de gravação estabelecida. Embora apenas uma micropipeta e, portanto, uma substância é utilizada neste protocolo, é possível injetar várias substâncias no prazo de um procedimento experimental. Para alcançar este objectivo, vários micropipetas pode ser enfiado para dentro de tubos de guia separados e ligados a seringas montados em bombas de injecção individuais. Finalmente, o sistema de controlo é fácil, uma vez que apenas um programa de computador é necessária para fazer avançar os eléctrodos e micropipeta, e para executar a injecção de pressão durante a experiência.

Comparando injecção pressão para iontoforese, há vantagens e desvantagens relativas. Por exemplo, a injecção de pressão requer um maior volume a ser introduzidas no tecido do que a iontoforese, aumentando assim o risco de deslocamento neuronal. O proto atualcol usado volumes na faixa NL, e raramente experimentaram mudanças perceptíveis na qualidade do sinal de uma célula gravado. O sistema também permite que um maior volume a ser injectado, a qual é potencialmente útil para manipulações comportamentais mas poderia ter impacto estabilidade de gravação neuronal. A clara vantagem de injeção de pressão sobre iontoforese é a maior variedade de substâncias utilizáveis ​​como não há exigência de utilização de substâncias carregadas. No entanto, os valores de pH devem ser verificados e comparados entre substâncias experimentais e de controle (por exemplo., Solução salina).

A pergunta pode surgir por que usar o método de longa data de injeção de pressão em vez de técnicas mais recentes, como optogenética para manipular a atividade neural. Embora bem estabelecido em roedores, Optogenetics ainda não está estabelecida de forma fiável em macacos rhesus. Em particular, ele ainda não permite a manipulação local de células selectivos para um tipo de neurotransmissor particular. A mais longo prazo, vemosgrande potencial para a combinação das vantagens de manipulações farmacológicas com as vantagens de manipulações optogentic na elucidação da base neural das funções cognitivas.

Aqui mostramos como injecção de pressão pode ser usada para manipular farmacologicamente uma área restrita localmente no cérebro de acordado, comportando-se macacos rhesus. Esperamos que este método inspira outros cientistas para investigar as contribuições neuromoduladores para a dinâmica da atividade neuronal.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(-)-Scopolamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339.81 g/mol
NaCl 0.9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	enzyme detergen
Hydrogen peroxide	Roth		Used in 3% solution with deionized water
Ethanol	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Deionized water
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Syringe and needle
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Quarzglass micropipette	Thomas Recording
Recording electrode	Thomas Recording		quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ  and 0.3-0.5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Superglue
Silicon oil	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Syringe filter
Multichannel Micro Injection System	Thomas Recording		multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump
McLab	custom		internal lab software to control stimulus presentation