تسجيل الفأر بالموجات فوق الصوتية لتقييم الالفاظ التواصل الاجتماعي

Summary

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

Abstract

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

Introduction

المرضى الذين يعانون من الاضطرابات العصبية والنفسية عادة ما تعرض العجز في التواصل الاجتماعي (على سبيل المثال، والمرضى الذين يعانون من اضطرابات طيف التوحد وانفصام الشخصية، أو مرض الزهايمر) ^1. الفئران المعدلة وراثيا هي أكثر وأكثر استخداما لنموذج أسباب وراثية من هذه الاضطرابات ^2. دراسة التواصل الاجتماعي في هذه النماذج الماوس هو من فائدة عالية لفهم آليات الطفرات الوراثية مما يؤدي إلى اختلالات اجتماعية شاذة ولاختبار علاجات جديدة. منذ الفئران هي حيوانات اجتماعية والتواصل مع بعضهم البعض باستخدام حاسة الشم، واللمس، وإشارات البصرية والصوتية، فهي نماذج مناسبة لتقييم التواصل الاجتماعي.

تستخدم الآن الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية حاليا منصب وكيل لنمذجة الأسباب الوراثية للعجز الاتصالات الصوتية ^3،4 (ولكن وجود التعلم الصوتية في هذا النوع لا تزال تناقش ^5،6، حتى لو كان القول .. معظم الدراسات الحديثةالبريد لعدم وجود التعلم صخبا ^7). تم العثور على الفئران المعملية لينبعث الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في العلاقات بين الأم والرضيع، في التفاعلات الاجتماعية والجنسية بين الذكور والإناث، في التفاعلات الاجتماعية من نفس الجنس (إعادة النظر في المرجع ⁸⁾ وفي التفاعلات الاجتماعية الأحداث الأحداث ^9. الجراء الماوس تنبعث المكالمات العزلة خلال مباراتين الأسابيع الأولى من الحياة عندما عزل من السد وتتزاحم ^10. الذكور ينبعث الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في حين جود أنثى شبق (أو العظة البولية منها) ^11،12. الذكور والإناث تنبعث النطق بالموجات فوق الصوتية عند التعامل مع مناوع غير معروف من نفس الجنس ^13،14. تنظيم وظائف هذه الالفاظ ليست واضحة تماما وتحتاج إلى مزيد من التحقيقات. يقتصر المعرفة الحالية على الجانب الوظيفي لالاستنباط من السلوك استرجاع الأمهات سماع المكالمات الجرو العزلة، وتسهيل القرب من الإناث البالغات نحو vocalizat الذكور البالغينأيونات ¹⁵ وزيادة السلوك الاستكشافي من الذكور البالغين سماع الكبار الالفاظ الإناث ^16.

تميز خلل في الاتصالات الصوتية في نماذج الفئران من الاضطرابات العصبية والنفسية ينبغي أن تجري في ظروف موحدة لاستبعاد مساهمة كبيرة من الظروف التجريبية. وينبغي لهذه الأوصاف، جنبا إلى جنب مع تقييم التفاعلات الاجتماعية في وقت واحد والدراسات العصبية الحيوية، في النماذج الوراثية المختلفة تحسين معرفتنا حول المساهمة الوراثية إلى جوانب مختلفة من الماوس الاتصالات بالموجات فوق الصوتية. على المدى الطويل، ينبغي أن تعطي مزيدا من الضوء على بعض القواعد العصبية للتواصل الاجتماعي في البشر. ونحن نهدف حاليا إلى توفير بروتوكولات بسيطة للحصول موثوق الالفاظ بالموجات فوق الصوتية خلال تطوير وفي مرحلة البلوغ لكل من الفئران الذكور والإناث في المختبر. وينبغي لهذه البروتوكولات تخفيف توحيد التسجيلات للمقارنة بين أكثر موثوق غلاهانبعاثات النطق asonic بين السلالات والمختبرات. وينبغي أيضا أن تسهل إنشاء هذه التسجيلات في المختبرات عدم وجود خبرة سابقة مع الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية التسجيلات. نحن أيضا تسليط الضوء على إمكانية الحالية في الجمع بين البيانات الالفاظ بالموجات فوق الصوتية مع البيانات السلوكية التفصيلية التي تم جمعها في وقت واحد خلال التفاعلات الاجتماعية في فئران بالغة، للحصول على معلومات حيوية عن العاهات الاجتماعية فضلا عن سياق الانبعاثات من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية. وهذه التحليلات تلقي ضوءا جديدا على تنظيم وظائف الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية. وأخيرا، ونحن أيضا الإعلان عن إمكانية تبادل التسجيلات النطق بالموجات فوق الصوتية مع المجتمع العلمي كله على قاعدة البيانات mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). فتح الوصول إلى البيانات تسجيل الصوت يجب تعزيز المعرفة على الماوس الاتصالات بالموجات فوق الصوتية عن طريق السماح للعلماء لمقارنة البيانات الخاصة بها مع الالفاظ بالموجات فوق الصوتية المسجلة في لبو الآخرينratories (مع سلالات / بروتوكولات مماثلة أو مختلفة)، و / أو لتحدي طرق التحليل مع الملفات المسجلة في ظل ظروف مختلفة.

Protocol

بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات وتمت الموافقة من قبل COMITE دي Ethique أون التجريب أنيمل (CETEA) رقم 89 في معهد باستور في باريس.

1. إعداد الحيوان

1. لتسجيل المكالمات الجرو العزلة، الحصول على الإناث الحوامل من سلالة الماوس من الفائدة. ملاحظة: تولد من الذكور والإناث متخالف للحصول على ما لا يقل عن 10 لترا منها من النوع البري، متخالف وخروج المغلوب الجراء للحصول على الحيوانات السيطرة قوية.
2. الحصول على فئتين من فئران بالغة لتسجيل الالفاظ خلال التفاعلات من نفس الجنس.
   1. الحصول على 12 على الأقل من الذكور أو الإناث 12 من كل الوراثي كما الفئران اختبار من سلالة من الفائدة (أن تأخذ في الاعتبار التباين بين الأفراد). ملاحظة: هذا البروتوكول هو مناسبة تماما للبالغين، ولكن يمكن تعديلها للأحداث، مع انخفاض الوقت العزلة قبل التجربة ^9. يعمل هذا الاختبار للذكور أو الإناث. ومع ذلك، تجنب اختبار الذكورالصورة من سلالات الفئران التي تعرض النمط الظاهري العدوانية واضح في اختبار التفاعل الاجتماعي بين الذكور.
   2. لتحقيق أقصى قدر من التفاعل affiliative، عزل الحيوانات اختبار قبل التجارب. منزل الذكور على حدة لمدة 3 أسابيع (للحد من التفاعلات العدوانية إلى الحد الأدنى ^14،17) والإناث لمدة 3 أيام (E. EY، بيانات غير منشورة) لزيادة الدافع الاجتماعي.
   3. الحصول على الذكور أو الإناث من سلالات ممثل الخلفية الوراثية للسلالة اختبار لاستخدامها كما هو والقادمين الجدد (على سبيل المثال، كما الفئران التفاعل، انظر 3.1.3). على سبيل المثال، إذا كان قد تم إنشاء سلالة متحولة قيد الدراسة على / 6J خلفية C57BL، استخدم C57BL / 6J الفئران كما هو والقادمين الجدد. احسب عدد الحيوانات اللازمة بحيث لا يستخدم كل من هذه الفئران أكثر من 2 مرات في اليوم والجديد قادم. إيوائهم في مجموعات.
3. الحصول على فئتين من الفئران الكبار لتسجيل الالفاظ الذكور في جود أنثى شبق.
   1. الحصول على لترشرق 12 من الذكور الناضجة جنسيا من كل الوراثي لسلالة من الفائدة (أن تأخذ في الاعتبار التباين بين الأفراد). ملاحظة: إذا لم يكن لزيارتها الذكور تجربة مع الإناث قبل، ووضعها في أقفاص الفردية وترك لهم قضاء ليلة واحدة مع الإناث قبل يومين من الاختبار لزيادة دوافعهم لينبعث الالفاظ بالموجات فوق الصوتية ^(6).
   2. الحصول على الإناث الناضجة جنسيا من سلالة خلفية الذكور المسجلة. على سبيل المثال، إذا كان الذكور متحولة قيد الدراسة تم إنشاؤها على / 6J خلفية C57BL، استخدم C57BL / 6J الإناث. حساب عدد الإناث اللازمة بحيث لا يستخدم كل من هذه الفئران أكثر من 3 مرات في اليوم. إيوائهم في مجموعات.

2. يدعو عزل الجرو

1. الجرو تحديد
   1. قبل ثلاثة أيام من اليوم المتوقع للميلاد، عزل الإناث الحوامل.
   2. تحقق من الإناث ولادة كل صباح ومساء كل يوم. لاحظ يوم الولادة كما P0.
   3. تحديد الجراء في P1 باستخدام طويلة الأمد الوشم مخلب (حقن تحت الجلد الوشم الأخضر لصق مع 0.3 ملم × 13 ملم [30 G ½ "] إبرة). إنشاء كود واحد، اثنان، ثلاثة أو أربعة الكفوف ملحوظ. كن كما في أسرع وقت ممكن، لزعزعة الحد الأدنى من الجراء، ووضعها من جديد في العش في أقرب وقت ممكن.
2. إعداد قفص لدعوات عزل سجل الجرو.
   1. استخدام إما غرفة عصامي عازلة للصوت (الشكل 1A) أو مربع الستايروفوم بسيط. وضع ميزان الحرارة داخل منطقة الجزاء لمراقبة درجة الحرارة في كل تسجيل. تأكد من أن درجة الحرارة لا تزال بين 18 درجة مئوية و 22 درجة مئوية.
   2. وضع الميكروفون في الجزء العلوي (من خلال ثقب في الجزء العلوي من مربع). ضبط ارتفاع الميكروفون بحيث غشاء الميكروفون هو 12-15 سم فوق الجزء السفلي من مربع حيث الجرو سوف الاستلقاء. توصيل الميكروفون لبطاقة الصوت، وبطاقة الصوت إلى الكمبيوتر.
   3. لضبط كسب سوالثانية بطاقة، وإجراء محاكمة تسجيل مع الجرو التي لن يتم استخدامها في التجربة. وضع الجرو في نفس الظروف كما هو الحال في التجربة (انظر 2.3.1). أغلق الباب. ضبط الربح الناتج عن بطاقة الصوت، بحيث يكون على القيمة القصوى (لديها أعلى سعة ممكنة لالالفاظ) ولكن من دون إثقال (الاختيار على الشاشة الطيفية الحية على برنامج تسجيل).
      ملاحظة: قد يكون فوق طاقتها وهناك عدد قليل المكالمات إذا كان يتم الاحتفاظ اتساع غالبية المكالمات على أعلى مستوى ممكن.
   4. تسجيل مستوى الربح لكل دورة تسجيل و لا تغييره بين الجراء / الفضلات / جلسات. إن التباين في مستويات الربح يؤدي إلى الكشف عن دعوة غير دقيقة والتدابير المتغيرات الصوتية مع نفس العتبات في التحليلات باستخدام الكشف التلقائي والقياسات (انظر 5،1-5،4).

الشكل 1: إعداد لتسجيل العزلة يدعو من الجراء الماوس والطيفية من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية (أ) مثال من غرفة عازلة للصوت عصامي لتسجيل المكالمات الجرو العزلة. (ب) الطيفية من أنواع المكالمات المختلفة المستخدمة في الحاضر وتصنيف نوع المكالمات، انظر وصف في الجدول رقم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إجراء تسجيل العزلة الجرو يدعو كل يومين. إجراء التسجيلات في الصباح لالجراء ولدت في الليل، وفي فترة ما بعد الظهر لالجراء ولدوا خلال اليوم لتجنب تصنيف في نفس الفئة العمرية الجراء مع نصف يوم من فارق السن. وهذا هو أكثر ما يلفت الانتباه للمراحل P2 الصغار جدا وP4.
   1. خذ الجرو واحدة في القمامة. وضعه في أسرع وقت وبلطف ممكن في مستلم البلاستيك غسلها مع الايثانول 10٪ والمجففة (القطر: 9سم؛ الطول: 10 سم لمنع الجراء كبار السن من الهرب من المنطقة التي تغطيها ميكروفون). وضع المتلقي فقط تحت الميكروفون.
   2. إغلاق مربع بسرعة وبصمت ممكن. بدء تسجيل الجرو الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في برنامج تسجيل (شكل 16 بت، و 300 كيلو هرتز أخذ العينات تردد لالتقاط سعة الصوت يصل إلى 150 كيلوهرتز مع جودة عالية).
   3. بعد الوقت المطلوب للتسجيل قد انقضت (تصل إلى 5 دقائق)، إيقاف التسجيل. تأخذ جرو من خارج منطقة الجزاء. كتابة الوشم مخلب من الجرو.
   4. تأخذ درجة الحرارة إبطي من الجرو مع لجنة التحقيق مقياس الحرارة. علامة الجرو على ظهرها مع نقطة صغيرة مع القلم رائحة أقل (الحبر المياه)، والتعرف أكثر سهولة الجراء سجلت بالفعل في العش عندما يتم اختيار واحدة المقبل وتجنب التلاعب جميع الجراء في كل مرة واحدة الجديد اختيار. وضع الجرو مرة أخرى في العش.
   5. غسل المتلقي البلاستيك والبلاستيكية التي تغطي القاع مع 10٪ من الإيثانول وجففها جيداقبل وضع الجرو المقبل في الداخل.
   6. اختيار الجرو المقبل في القمامة وتكرار 2.3.
4. تحقق من وزن الجسم، التنسيق الحركي، انجذاب بالجاذبية السلبية، وعلامات التنموية (لمزيد من التفاصيل للبطارية اختبار انخفاض الرجاء مراجعة أقسام الأسلوب في Schmeisser وآخرون. ¹⁸ وفي EY وآخرون. ¹⁹⁾ بعد فترة من الراحة من 1 ساعة للسماح لل الجراء للتعافي بعد انبعاث مرهقة من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية. استخدام فوج آخر من الحيوانات إذا أجرى كاملة بطارية اختبار التنموية مثل في Chadman وآخرون. ²⁰ وScattoni وآخرون. ^21.
5. كرر هذه التسجيلات كل يومين بين P2 و P12 لتوصيف الجرو السلوك صخبا والتنمية في جميع أنحاء مباراتين الأسابيع الأولى من الحياة.

3. بالموجات فوق الصوتية الالفاظ خلال نفس الجنس التفاعلات الاجتماعية

1. النطق تسجيلات
   1. إعداد قفص اختبار (50 × 25 سم × 30 جم ^3؛ زجاجي، 100 لوكس [انخفاض كثافة الضوء الأبيض]) تنظيفها بالماء والصابون وتجفيفها ومليئة 2 سم الفراش الطازجة في غرفة عازلة للصوت.
      1. وضع الميكروفون بحيث الالفاظ التي تنبعث من كل ركن من أركان القفص يمكن تسجيلها. تثبيت الميكروفون في زاوية القفص اختبار (سواء على القفص أو على ترايبود) وضبط زاوية الميكروفون القفص أسفل لتغطية سطح القفص بأكمله.
         ملاحظة: الموجات فوق الصوتية هي الاتجاه للغاية.
      2. وضع كاميرا فيديو في الجزء العلوي من غرفة عازلة للصوت للقبض على كامل سطح القفص الاختبار.
         ملاحظة: تأكد من أن الميكروفون لا يختبئ أحد أركان القفص الاختبار على الفيديو.
      3. قبل الاختبار، وضبط كسب كرت الصوت مع ذكر الغيار وأنثى الغيار التي لن يتم استخدامها في التجربة في وقت لاحق. وضع هذه الحيوانات في قفص الاختبار في غرفة تسجيل. ضبط مستوى الربح من بطاقة الصوت لتحقيق أقصى قدر من السعة من الالفاظ سجلت بور لتقليل التحميل الزائد كما رأينا في عرض الطيفية الحية على تسجيل البرامج.
         ملاحظة: الربح يعتمد على المسافة بين الميكروفون والحيوانات اللفظ.
   2. إدخال الحيوان لفحصها (ذكرا أو أنثى، بل وسوف يطلق على "المحتل") في قفص الاختبار على الفراش الطازجة. ترك الأمر روض إلى القفص الاختبار في غرفة عازلة للصوت لمدة 20 دقيقة لتحقيق أقصى قدر من الفائدة للمناوع غير معروف أدخلت في 3.1.3.
   3. بعد هذا الوقت التعود، وإدخال الحيوان 2 ^{الثانية} للتفاعل (إناث من الذكور، أو نفس الجنس والمحتل، ولكن علامات الأذن مختلفة / مخلب الوشم التعرف عليها في وقت لاحق، وسوف يطلق عليه اسم "قادم جديد").
      1. بدء تسجيل الالفاظ بالموجات فوق الصوتية (شكل 16 بت، و 300 كيلو هرتز تردد أخذ العينات لالتقاط سعة الصوت يصل إلى 150 كيلوهرتز مع جودة عالية) والفيديو لالتقاط مقدمة للقادم الجديد في قفص الاختبار. بدء تسجيل شالالفاظ ltrasonic خلال التعود (المحتل وحده) إذا كان هناك حاجة للمقارنة بين مستوى خط الأساس من الانبعاثات النطق أثناء التنقيب عن القفص والتفاعل الاجتماعي.
      2. مزامنة يدويا / بصريا التسجيلات الصوتية والمرئية عن طريق الضغط على مشاهدة الوقت ( "بيب" صوت بالقرب من مكبر الصوت) بالضبط عندما الكفوف الخلفيتين من الماوس الجديد قادم تلمس الارض.
      3. ترك حيوانين تتفاعل في الوقت المطلوب (على سبيل المثال 4 دقيقة، وهي مدة كافية لجمع الالفاظ بالموجات فوق الصوتية كافية).
   4. وضع المحتل وقادم جديد إلى الخلف في أقفاص منزل كل منهما. إفراغ الفراش المستخدمة من القفص اختبار، وغسله بالماء والصابون وجففها مع المناشف الورقية. وضع الفراش الطازجة وضعه مرة أخرى في غرفة عازلة للصوت للاختبار القادم.

4. ذكر الالفاظ خلال التفاعل مع شبق أنثى

1. في وقت مبكر من صباح يوم اختبارالذكور، واتخاذ المسحات المهبلية من كل أنثى لتحديد الوضع الجنسي في إطار دورة شبق.
   1. عقد الأنثى من ذيله والحفاظ لها على الشبكة القفص. استخدام ماصة لشطف عدة مرات المهبل مع 20 ميكرولتر PBS (أي حقن وتذكر نفسها 20 ميكرولتر PBS عدة مرات). يتذكر 20 ميكرولتر برنامج تلفزيوني مع نفس الطرف ماصة. استخدام برنامج تلفزيوني العقيمة، لتجنب أي عدوى إذا الإناث لفحصها لعدة أيام متتالية.
   2. نشر برنامج تلفزيوني يحتوي على تعليق من خلايا المهبل على شريحة. وضع أربع عينات على شريحة واحدة (تحديد الأفراد على جانب من الشريحة مع قلم رصاص). دعونا الشرائح تجف قبل إجراء تلطيخ.
   3. العمل تحت غطاء الدخان المختبر.
      1. إعداد حمام واحد من الذهب الخالص مايو جرونوالد، حمام واحد من محلول الفوسفات عازلة (0.1 م) وحمام واحد من بالغيمزا R (1/20 في حل العازلة الفوسفات).
      2. وضع الشرائح في حمام من الذهب الخالص مايو جرونوالد لمدة 3 دقائق، ثمشطف لهم في حمام من حل العازلة الفوسفات لمدة 1 دقيقة، وأخيرا نقلها لمدة 10 دقيقة في حمام من بالغيمزا R (1/20 في حل العازلة الفوسفات).
      3. بعد ذلك، شطف الشرائح مرة أخرى في حمام من حل العازلة الفوسفات لمدة 10 ثانية، والسماح لهم الجافة.
   4. فحص الشرائح ملطخة تحت المجهر. الإناث التي يمكن استخدامها أثناء النهار هي تلك التي عينات الحالي الكبيرة فقط الخلايا الظهارية متقرن (بدون نواة، الملون باللون الأزرق، شبق الكامل).
2. وضع الذكور في غرفة اختبار لا يقل عن 30 دقيقة قبل اختبارها.
3. النطق تسجيلات
   1. كرر 3.1 إذا لزم الأمر.
   2. إدخال الذكور لفحصها (على الفراش الطازج). ترك له روض إلى القفص الاختبار في غرفة عازلة للصوت لمدة 10 دقيقة.
   3. بعد هذا الوقت التعود، وإدخال امرأة في شبق (بين تلك المختارة من تلطيخ).
      1. بدء تسجيل الالفاظ بالموجات فوق الصوتية والفيديولالتقاط إدخال الأنثى في قفص الاختبار. بدء تسجيل الالفاظ بالموجات فوق الصوتية خلال التعود (الذكور وحدها) إذا كان هناك حاجة للمقارنة بين مستوى خط الأساس من الانبعاثات النطق أثناء التنقيب عن القفص والتفاعل الاجتماعي.
      2. مزامنة يدويا / بصريا التسجيلات الصوتية والمرئية عن طريق الضغط على مشاهدة الوقت ( "بيب" صوت بالقرب من مكبر الصوت) بالضبط عندما الكفوف الخلفيتين للفئران تلمس الارض.
      3. ترك حيوانين تتفاعل في الوقت المطلوب (على سبيل المثال 4 دقيقة، وهي مدة كافية لجمع الالفاظ بالموجات فوق الصوتية كافية).
   4. وضع الذكور والإناث مرة أخرى في أقفاص منزل كل منهما. إفراغ الفراش المستخدمة من القفص اختبار، وغسله بالماء والصابون وجففها مع المناشف الورقية. وضع الفراش الطازجة وضعه مرة أخرى في غرفة عازلة للصوت للاختبار القادم.
      ملاحظة: هو الأمثل لاستخدام كل أنثى شبق مرة واحدة فقط كل يوم (ولكن إذا لزم الأمر يمكنيمكن استخدام ما يصل إلى 3 مرات في نفس اليوم ولكن ليس على التوالي).

5. المتغيرات ليكون استخراجه

1. إعداد الملفات الصوتية للتحليلات. ملاحظة: الإجراء أدناه غير محددة إلى A visoft SASLab Pro و قد تتغير وفقا لالبرمجيات المستخدمة.
   1. قطع الملفات بحيث تبدأ بالضبط في "بيب" للمراقبة الوقت، وإنهاء بعد مدة المطلوب (5 دقائق للحصول على تسجيلات الجرو، 4 دقيقة للتسجيلات الكبار).
   2. تصفية السعة أقل من 30 كيلو هرتز باستخدام فلتر تمريرة عالية (تحرير> مرشح> معلومات الطيران المجال الوقت تصفية، السامي ممر مع تردد 30 كيلوهرتز قطعت). استخدام تجهيز دفعة لتصفية كل الملفات التي تهم (تطبيقات> تجهيز الدفعات> مرشح FIR).
   3. تحديد كل النطق بالموجات فوق الصوتية من خلال تصنيفها مع البرنامج.
      1. استخدام الكشف التلقائي للتسجيلات الجرو (أدوات> التسميات> انضم تسميات من الأحداث الموجي). ضبط عتبة، عقد الوقت والهامش وأو كشف أدق. التحقق يدويا كشف وضبط تسميات إذا لزم الأمر (مستحسن).
      2. استخدام الكشف البصري (يدوي الإدراج من التسميات) للتسجيلات الكبار مع الضوضاء الخلفية (اختيار الالفاظ، انقر على الحق، وإدراج قسم التسمية من علامة).
   4. إنشاء الطيفية. تفعيل قياسات التلقائي المعلمة (أدوات> القياسات المعلمة التلقائي> القياسات المعلمة التلقائية إعداد).
   5. التحقق من "تمكين قياسات التلقائي" و "المعلمات حساب من الطيفية كامل"، وصناديق "التحديث التلقائي". حدد "فصل العنصر": تبادلي (قسم التسميات).
   6. خانات الاختيار لحساب المعلمات المطلوبة الزمنية (مدة عنصر، الفاصل الزمني، تشغيل / وقت الانتهاء) والمعلمات على أساس الطيف (تردد الذروة)، وموقع قياس (ابدأ عنصر، نهاية عنصر، متوسط، ماكس، ومين) .
   7. نسخ ولصق القياساتم في جدول بيانات.
      ملاحظة: للحصول على التسجيلات التي أجريت مع البالغين، وقياس المعلمات على أساس الطيف قد تكون مستحيلة بسبب الضوضاء في الخلفية. استخدام القياسات اليدوية ذروة تردد بالضغط على قيم الترددات المختلفة مباشرة على الطيفية ولصق القيم يدويا في جدول.
2. تحديد سعر المكالمة، أي عدد من المكالمات للدقيقة الواحدة عن طريق تحديد أول عدد من الالفاظ المنبعثة (العدد الكلي للبطاقات). ثم، وحساب سعر المكالمة بقسمة عدد من الالفاظ التي سجلتها مدة (بالدقائق) من الملف.
3. تحديد منظمة الزمنية، أي توزيع فترات زمنية بين المكالمات لتحديد تسلسل منظمة.
   1. حساب الفترات الزمنية بين نهاية النطق ن وبداية النطق ن + 1 باستخدام وقت البدء / نهاية كل التسمية.
   2. إنشاء كثافة توزيع فترات زمنية بين ultrasonالالفاظ جيم.
4. تحديد الدعوة ذخيرة، أي تحديد أنواع المكالمات موجودة في التسجيل. استخدام مثال على تصنيف الواردة في الجدول 1 والشكل 1B.
   1. عندما وصفها كل النطق في 5.1.3، وكتابة اسم نوع مكالمة في التسمية.
   2. حساب العدد الدقيق ونسبة كل نوع الدعوة إلى بناء ذخيرة الصوتية.
5. تحديد الخصائص الصوتية لكل النطق، أي المدة، وذروة التردد (أي تردد وفقا لأعلى السعة) في بداية ونهاية المكالمة، والحد الأقصى والحد الأدنى من ذروة تردد، ويعني تردد إذا قياس التلقائي هو ممكن (الشكل 1B) .
   1. استخدام وظيفة القياسات المعلمة التلقائي في البرنامج لقياس تلقائيا المدة، وخصائص تردد الذروة (على سبيل المثال، بداية، نهاية، متوسط، كحد أقصى، والحد الأدنى) في التسجيلات الجرو.
   2. استخدام مدة التسمية كما مدة النطق للتسجيلات الكبار. قياس يدويا على نافذة الطيفية خصائص تردد الذروة (على سبيل المثال، بداية، نهاية، كحد أقصى، والحد الأدنى).
6. زوجان بيانات النطق بالموجات فوق الصوتية والبيانات التفاعل الاجتماعي (MiceProfiler المساعد من المنصة الجليدية ^22).
   1. تأكد من مزامنة بأكبر قدر من الدقة الصوت وتسجيلات الفيديو كما هو موضح في البروتوكول.
   2. ترميز الفيديو من التفاعل الاجتماعي باستخدام الفئران التعريف المقتفي المساعد للمنصة الجليدية كما هو موضح في دي تشاومونت وآخرون. ^22. بدء تتبع بالضبط عندما الكفوف الخلفيتين الحيوان قدم تلمس الارض.
   3. تحميل المشفرة ملف الفيديو وملف xml المقابلة لها (الناتجة عن الفئران التعريف المقتفي) في الفئران التعريف فيديو صانع تسمية المساعد للمنصة الجليدية كما هو موضح في دي تشاومونت وآخرونآل ^22.
      ملاحظة: إن الفئران التعريف فيديو صانع تسمية المساعد تصل ملف الفيديو وملف نصي الناتجة عن تحليل الملفات الصوتية إذا كان لديهم نفس الاسم تلقائيا (انظر: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) .
   4. بعد التحقق من أن حجم الفأر هو الصحيح، انقر على "إنشاء USV احصائيات" لكل ملف للحصول على عدد ونسبة من الالفاظ التي تنبعث في كل مناسبة اجتماعية في ملف فصل.

6. تحميل الملفات على قاعدة البيانات mouseTube

1. تأكد من أن الملفات موجودة على خادم التخزين التي يمكن الوصول إليها من خارج المؤسسة.
   ملاحظة: سوف خوادم استضافتها في بعض المؤسسات مع مستويات الأمان العالية في حاجة إلى تكوين معين لتكون في متناول الناس تتصل من خارج المؤسسة.
2. انتقل إلى موقع mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). تسجيل الدخول (تسجيل الدخول لوتعزى الثانية كلمة المرور لكل مستخدم من قبل مسؤولي).
3. تحقق ما إذا كانت سلالة الماوس سجلت بالفعل موجودا في قاعدة البيانات mouseTube عن طريق النقر على زر "التوترات". إن لم يكن، ونطلب من المسؤولين لإنشائه.
4. إنشاء المواضيع باستخدام "المواضيع> إنشاء" الزر. أدخل الرموز التعرف على الحيوانات المسجلة. جمعهم في مجموعات لتسهيل استرجاعها في وقت لاحق من البيانات.
5. أدخل وصفا للبروتوكول يستخدم لتسجيل الالفاظ بالموجات فوق الصوتية باستخدام "بروتوكولات> إنشاء" الزر.
6. إنشاء تجربة لكل دورة تسجيل باستخدام "تجارب> إنشاء" الزر. تحديد البروتوكول، ومجموعة من الأفراد التي تم تسجيلها، والأجهزة والبرامج المستخدمة وخصوصياتها.
   ملاحظة: تجربة تجمع جميع البيانات المقابلة لملفات النطق.
7. إنشاء ارتباط إلى الملفات النطق باستخدام "Vocalisations> إنشاء & #34؛ زر. حدد التجربة ضمن القائمة. نسخ ولصق عنوان URL للملف النطق (هذا الرابط يبدأ ب http: // ...) في الحقل المقابل من "ملفات لربط" العمود. التحقق من صحة المدخلات عن طريق النقر على زر "إنشاء رابط بين mouseTube والملفات".
   ملاحظة: ليس مطلوبا لملء كل مربع لكل ملف في نفس الوقت.
8. إذا لزم الأمر، تعديل الروابط دخلت في أي لحظة، وإضافة التفاصيل في قسم "ملاحظات" لل. لا تتردد في كتابة الملاحظات لاعطاء مزيد من التفاصيل. على سبيل المثال، إذا كان الارتباط تجاه ملف الفيديو التي تم تسجيلها في وقت واحد مع ملف صوتي تم إدخال، وهذا يمكن أن تكون محددة في "ملاحظات".

النتائج

مع البروتوكولات الحالية، نحن ميزت سلوك صخبا من الفئران التي تفتقر ProSAP1 / Shank2، جينة مرتبطة باضطرابات طيف التوحد (ASD) ^23-25. تتميز ASD بواسطة العجز في التواصل الاجتماعي والسلوكيات النمطية ^1. عرض الفئران وفرط النشاط، وزيادة القلق والاتصالات الصوتية شاذة ^{18،26 -} لدينا Shank2 ^{- /.} في الواقع، لاحظنا أن Shank2 ^{- / -} الفئران عرض ملف تعريف التنموي شاذة في معدل انبعاثاتها من المكالمات الجرو العزلة بالمقارنة مع نموذجي مقلوب منحنى على شكل حرف U في تتزاحم من النوع البري من Shank2 ^{- / -} الفئران عرض زيادة سعر المكالمة في P4 وانخفض سعر المكالمة في P6 في مقارنة مع تتزاحم من النوع البري منها (الشكل 2). نحن أيضا لاحظنا سعر المكالمة انخفضت في التفاعلات الإناث التي تنطوي على Shank2 ^{- / -} الأنثى في comparisoن مع التفاعلات التي تنطوي على littermate البرية من نوع (الشكل 2). درسنا جعبته من 5 فئات الدعوة مختلفة. ويبدو أن تكون مختلفة بين الجراء (على سبيل المثال هنا P2، P6 وP10) والكبار (الشكل 3). وكانت الخلافات المتعلقة الوراثي كبيرة معظمها في مرحلة البلوغ. خلال التفاعلات الاجتماعية التي تنطوي على الكبار Shank2 ^{- / -} الذكور أو الإناث مع الإناث C57BL / 6N، تم تسجيل المكالمات أكثر القصيرة والمكالمات غير منظم بالمقارنة مع التفاعلات التي تنطوي على تتزاحم من النوع البري منها (الشكل 3D و E). المكالمات أقل تعقيدا وتردد يقفز تم تسجيل المكالمات أيضا خلال التفاعل مع الأنثى / 6N C57BL تنطوي Shank2 الكبار ^{- / -} إناث مقارنة مع التفاعلات التي تنطوي على Shank2 ^{+ / +} إناث (الشكل 3E). وأخيرا، قمنا بقياس أيضا المتغيرات الصوتية يدويا. لم يكن هناك ذات الصلة الوراثي الفارق الواضح دوتطوير الحلبة. في المقابل، فإن مدة المكالمات المسجلة خلال التفاعلات التي تنطوي على Shank2 الكبار ^{- / -} كانت الإناث أقصر من تلك التي سجلت خلال التفاعلات التي تنطوي على تتزاحم من النوع البري من الشكل (4A). سلطنا الضوء أيضا أن ذروة تردد من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية زاد خلال تطوير الجرو دون فرق ذات الصلة راثى كبير ^26. خلال التفاعلات التي تنطوي على Shank2 ^{- / -} الذكور أو الإناث مع الإناث C57BL / 6N، كان الالفاظ بالموجات فوق الصوتية انخفاض ذروة تردد بالمقارنة مع المكالمات المسجلة خلال التفاعلات التي تنطوي على تتزاحم من النوع البري منها (الشكل 4B).

وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا البروتوكول أيضا إلى دراسة سياق الانبعاثات من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية من خلال الجمع بين بيانات من التسجيلات الصوتية للبيانات السلوكية المستخرجة من MiceProfiler (البرمجيات الجليدية، معهد الماضي يورو، باريس). على سبيل المثال، في التفاعلات الإناث والإناث، وتنبعث معظم الالفاظ بالموجات فوق الصوتية عندما كانت الحيوانات في الاتصال، وأكثر تحديدا المحتل استنشاق منطقة الشرج الأعضاء التناسلية للقادم الجديد، أو على الأقل المحتل بالوقوف وراء قادم جديد. كما تنبعث الفئران العديد من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية عندما اقترب المحتل لقادم جديد (الشكل 5، اللوحة العليا). سجلت الالفاظ أقل عندما Shank2 المحتل ^- كانت الفئران في اتصال جسدي مع قادم جديد (على سبيل المثال، استنشاق منطقة الشرج الأعضاء التناسلية للقادم الجديد) مما كانت عليه عندما كان المحتل من النوع البري الماوس ^{- /.} وقد أثار الالفاظ أقل عندما كان المحتل وراء قادم الجديد Shank2 ^{- / -} الماوس مما كانت عليه عندما كان من النوع البري الماوس. سجلت عن الالفاظ أيضا عندما كان من الوافدين الجدد في المجال البصري للفأرة المحتل، وأكثر من ذلك في أنواع البرية مما كانت عليه في المسوخ (الشكل 5، اللوحة السفلى).

الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 2: معدل الانبعاثات من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية خلال تطوير وفي الذكور البالغين وShank2 أنثى ^{- / -} من النوع البري تتزاحم الفئران واتصل معدل الجراء (كل يومين من P2 إلى P12، ن = 18-19 Shank2 ^{+ / +،} ن = 15-16 Shank2 ^{- / -)} والكبار أثناء الذكور شبق التفاعلات الإناث (ن = 15 Shank2 ^{+ / +،} ن = 16 Shank2 ^{- / -)} والتفاعلات الإناث الإناث (ن = 15 Shank2 ^{+ / +،} ن = 13 Shank2 ^{- / -)} في البرية من نوع الفئران (اللوحة اليسرى) وShank2 ^{- / -} الفئران (اللوحة اليمنى). يتم عرض البيانات يعني كما +/- SEM ونقاط الفردية (غير إقران-يلكوكسن: * ف <0.05، ** ف <0.01 ***، ف <0.001).ge.jpg مرحبا "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): مرجع صوتي من Shank2 ^{- / -} الفئران والبرية من نوع تتزاحم النسب من أنواع المكالمات الخمس المختلفة المنبعثة من الجراء P2 (A، ن = 20 Shank2 ^{+ / +،} ن = 18 Shank2 ^{- / -)،} الجراء P6 (ب، ن = 19 Shank2 ^{+ / +،} ن = 18 Shank2 ^{- / -)،} الجراء P10 (C، ن = 20 Shank2 ^{+ / +،} ن = 18 Shank2 ^{- / -)،} الذكور البالغين مع الأنثى شبق (D ، ن = 16 Shank2 ^{+ / +،} ن = 16 Shank2 ^{- / -)} والكبار الإناث مع أنثى أخرى (E، ن = 15 Shank2 ^{+ / +،} ن = 13 Shank2 ^{- / -)} في البرية من نوع الفئران (لوحات اليسار) وShank2 ^{- / -} الفئران (لوحات اليمين). يتم عرض البيانات يعني كما +/- SEM ونقاط الفردية (اختبارات خي مربع: * ف <0.05، ** ف <0.01 ***، ف <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4: المتغيرات الصوتية المستخرجة من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في Shank2 ^{- / -} الفئران والبرية من نوع تتزاحم (A) مدة كل أنواع المكالمات مرتبك تنبعث من الجراء P2 (ن = 20 Shank2 ^{+ / +،} ن = 18 Shank2 ^{- / -} )، الجراء P6 (ن = 19 Shank2 ^{+ / +،} ن = 18 Shank2 ^{- / -)،} الجراء P10 (ن = 20 Shank2 ^{+ / +} ، ن = 18 Shank2 ^{- / -)،} الذكور البالغين مع الأنثى شبق (ن = 16 Shank2 ^{+ / +،} ن = 16 Shank2 ^{- / -)} والكبار الإناث مع أنثى أخرى (ن = 15 Shank2 ^{+ / +،} ن = 13 Shank2 ^{- / -)} في البرية من نوع الفئران (اللوحة اليسرى) وShank2 ^{- / -} الفئران (اللوحة اليمنى). (ب) الحد الأقصى لذروة تردد يقاس على جميع أنواع المكالمات مرتبك في الجراء P2، الجراء P6، الجراء P10، الذكور البالغين مع الأنثى شبق والإناث الكبار مع أنثى أخرى (نفس نانوثانية على النحو الوارد أعلاه). يتم عرض البيانات يعني كما +/- SEM ونقاط الفردية (غير إقران-يلكوكسن: * ف <0.05، ** ف <0.01 ***، ف <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: السياق. الصورة من انبعاث الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في التفاعلات الكبار الإناث الإناث الاجتماعي نسبة من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية المنبعثة من أزواج تنطوي على Shank2 ^{+ / +} مع C57BL / الماوس 6N (ن = 16، A) وأزواج تنطوي على Shank2 ^{- / -} مع وC57BL / 6N الماوس (ن = 13، B) خلال الأنواع التالية من الأحداث السلوكية (الأحمر: المحتل والأخضر: جديد قادم): الاتصالات الاجتماعية، الفم ووادي الذهب الاتصال، الشرج الأعضاء التناسلية للاستنشاق من الماوس المحتل، ano- الأعضاء التناسلية استنشاق من الماوس من الوافدين الجدد، المحتل وراء الجديد قادم، جديد قادم وراء المحتل، والجمود من المحتل، والجمود من جديد قادم، نهج من المحتل والهروب من قادم جديد، نهج من قادم جديد و الهروب من المحتل، والنهج والهرب من المحتل، والنهج والهرب من الوافدين الجدد، المحتل بعد قادم جديد، جديد قادم في مجال الرؤية من المحتل، المحتل في مجال الرؤية من جديد قادم. البيانات عاستياء كما يعني + ووزارة شؤون المرأة ونقاط الفردية (اختبارات غير مقترن يلكوكسون: * ف <0.05، ** ف <0.01). بيانات غير منشورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أنواع المكالمات	وصف
قصير	مدة ≤5 مللي ثانية وتردد مجموعة ≤6.25 كيلو هرتز
بسيط	مدة> 5 ميللي ثانية وتردد مجموعة ≤6.25 كيلو هرتز (شقة)، أو تضمين التردد في اتجاه واحد فقط (صعودا أو هبوطا) مع تردد نطاق> 6.25 كيلو هرتز
مجمع	التحويرات تردد في اتجاه وونطاق الترددات> ​​6.25 كيلو هرتز أكثر من واحد (التضمين)، أو إدراج واحد أو أكثر إضافية تردد جomponent (الظواهر التوافقية أو غير الخطية، ولكن لا تشبع) ولكن أية قيود على النطاق الترددي (معقد)
يقفز تردد	إدراج قفزة واحدة (واحدة قفزة التردد) أو أكثر من القفزات (تردد يقفز، وغيرهم) في التردد دون الفجوة الزمنية بين مكونات تردد متتالية، مع (مختلطة) أو بدون أي جزء صاخبة في الدعوة لهجة نقية
غير منظم	لا النقي التعرف عنصر لهجة. دعوات "صاخبة"

الجدول 1: خصائص خمسة أنواع من الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية أمثلة من معايير المدة، ومدى التردد، التحويرات تردد ويقفز الترددات المستخدمة لتحديد 5 أنواع المكالمات المختلفة داخل الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية.

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا يوفر طرق موحدة وموثوقة لجمع الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في المختبر. هذه الحالات مقيدة جدا تظهر ميزة التوحيد. يتم استخدامها مع النجاح للمقارنة بين سلالات أو المورثات ضمن سلالات ^{18،19،26،27.} كما وردت في نتائج تمثيلية، وهذه الأساليب تسمح بتحديد التواصل الاجتماعي غير نمطية في الفئران تحور لShank2، جينة مرتبطة باضطرابات طيف التوحد. وسيتم تشغيل مقارنات بين سلالات الفأر، بين سياقات مختلفة أو حتى بين المختبرات التي توفر مجموعات البيانات الكبيرة على قاعدة بيانات mouseTube. هذه الأداة يجب أن تعزز دراسات على الماوس الالفاظ بالموجات فوق الصوتية عن طريق السماح للتحليلات متعددة المتغيرات.

هي الأمثل البروتوكولات وصفها هنا لاختبار الفئران من المورثات مختلفة ضمن سلالة، كما هو الحال في غالبية الدراسات نمذجة ج الوراثيةontribution إلى الاضطرابات العصبية والنفسية. فمن المستحسن لتصميم تجريبيا كل دراسة لأفضل الضوابط الممكنة. في الواقع، وآثار القمامة قد تخفي او مصطنع تضخيم التأثيرات الجينية ^28،29. ولذلك فمن المستحسن أن تشمل ضوابط littermate عن كل الوراثي. لذا ينبغي تفضيل تربية الآباء متخالف، لأنه سيسمح للمطابقة الصحيح من فئرانا معدلة وراثيا والتحكم في القمامة. هذا يبرر وشم مخلب وضع علامات على جميع الجراء (أعمى إلى النمط الجيني) لتعقب الأفراد في جميع أنحاء التسجيلات كل يومين. يتم التنميط الجيني في الفطام، عن طريق أخذ عينات الذيل. عند تسجيل المكالمات الجرو بمعزل عن P2 على، ونحن لن نوصي بأخذ عينات ذيل بالفعل في الجراء، حيث أن هذه العملية تشمل التلاعب التكميلي والإجهاد وثيقة للغاية في الوقت المناسب لجلسة تسجيل.

البروتوكولات اقترح هنا لتثير الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في البالغين لا يسمح بتحديد واضح للEMItter من الالفاظ. وهذا ما يفسر لماذا نحن التلاعب دوافع الحيوان الاختبار. في الواقع، يتم عزل الفئران اختبار وليس من الوافدين الجدد وحيوانات التجارب روض لفترة طويلة إلى القفص الاختبار خلال التفاعلات من نفس الجنس. في التفاعلات بين الذكور والإناث، والإناث قدم ليست معزولة وhabituates اختبار الذكور لوقت أقصر منذ الدافع قد يكون أعلى في هذا السياق الجنسي. وينبغي لهذه التلاعبات من الدافع تعظيم احتمال الماوس اختبار تنبعث منها الالفاظ وليس واحد قدم. لتسجيل الالفاظ بالموجات فوق الصوتية الذكور في سياق الجنسي، مسحة القطن بسيطة مع البول الطازجة (أي ليس المجمدة) من الإناث شبق ويمكن أيضا إدخال في قفص ^30. وتسمح هذه الطريقة احالة الالفاظ بالموجات فوق الصوتية للذكر الاختبار مع اليقين 100٪ ولكنه يمنع جمع أي معلومات محددة عن السياق الاجتماعي الفعلي لانبعاث هذه الالفاظ. ولذلك، فإننا نؤيد protocoوصف ل هنا (مع الحركة بحرية أنثى شبق). كما نوصي دائما الى استخدام الفئران قدم من نفس السلالة عند اختبار الفئران من سلالة متحولة وتحليل البيانات مثل زوج من الفئران يعلو صوته. تشجع دراسة حديثة استخدام التثليث في توطين باعث ^31. في هذه الدراسة، تم العثور على الإناث لتنبعث منها أيضا الالفاظ بالموجات فوق الصوتية خلال لقاءات مع الذكور. ويمكن تفسير ذلك من حقيقة أنها كانت معزولة لمدة أسبوعين على الأقل قبل انعقاد الدورة تسجيل. يجب تعميم استخدام التثليث المقترحة في هذه الدراسة مع ذلك تسمح تحديد باعث من الالفاظ في معظم الحالات إذا تتم مزامنة تسجيلات الفيديو بشكل صحيح.

لا نشعر بالانزعاج المكالمات بمعزل عن الجراء التي سجلت خلال التنمية الضوضاء الخلفية من الفراش. عادة ما يكون التحليل الآلي يعمل بشكل جيد جدا لاستخراج المتغيرات الرئيسية. في المقابل، سجلت الالفاظ من البالغين دisturbed من الضوضاء الخلفية من الحيوانات تتحرك في الفراش. قد تفشل التحليل الآلي، وبالتالي يجب استخدام التحليل اليدوي. ومع ذلك، مشيرا الى الفراش في قفص اختبار يجب توفير الظروف التي هي أقل إرهاقا للحيوانات من التربة العارية (أن الفئران لا تحب). وتتركز بذل المزيد من الجهود في المجتمع على تحسين الكشف التلقائي من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية في ظل ظروف مختلفة، حتى أولئك يعني ضوضاء الخلفية. على سبيل المثال، برنامج صوت يسمح لتحليل الالفاظ التي تم اختيارها يدويا لعدم وجود الضوضاء الخلفية ^32. في هذا البرنامج، واستخراج المتغيرات الصوتية هو تلقائي ولكن يحتاج اختيار اليدوية الأولية.

وتجدر الإشارة إلى أن التباين بين الأفراد مهم جدا في سلوك صخبا من الفئران. على سبيل المثال، سعر المكالمة من الذكور البالغين في جود أنثى شبق توزع جدا (الشكل 1). نحن سوggest هذه البروتوكولات الموحدة للحصول الالفاظ بالموجات فوق الصوتية بالفعل للحد من التقلبات المرتبطة بالسياق التجريبي. ومع ذلك، نود أن نشير إلى أهمية تقديم ليس فقط يعني ووزارة شؤون المرأة للبيانات، ولكن الأهم من النقاط الفردية في عينات صغيرة الحجم ^33. بل هو أيضا مهم جدا - إن لم يكن ضروريا - لتسجيل 12 شخص على الأقل من كل مجموعة / النمط الجيني لجمع بيانات تمثيلية. في كثير من الحالات، لا ينبغي أن تكون مخفية التباين بين الأفراد (وعادة ما لا يمكن أن يكون)، وأنه قد يكون من أهمية كبيرة للتعرف على الأفراد تحمل طفرة جينية درس ولكن لا تظهر أي النمط الظاهري غير نمطية. هؤلاء الأفراد يمكن أن توفر أدلة حول التعويضات، والتي قد فتح مسارات جديدة للعلاج من اضطرابات وراثية.

في معظم الأوصاف السلوكية للنماذج الماوس لاضطرابات عصبية ونفسية، والسلوك صخبا والاتصالات الاجتماعية هي النظرإد بصرف النظر (على سبيل المثال، ^{19،27،34،35).} توفر طرق التحليل الحديثة الآن توصيف مفصل شبه التلقائي للأحداث الاجتماعية وتسلسل الأحداث خلال التفاعل (باستخدام MiceProfiler على سبيل المثال) ^36، فضلا عن إمكانية الجمع بين هذا التحليل مع البيانات من التسجيلات الصوتية. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو توفير رؤية شاملة للالتواصل الاجتماعي في نماذج الفئران من التوحد، لتحديد أكثر دقة التي تتأثر جوانب التواصل الاجتماعي. في هذا البروتوكول التزامن لا يزال يدوي ولكن هذا يمكن تحسينها من خلال التسبب في تسجيل الفيديو من خلال برنامج تسجيل الصوت. وينبغي أن تصبح هذا النوع من التحليلات المعيار لتقديم وجهة نظر أكثر شمولا من العجز التواصل الاجتماعي في نماذج الفئران من الاضطرابات العصبية والنفسية. وبالإضافة إلى ذلك، حتى الآن، ويتم تحليل الإشارات الصوتية في الغالب من الجانب باعث (أي، يتم بناؤها الاختبارات لصالح انبعاث فوإشارات كال عن طريق الماوس اختبارها، كما هو الحال في البروتوكولات الحالية). الآن يجب أن تكون أيضا تعيين التركيز على المتلقي من هذه الإشارات، لتحديد أفضل وظائف هذه الإشارات الصوتية. ينبغي أن يتم ذلك من خلال تقييم أيضا سلوك الفئران من الوافدين الجدد في البروتوكولات الحالية في البالغين (باستخدام MiceProfiler على سبيل المثال) ^36، وذلك باستخدام تجارب تشغيل ^16، أو عن طريق وضع بروتوكولات جديدة. في الواقع، توفر البروتوكولات الحالية الحالات مقيدة جدا التي قد لا تعكس الظروف علم السلوك بالضبط من الانبعاثات النطق في الفئران. سوف انبعاث عفوي من الالفاظ بالموجات فوق الصوتية يجب أن تكون أفضل يتميز باستخدام الصوت والفيديو مستمرة التسجيلات لتسليط المزيد من الضوء على سلوك الصوتية عفوية من الفئران.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]	BD Microlance	304000	-
green tattoo paste	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA	-
thermometer	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
self-made soundproof chamber (pups)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple	Harvard Apparatus	599814 + 601956	-
smell-less pen	for instance: Giotto	-	ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France	24103	diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34163	sound card
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10301; #10302	recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp	-	-	running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)	Lock & Lock, Chatswood, USA	HPL932D	Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023	-
slides	Menzel-Gläser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	320070-0500	-
Giemsa R 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	720-1107	diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)	-	-	pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage	Institut Pasteur, Paris	-	50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera	From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands	-	high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform	Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	tracking software to analyse behavioral events during social interactions