Fare Ultrasonik seslenmelere kayıt Sosyal İletişim değerlendirin

Özet

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

Özet

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

Giriş

Nöropsikiyatrik bozukluğu olan hastalar genellikle sosyal iletişim açıkları görüntüler (örneğin, otizm spektrum bozuklukları, şizofreni, ya da Alzheimer hastalığı olan hastalar) ^1. Genetiği fareler daha sık olan mühendislik bu hastalıkların ² genetik nedenlerini modellemek için kullanılır. Bu fare modellerinde sosyal iletişim okuyan atipik sosyal işlev bozukluklarının yol açan genetik mutasyon mekanizmalarının anlaşılması ve yeni tedaviler test etmek için yüksek ilgi çekicidir. fareler sosyal hayvanlardır ve kokusal, dokunsal, görsel ve akustik sinyalleri kullanarak birbirleri ile iletişim kurduğundan, sosyal iletişimi değerlendirmek için uygun modellerdir.

Fare ultrasonik sesler çıkarma şimdi, şu anda en son çalışmalar Argu bile, vokal iletişim açıkları ^3,4 (ama yine de ^5,6 tartışılan bu türün vokal öğrenme varlığının genetik temellerini modellemek için bir vekil olarak kullanılırvokal öğrenme ⁷⁾ yokluğunda e. Laboratuvar fareleri (referans gözden ⁸⁾ eşcinsel sosyal etkileşimlerde, kadın-erkek sosyo-seksüel etkileşimlerde, anne-bebek ilişkileri ultrasonik seslenmelere yayan bulunmuştur ve çocuk-çocuk sosyal etkileşimler ^9. Baraj ve littermates ¹⁰ izole fare yavrular yaşamın ilk iki haftasında izolasyon çağrıları yayarlar. Erkekler ne zaman ^11,12 (onu veya idrar ipuçları) bir kızışma kadın varlığında ultrasonik seslenmelere yayarlar. Aynı cinsten ^13,14 bilinmeyen bir conspecific ile etkileşim halindeyken erkek ve dişileri ultrasonik seslendirme yayarlar. organizasyon ve bu seslerin fonksiyonları tamamen açık değildir ve daha fazla araştırma gerekiyor. Fonksiyonel açıdan geçerli bilgi yavru izolasyon aramaları, yetişkin erkek vocalizat doğru yetişkin kadın yakınlığı kolaylaştırılması işitme annelerinde alma davranışı ortaya çıkarma ile sınırlıdıriyonları ¹⁵ ve yetişkin dişi seslenmelere ¹⁶ işitme yetişkin erkeklerin artan keşif davranışı.

nöropsikiyatrik bozuklukların fare modellerinde vokal iletişim anormallikleri karakterize deneysel koşullar önemli bir katkı ekarte etmek için standardize koşullarda yapılmalıdır. eşzamanlı sosyal etkileşimler ve çeşitli genetik modeller nörobiyolojik çalışmaların değerlendirilmesi ile birlikte bu tür nitelendirmeler, fare ultrasonik iletişimin farklı yönlerine genetik katkısı bilgimizi geliştirmek gerekir. Bir uzun vadede, insanlarda sosyal iletişimin bazı nörobiyolojik temeller üzerine daha fazla ışık vermelidir. Biz şu anda güvenilir gelişimi sırasında ve laboratuvarda hem erkek hem de dişi fareler için yetişkinlikte ultrasonik seslenmelere ortaya çıkarmak için basit protokolleri sağlamayı amaçlıyor. Bu tür protokoller daha güvenilir Ultr karşılaştırmak için kayıtların standardizasyon kolaylaştırmak gerekirsuşları ve laboratuarlar arasındaki Asonic seslendirme emisyonları. Ayrıca fare ultrasonik sesler çıkarma kayıtları ile önceden deneyime sahip laboratuvarlarda tür kayıtların kurulmasını kolaylaştıracaktır. Biz de sosyal bozukluklar yanı sıra ultrasonik seslerin emisyon bağlamına önemli bilgileri elde etmek için, erişkin farelerde sosyal etkileşimler sırasında eş zamanlı olarak toplanan detaylı davranışsal verilerle ultrasonik sesler çıkarma verileri birleştirmek için geçerli olasılığını vurgulayın. Bu tür analizler organizasyon ve fare ultrasonik seslerin fonksiyonları üzerinde yeni bir ışık tutacaktır. Son olarak, biz de mouseTube veritabanı (http://mousetube.pasteur.fr) üzerinde tüm bilim camiası ile ultrasonik seslendirme kayıtları paylaşmak imkanı duyururlar. ses kayıt verilerine açık erişim bilim adamları, diğer labo kaydedilen ultrasonik sesler çıkarma ile kendi verilerini karşılaştırmak için izin vererek fare ultrasonik iletişim bilgilerini artırmak gerekir(Benzer veya farklı suşlar / protokolleri ile) ratories ve / veya farklı koşullar altında kaydedilen dosyaları ile analiz yöntemlerinin meydan.

Protokol

Etik deyimi: Hayvan denekleri Prosedürleri Institut Pasteur, Paris Comite d'Ethique en deney animale (CETEA) n ° 89 tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlanması

1. , Yavru izolasyon aramaları kaydetmek ilgi fare suşu hamile kadın elde etmek. Not: heterozigot erkek ve dişileri yabani tip olmak üzere en az 10 ibrelerin elde etmek için heterozigot Breed ve knock-out yavrular dayanıklı kontrol hayvanları elde etmek.
2. eşcinsel etkileşimler sırasında seslenmelere kaydetmek için yetişkin farelerin iki kategori edinin.
   1. En az 12 erkek veya ilgi suşu test fareler gibi her genotipin 12 kadın elde (hesap bireyler arası değişkenlik dikkate almak). Bu protokol, yetişkinler için iyi adapte, ancak deney ⁹ öncesi azaltılmış yalıtım kez, gençler için ayarlanabilir: edin. Bu test erkekler ya da kadınlar için çalışıyor. Ancak, test erkek önlemekerkek-erkek sosyal etkileşim testinde net bir saldırgan fenotip görüntüler fare suşları s.
   2. affiliative etkileşimlerin miktarını maksimize etmek için, deneyler önce test hayvanları izole eder. Ev sosyal motivasyonu artırmak için 3 gün boyunca 3 hafta (en az ^14,17 agresif etkileşimleri azaltmak için) ve kadınlarda (E. Ey, yayınlanmamış veri) için ayrı ayrı erkekler.
   3. (3.1.3, etkileşim fareler gibi, örneğin) yeni gelenler olarak bunları kullanmak için test türünün genetik kökenli suşları temsilcisi erkek ya da kadın edinin. Çalışılan mutant soy C57BL / 6J background üretilmiş olup olmadığını Örneğin, yeni gelenler olarak C57BL / 6J fareleri kullanır. Bu farelerin her gelen olarak en fazla 2 kez, günde kullanılmaz, böylece gerekli hayvan sayısını hesaplayın. gruplar halinde onları ev.
3. Bir kızgınlık kadın varlığında erkek seslenmelere kaydetmek için yetişkin farelerin iki kategori edinin.
   1. l de eldeilgi suşu her genotip doğuya 12 cinsel olgun erkeklerin (hesap bireyler arası değişkenlik dikkate almak). Not: erkekler önce kadın ile deneyimi yoktu varsa testi ultrasonik seslenmelere ⁶ yayarlar motivasyonlarını artırmak için önce bireysel kafeslere koyun ve onları bir kadın iki gün bir gece geçirmek bırakın.
   2. Kaydedilen erkeklerin arka plan suşundan cinsel olgun kadın edinin. mutant erkekler C57BL / 6J background elde edilmiştir çalışılan Örneğin, C57BL / 6J dişi kullanın. Bu farelerin her fazla günde 3 kez kullanılmaz böylece gerekli kadın sayısını hesaplayın. gruplar halinde onları ev.

2. Pup İzolasyon Aramalar

1. Pup Kimlik
   1. Üç gün doğum tahmin gün önce, hamile kadın izole.
   2. doğum için kadın her sabah ve her akşam kontrol edin. P0 olarak doğum gününü unutmayın.
   3. (0.3 mm x 13 mm [30 G ½ "] iğne ile yapıştırmak yeşil dövme deri altı enjeksiyonu) uzun ömürlü pençe dövmeler kullanarak P1 yavrular belirleyin. Işaretlenmiş bir, iki, üç veya dört pençeleri ile bir kod oluşturun. Olarak Be hızlı mümkün olduğunca minimal yavruların rahatsız ve mümkün olan en kısa sürede yuvaya onları geri koydu.
2. Kayıt Pup İzolasyon Çağrılar Cage ayarlayın.
   1. Bir self-made ses geçirmez odasını (Şekil 1A) ya da basit bir Strafor kutu birini kullanın. Her kayıt için sıcaklığını izlemek için kutu içinde bir termometre yerleştirin. Sıcaklık 18 ° C ile 22 ° C arasında kalır emin olun.
   2. (Kutunun üst bir delikten) üstünde bir mikrofon yerleştirin. mikrofonun membran yavru uzanacaksınız kutusunun alt üzerinde 12-15 cm olacak şekilde mikrofona yüksekliğini ayarlayın. ses kartına mikrofon ve bilgisayara ses kartı takın.
   3. sou kazancını ayarlamak içinnd kart, deneyde kullanılan olmayacak bir yavru ile bir kayıt deneme yapmak. Deney (2.3.1 bakınız) ile aynı koşullarda yavru koyun. Kapıyı kapat. maksimum değeri böylece fakat aşırı yükleme olmadan (kayıt yazılımı canlı spektrogram ekranda kontrol edin) (seslenişlerden için mümkün olan en yüksek genlik var), ses kartı kazancı ayarlayın.
      Not: aramaların çoğunluğunun genlik mümkün olan en yüksek seviyede tutulduğu takdirde birkaç çağrılar aşırı yüklenmiş olabilir.
   4. Her bir kayıt oturumu için kazanç seviyesini üye ol ve yavruların / litre / oturumları arasında değiştirmek gerekmez. kazanç seviyelerindeki değişimler yanlış çağrı algılama ve otomatik algılama ve ölçümleri (5.4 5.1 bakınız) kullanarak analizler aynı eşikleri akustik değişkenler önlemlere yol açacak.

Şekil 1: izolasyon kayıt için ayarlayın fare yavrularının ve ultrasonik seslerin spektrogramlar aramalar yavru izolasyon aramaları kaydetmek için bir self-made ses geçirmez bölmenin (A) örneği.. Mevcut çağrı tipi sınıflandırılmasında kullanılan farklı arama türleri (B) Spektrogramlar; Tablo açıklamasına bakın 1. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. yavru izolasyon kayıt iki günde çağırır yürütün. gece doğan yavruların için sabah kayıtları Davranış ve yaş farkı yarım gün ile aynı yaş sınıfı yavrular kategorize önlemek için gün boyunca doğan yavruların için öğleden sonra. Bu çok genç aşamaları P2 ve P4 için en belirgindir.
   1. çöp bir yavru alın. 10 etanol% ile yıkanır ve (çapı kurutulmuş plastik alıcı olarak hızlı ve yavaşça mümkün olduğu kadar yerleştirin: 9santimetre; Yükseklik: 10 cm mikrofon kapsadığı alanın) kaçmasını eski yavrular önlemek için. sadece mikrofon altında sokacak.
   2. olduğunca hızlı ve sessizce sürede kutusunu kapatın. kayıt yazılımı yavru ultrasonik seslerin kaydını başlatmak (16-bit biçiminde, 300 kHz örnekleme frekansı yüksek kalite ile 150 kHz ses genlik yakalamak için).
   3. kayıt gerekli süre (5 dakika kadar) geçtikten sonra, kaydı durdurmak. kutudan yavru atın. yavru pençe dövmeler yazın.
   4. Bir prob-termometre ile yavru koltukaltı sıcaklığını alır. Mark daha kolay bir koku daha az kalem (su mürekkep), tanımak ile küçük bir nokta ile sırtında yavru bir sonraki seçilir ve yeni bir her zaman tüm yavrular manipüle önlemek için yuva zaten kayıtlı yavrular seçilmiş. Yuvada yavru geri koyun.
   5. plastik alıcı ve% 10 etanol ile alt kapsayan plastik yıkayın ve iyice kurulayıniçeride bir sonraki yavru koymadan önce.
   6. çöp sonraki yavru seçin ve 2.3 tekrarlayın.
4. Izin vermek için 1 saat geri kalan bir süre sonra (ve ark., ¹⁹ Ey Schmeisser ve ark., ¹⁸ ve yöntemi bölümlerini bakınız indirgenmiş test dizisinin ayrıntıları için) vücut ağırlığı, motor koordinasyon negatif geotaxis ve gelişim işaretleri kontrol yavrular ultrasonik seslerin yorucu emisyon sonra kurtarmak için. Bu Chadman ve ark., ²⁰ ve Scattoni ve ark., ²¹ olduğu gibi, komple bir gelişim test bataryası yapılırsa, hayvan bir kohort kullanın.
5. yaşamlarının ilk iki hafta boyunca P2 ve P12 arasında her iki günde bir yavru vokal davranış ve gelişimi karakterize bu kayıtları tekrarlayın.

Aynı cinsiyetten Sosyal Etkileşimler sırasında 3. Ultrasonik seslenmelere

1. Seslendirme Kayıtlar
   1. Bir test kafesini hazırlayın (50 x 25 cm x 30 c^m3; Pleksiglas, 100 lux [düşük yoğunluklu beyaz ışık]), sabunlu suyla temizlenmelidir kurutulmuş ve ses yalıtımlı odasında 2 cm taze yatak ile dolu.
      1. kafesin her köşesinden yayılan seslerin kaydedilmesi için mikrofonu yerleştirin. (Ya bir tripod kafeste veya) testi kafesinin bir köşesinde mikrofonu düzeltmek ve Cage'in tüm yüzeyini kapsayacak şekilde açılı mikrofon kafes altını ayarlayın.
         Not: Ultrason çok yönlü vardır.
      2. Test kafesi tüm yüzeyi yakalamak için ses geçirmez bölme üstünde bir video kamera yerleştirin.
         Not: Mikrofon videoda test kafesin bir köşesini gizleme olup olmadığını kontrol ediniz.
      3. Test öncesinde, bir yedek erkek ve daha sonra deneyde kullanılan olmayacak bir yedek kadın ile kartının kazancını ayarlayın. kayıt odasına test kafesine bu hayvanların koyun. Kaydedilen seslerin genlik maksimize etmek ses kartına kazanç seviyesini ayarlama but kayıt yazılımı canlı spektrogram ekranda görüldüğü gibi aşırı yükleme en aza indirmek için.
         Not: kazanç mikrofon ve seslendirme hayvanlar arasındaki uzaklığa bağlıdır.
   2. hayvan tanıtmak (erkek veya kadın, aynı "oturan" adı verilecek) test edilecek taze yatak test kafeste. bu 3.1.3 tanıtılan bilinmeyen conspecific için ilgisini en üst düzeye çıkarmak için 20 dakika boyunca ses geçirmez odasında deney kafesine alışmakta bırakın.
   3. Bu alışkanlık bir süre sonra, etkileşim için ^2. hayvan tanıtmak (erkek veya kadın, işgalci olarak aynı cinsiyetten, ancak farklı kulak işaretleri / daha sonra bunları tanımlamak için pençe dövme, "yeni gelen" adı verilecek).
      1. Test kafesine yeni gelenin giriş yakalamak ve video (150 yüksek kalite ile kHz ses genlik yakalamak için 16-bit biçiminde, 300 kHz örnekleme frekansı) ultrasonik seslenmelere kaydetmeye başlayın. u kaydetmeye başlayınkafes arama ve sosyal etkileşim sırasında seslendirme emisyonunun taban seviyesi arasında bir karşılaştırma gerekirse alışkanlık (tek başına oturan) sırasında ltrasonic sesler çıkarma.
      2. Zaman saatin üzerinde yeni köşe fare arka pençeleri yere temas tam (mikrofona yakın "bip" sesi) basarak elle / görsel, ses ve video kayıtlarını senkronize edin.
      3. İki hayvan (örneğin 4 dakika, yeterli ultrasonik vokalizasyon toplamak için yeterli bir süre için) istenen bir süre için etkileşim bırakın.
   4. kendi ev kafeslerde geri oturan ve yeni-comer koyun. Test kafes kullanılan yatak boşaltmak sabunlu suyla yıkayın ve kağıt havlu ile kurulayın. taze yatak koymak ve bir sonraki test için ses geçirmez odasında geri yerleştirin.

4. Erkek seslenmelere bir östrus Kadın ile Etkileşim sırasında

1. test sabah erken günerkek, kızgınlık döngüsü içinde cinsel durumunu belirlemek için her kadından vajinal smear alır.
   1. kuyruğundan kadın tutun ve kafes ızgara onu korumak. 20 ul PBS ile vajina birkaç defa yıkamak için bir pipet kullanın (örneğin, enjekte ve aynı 20 ul PBS birkaç kez hatırlamak). Aynı pipet ile 20 ul PBS hatırlamak. dişiler birkaç gün üst üste test edilecek varsa enfeksiyonu önlemek için, steril PBS kullanın.
   2. bir slayt vajinal hücrelerin süspansiyon içeren PBS yayıldı. bir slayt (bir kalemle slayt kenarındaki bireyleri tespit) dört örnekleri koydu. slaytlar boyama yapmadan önce kurumasını bekleyin.
   3. Laboratuar davlumbaz altında çalışın.
      1. Saf May-Grunwald bir banyo, fosfat tampon çözeltisi (0.1 M) ve Giemsa R bir banyo (1/20 fosfat tampon çözeltisi içinde) bir banyo hazırlayın.
      2. daha sonra, 3 dakika boyunca saf May-Grunwald banyosunda slaytlar koyun(Fosfat tampon çözeltisi içinde 1/20) Giemsa R banyosu içinde 10 dakika için aktarın son olarak 1 dakika boyunca fosfat tampon çözeltisi banyosuna yıkayın ve.
      3. Bundan sonra, 10 saniye boyunca fosfat tampon solüsyonu banyosunda yine slaytlar durulayın ve kurumaya bırakın.
   4. Mikroskop altında lekeli slaytlar inceleyin. Gün boyunca kullanılabilecek Dişiler (; tam kızışma mavi lekeli nükleus olmadan) olan numuneler mevcut sadece büyük boynuzlaşan epitel hücreleri olanlardır.
2. Onları test etmeden önce dk en az 30 test odasında erkek koyun.
3. Seslendirme Kayıtlar
   1. Gerekirse 3.1 tekrarlayın.
   2. (Taze yatak üzerinde) test edilecek erkek tanıtın. Onu 10 dakika ses geçirmez odasında deney kafesine alışmakta bırakın.
   3. Bu alışkanlık bir süre sonra, (lekelenme seçilen olanlar arasında) kızışma bir kadın tanıtmak.
      1. ultrasonik seslenmelere ve video kaydetmeye başlayınTest kafesine dişi giriş yakalamak için. (Erkek tek başına) kafes keşif ve sosyal etkileşim sırasında seslendirme emisyonunun taban seviyesi arasında bir karşılaştırma gerekirse alışkanlık sırasında ultrasonik seslenmelere kaydetmeye başlayın.
      2. Zaman seyretmek kadın fare arka pençeleri yere temas tam (mikrofona yakın "bip" sesi) basarak elle / görsel, ses ve video kayıtlarını senkronize edin.
      3. İki hayvan (örneğin 4 dakika, yeterli ultrasonik vokalizasyon toplamak için yeterli bir süre için) istenen bir süre için etkileşim bırakın.
   4. kendi ev kafeslerde erkek ve dişi geri koyun. Test kafes kullanılan yatak boşaltmak sabunlu suyla yıkayın ve kağıt havlu ile kurulayın. taze yatak koymak ve bir sonraki test için ses geçirmez odasında geri yerleştirin.
      Her gün, her kızışma Sadece Kadınlar bir kez kullanmak en uygunudur (ama gerekirse bunu yapabilirsiniz: Notaynı gün değil) üst üste 3 defaya kadar kullanılabilir.

5. Değişkenler Çıkarılan Be

1. analizler için ses dosyaları hazırlayın. Not: Aşağıdaki prosedür Pro VISOFT SASLab özgüdür ve kullanılan yazılıma göre değişebilir.
   1. Onlar zaman saatinin "bip" tam olarak başlamak, böylece dosyalarını kesmek ve istenen süre (yavru kayıtları için 5 dakika, yetişkin kayıtları için 4 dk) sonra sona erer.
   2. (; 30 kHz frekans ile Yüksek Geçiren kesti Düzenle> Filtre> FIR Time Domain Filter) yüksek geçiren filtre kullanılarak 30 kHz altında genlik filtreleyin. faiz (Eylemler> Toplu İşleme> FIR filtre) tüm dosyaları filtrelemek için toplu işlem kullanın.
   3. yazılımı ile etiketleme her ultrasonik seslendirme tanımlayın.
      1. (Dalga olaylardan bölüm etiketleri oluşturun> Araçlar> Etiketler) yavru kayıtları için otomatik algılama kullanın. , Ayarlayabilirsiniz.Özellik zaman ve marj f tutunya da en doğru tespiti. El ile algılama kontrol edin ve gerekliyse (önerilir) eğer etiketleri ayarlayın.
      2. (Seslenmelere seçmek hakkına tıklatın ve işaretleyici gelen bölüm etiketi ekleyin) arka plan gürültüsü olan erişkin kayıtlar için görsel algılama (etiket manuel yerleştirme) kullanın.
   4. spektrogram oluşturun. otomatik parametre ölçümleri (Araçlar> Otomatik Parametre Ölçümleri> Otomatik Parametre Ölçümleri ayarlayın) etkinleştirin.
   5. "Enable otomatik ölçümleri", "tüm spektogram gelen Compute parametreleri", ve "Otomatik güncelleme" kutuları işaretleyin. interaktif (bölüm etiketleri): "Eleman ayrılığı" seçeneğini seçin.
   6. İstenilen zamansal parametreleri ve spektrum tabanlı parametreler (Tepe frekans) (eleman, Aralık, Başlangıç ​​/ Bitiş süresi Süresi) ve ölçümlerin yerini (elemanın Başlat, elemanın sonu, Ortalama, Max, Min) hesaplamak için kutuları işaretleyin .
   7. ölçümleri kopyalama ve yapıştırmaE-tabloda m.
      Not: yetişkinlerle yapılan kayıtlar için, spektrum tabanlı parametrelerin ölçümleri nedeniyle arka plan gürültüsünü imkansız olabilir. spectrogram doğrudan farklı frekans değerleri üzerine tıklayarak ve bir tabloda elle değerleri yapıştırarak tepe frekans manuel ölçümler kullanın.
2. İlk yayılan seslerin numarası (etiket sayısı) belirleyerek çağrı yani oranı, dakika başına aramaların sayısını belirler. Sonra, dosyanın (dakika) süre ile kaydedilen seslerin toplam sayısına bölünmesiyle çağrı oranını hesaplamak.
3. Yani zamansal organizasyonu, dizi organizasyon belirlemek için çağrılar arasındaki zaman aralıklarının dağılımını belirlemek.
   1. seslendirme n sona ermesi ve her etiketin başlangıç ​​/ bitiş saati kullanarak seslendirme n + 1 başlangıcı arasındaki zaman aralıklarını hesaplayın.
   2. ultrasonografik arasındaki zaman aralıklarının dağılımı yoğunluğu kurmakic sesler çıkarma.
4. Yani, çağrı repertuarı belirleme kayıt mevcut arama türlerini tanımlar. Tablo 1 ve Şekil 1B sunulan sınıflandırma örneği kullanın.
   1. 5.1.3 Her seslendirme etiketleme yaparken, etiket çağrı türünün adını yazın.
   2. tam sayısını ve vokal repertuar oluşturmak için her bir arama tipindeki oranını hesaplayın.
5. Otomatik ölçüm mümkün olup olmadığını her seslendirme, yani, süresi, pik frekans akustik özelliklerini belirlemek (yani, en yüksek genlik frekans) başında ve çağrı, maksimum ve minimum tepe frekansı sonunda ve frekans ortalama (Şekil 1B) .
   1. Otomatik süresi, pik frekans karakteristiklerini ölçmek için yazılımda otomatik parametre ölçümleri işlevini kullanın yavru kayıtları (örneğin, sonunda, ortalama, maksimum, minimum başlangıç).
   2. Yetişkin kayıtları için seslendirme süresi olarak etiketin süresini kullanın. Spectrogram tepe frekans karakteristikleri (örneğin, başlangıç, sonu, maksimum, minimum) penceresinde elle ölçün.
6. Çift ultrasonik vokalizasyon verileri ve sosyal etkileşim verileri (BUZLU platformu ²² MiceProfiler eklentisi).
   1. Mümkün olduğunca kesin ses ve protokol açıklandığı gibi video kayıtları senkronize etmek emin olun.
   2. De Chaumont ve ark., ²² anlatıldığı gibi BUZLU platformunun Fareler Profiler Tracker eklentisi kullanarak sosyal etkileşim video kodlamak. tanıtılan hayvanın arka pençeleri yere dokunduğunuzda tam izleme başlatın.
   3. De Chaumont et açıklandığı gibi BUZLU platformunun Fareler Profiler video Label Maker eklenti (Mice Profiler Tracker tarafından oluşturulan) kodlanmış video dosyasını ve karşılık gelen xml dosyası yükleark. ^22.
      Not: Fareler Profiler video Label Maker eklentisi otomatik olarak video dosyasını ve aynı adı varsa ses dosyası analizi oluşturulan metin dosyası (bkz: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) .
   4. Fare ölçeği doğru olduğunu kontrol ettikten sonra, sayı ve ayrı bir dosyada her sosyal etkinlik sırasında yayılan seslerin oranını elde etmek için her dosya için "Create USV istatistikleri" üzerine tıklayın.

MouseTube Veritabanı 6. Dosya Yükleme

1. Dosyaları kurum dışından erişilebilen bir depolama sunucusu üzerinde olduğundan emin olun.
   Not: Güvenlik seviyeleri yüksek olan bazı kurumlarda barındırılan sunucular kurum dışından bağlantı kişiler tarafından erişilebilir olması için belirli bir yapılandırma gerekir.
2. MouseTube web sitesi (http://mousetube.pasteur.fr) gidin. giriş (login birnd şifre) yöneticiler tarafından her kullanıcı atfedilir.
3. Önceden kaydedilmiş fare suşu "suşlar" butonuna tıklayarak mouseTube veritabanında olup olmadığını kontrol edin. Değilse, bunu oluşturmak için yöneticiler istiyoruz.
4. lütfen "Oluştur> Konular" seçeneğini kullanarak, konuları oluşturun. Kaydedilen hayvanların tanımlama kodlarını girin. Verilerin daha sonra alma kolaylaştırmak için gruplar halinde onları toplamak.
5. lütfen "> Protokolleri oluştur" seçeneğini kullanarak ultrasonik seslenmelere kaydetmek için kullanılan protokol açıklamasını girin.
6. lütfen "Oluştur> Deneyler" kullanarak her kayıt oturumu için bir deneme oluşturun. protokolü, donanım ve kullanılan yazılım ve özgüllükleri kaydedildi bireylerin grubu belirtin.
   Not: Deney seslendirme dosyaları karşılık gelen tüm meta toplar.
7. "Vocalisations kullanarak seslendirme dosyaları bağlantı oluşturun Oluştur> & #34; düğmesine basın. liste içinde denemeyi seçin. Kopyala ve seslendirme dosyasının url yapıştırın (bu bağlantı http ile başlar: // ...) karşılık gelen alana sütun "Dosyalar bağlamak için". butonuna tıklayarak girişleri geçerli "mouseTube ve dosyalar arasında bir bağlantı oluştur".
   Not: Aynı anda her dosya için her kutusunu doldurmak için gerekli değildir.
8. Gerekirse, her an girilen bağlantıları değiştirmek ve "Notlar" bölümünde ayrıntıları ekleyin. Daha fazla bilgi vermek için notlar yazmak için tereddüt etmeyin. ses dosyası ile eş zamanlı olarak kaydedilen bir video dosyası doğru bağlantı girildiğinde Örneğin, bu "Notlar" belirtilebilir.

Sonuçlar

Mevcut protokolleri ile, biz ProSAP1 / Shank2, otizm spektrum bozukluğu (ASD) ^23-25 ​​ile bağlantılı bir genin eksik farelerin vokal davranışları karakterize edilmiştir. ASD sosyal iletişimdeki açıkları ve kalıplaşmış davranışlar ¹ ile karakterizedir. Bizim Shank2 ^{- / -} fareler hiperaktivite, artan kaygı ve atipik sesli iletişimi ^18,26 sergiledi. . Fareler vahşi tip litermatlarında tipik ters U-şekilli bir eğri ile karşılaştırıldığında yavru yalıtım aramaların emisyon oranı, tipik olmayan bir gelişim profili ortaya Shank2 ^{- - / -} Gerçekten, Shank2 not ^{/ -} fareler artmış arama oranı gösterildi ve P4 kendi yabani tip littermates (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında P6 çağrı oranı azalmıştır. ^{/ - -} Compariso içinde kadın Biz de bir Shank2 içeren kadın etkileşimlerde bir azalma çağrı oranı gözlenenn, bir vahşi tip yavru (Şekil 2) ilgili etkileşimler ile. Biz 5 farklı çağrı kategorilerinin repertuar incelenmiştir. Ve yetişkinler (Şekil 3) (burada örnek P2, P6 ve P10 için) yavrular arasında farklı olduğu ortaya çıktı. Genotip ilgili farklılıklar çoğunlukla yetişkinlikte önemli bulunmuştur. ^{/ - -} Yetişkin Shank2 içeren sosyal etkileşimler sırasında C57BL / 6N dişi ile erkek ya da kadın, daha kısa çağrılar ve yapılandırılmamış aramalar onların yabani tip yavruları (Şekil 3D ve E) içeren etkileşimler ile karşılaştırıldığında kaydedildi. Shank2 ^{+ / +} kadın (Şekil 3E) içeren etkileşimler ile karşılaştırıldığında kadın ^{- / -} daha az karmaşık aramalar ve frekans aramaları da yetişkin Shank2 içeren C57BL / 6N dişi ile etkileşim sırasında kaydedildi atlar. Son olarak, biz de el akustik değişkenler ölçülür. anlamlı genotip ilgili bir farklılık du yoktuhalka geliştirme. Buna karşılık, yetişkin Shank2 içeren etkileşimler sırasında kaydedilen çağrıların süresi ^{- / -} kadın kendi yabani tip yavruları (Şekil 4A) içeren etkileşimler sırasında kaydedilen daha kısaydı. Biz de ultrasonik seslerin tepe frekans önemli genotip ilgili fark ²⁶ olmadan yavru gelişimi sırasında arttığını vurguladı. Shank2 ilgili etkileşimler sırasında ^{- / -} Bir C57BL / 6N dişi ile erkek veya dişi, ultrasonik vokalizasyon yabani tip yavruları (Şekil 4B) içeren etkileşimler sırasında kaydedilen aramalar ile karşılaştırıldığında daha düşük bir pik yaygındır.

Buna ek olarak, mevcut protokol aynı zamanda MiceProfiler (ICY yazılımı, Institut Geçmişten çıkarılan davranışsal verilere ses kayıtları verileri birleştirerek ultrasonik seslerin emisyon bağlamını incelemek için izineur, Paris). hayvanlar temas ve yeni gelenlerin ano-genital bölgesini koklama daha spesifik işgalci içinde bulunduğumuz zaman Örneğin, kadın-erkek etkileşimleri, en ultrasonik sesler çıkarma yayılan edildi ya da en azından oturan yeni umut vaat arkasında olmak. Yolcu yeni comer (Şekil 5, üst panel) yaklaştı Fareler birçok ultrasonik seslenmelere yayılan. ^{- / -} Farelerde oturan bir yabani tip fare iken daha (yeni-gelenin ano-genital bölgeyi koklama, örneğin) yeni-comer ile fiziksel temas vardı yolcu Shank2 daha az seslerin kaydedildi. Bir vahşi tip fare iken daha fare ^{- / -} yeni-comer arkasında oturan bir Shank2 iken daha az seslerin tetiklenir bulundu. Daha seslerin de yeni köşe yolcu fare görme alanında iken kaydedildi edildi ve daha çok mutantlar daha vahşi türleri (Şekil 5, alt panel).

keep-together.within sayfa = "1">: fo s = "jove_content"
Şekil 2:. Gelişimi sırasında ve yetişkin erkek ve kadın Shank2 ultrasonik seslerin Emisyon oranı ^{- / -} fareler ve yabani tip littermates yavruların oranı Çağrı (her iki günde P2 P12, n = 18-19 Shank2 ^{+ / +,} n = 15-16 Shank2 ^{- / -} erkek estrus dişi etkileşimleri sırasında) ve yetişkinler (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -)} ve dişi-erkek etkileşimler (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^{- / -),} vahşi tip farelerden (sol panel) ve Shank2 olarak ^{- / -} fareler (sağ panel). Veriler olarak ortalama sunulmaktadır +/- SEM ve bireysel noktaları (Wilcoxon testleri olmayan eşleştirilmiş: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).ge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Shank2 bölgesinin Ses repertuarı ^{- / -} P2 yavrular tarafından yayılan beş farklı çağrı türleri fare ve vahşi tipli litermatlarının Oranları (A, n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} P6 yavrular (B; n = 19 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} P10 yavrular (° C; n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} bir kızışma dişi yetişkin erkek (D n = 16 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -} bir dişi (E) ve yetişkin dişi n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^{- / -),} vahşi tip farelerden (sol panel) ve Shank2 olarak ^{- / -} fareler (sağ paneller). Veriler olarak ortalama sunulmaktadır +/- SEM ve bireysel noktaları (ki-kare testleri: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. Shank2 ultrasonik vokalizasyon elde akustik değişkenleri ^{- / -} bütün arama türleri fare ve vahşi tipli litermatlarının (a) etki süresi (n = P2 yavruların 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 yayılan eleştirilmiştir ^{- / -} ), P6 yavrular (n = 19 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} P10 yavrular (n = 20 Shank2 ^{+ / +} n = 18 Shank2 ^{- / -),} yetişkin bir kızgınlık kadın ile erkek (n = 16 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -} başka bir kadın ile) ve yetişkin kadın (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^- vahşi tip farelerde) (sol panel) ve Shank2 ^{- - / / -} fareler (sağ panel). Tüm arama türlerinde ölçülen (B) Maksimum pik frekansı başka bir kadın (aynı Ns yukarıdaki gibi) ile bir kızgınlık kadın ve yetişkin dişi ile P2 yavruların, P6 yavruların, P10 yavruların, yetişkin erkeklerde şaşırmış. Veriler olarak ortalama sunulmaktadır +/- SEM ve bireysel noktaları (Wilcoxon testleri olmayan eşleştirilmiş: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Bağlam. karıştığı çiftleri yaydığı ultrasonik seslerin dişi-dişi yetişkin sosyal etkileşim fare ultrasonik seslerin emisyon s oranı bir Shank2 ^{+ / +} bir C57BL / 6N fare (n = 16, A) ve Shank2 içeren çiftleri ile ^{- / -} ile bir C57BL / 6N fare (n = 13, B) davranışsal olaylar aşağıdaki türleri sırasında (kırmızı: yolcu, yeşil: yeni köşe): sosyal temas, oro-ağız teması, yolcu fareden alınan ano-genital koklama, anomali yeni köşe fare koklama genital, işgalci ve yeni-comer, yolcu arkasında yeni umut vaat, işgalci hareketsizlik, yeni gelenin hareketsizlik, yaklaşımın arkasındaki yolcu yeni umut vaat gelen yeni umut vaat gelen yaklaşım kaçmak & yolcu yeni gelenin vizyonu alanında işgalci, işgalci görüş alanında yeni-comer, yeni umut vaat ardından işgalci, yaklaşımı kaçmak ve işgalci, yaklaşımı kaçmak ve yeni-comer kaçmak. Veri preddetmiş olarak ortalama +/- SEM ve bireysel noktaları (non-eşleştirilmiş Wilcoxon testleri: * p <0.05, ** p <0.01). Basılmamış veriler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

çağrı türleri	Açıklama
kısa	süresi ≤5 msn ve frekans aralığı ≤6.25 kHz
kolay	frekans aralığı> 6.25 kHz ile sadece bir yönde (yukarı veya aşağı) içinde süresi> 5 msn ve frekans aralığı ≤6.25 kHz (düz) veya frekans modülasyonu
kompleks	Frekans, birden fazla yönde ve frekans aralığı> 6.25 kHz modülasyon (modüle), ya da bir ya da daha çok ilave frekans c dahilomponent (harmonik veya non-lineer olaylar, ancak hiçbir doygunluk) ama frekans aralığının üzerinde hiçbir kısıtlama (kompleks)
frekans atlar	ardışık frekans bileşenleri arasındaki zaman boşluğu olmadan sıklığında bir sıçrama (bir frekans atlama) veya daha fazla atlar (frekans atlar, diğerleri) dahil (karışık) ya da saf ses çağrısı içinde herhangi bir gürültülü bir parçası olmadan
yapılandırılmamış	Hiçbir saf ses bileşeni tanımlanabilir; "Gürültülü" çağrıları

Tablo 1:. Fare ultrasonik seslerin beş tür özellikleri fare ultrasonik sesler çıkarma içinde 5 farklı arama türlerini belirlemek için kullanılan süre, frekans aralığı, frekans modülasyon ve frekans atlar kriterleri örnekleri.

Tartışmalar

Burada sunulan protokol laboratuvarda fare ultrasonik seslenmelere toplamak için standardize ve güvenilir yollar sağlar. Bunlar çok kısıtlı durumlar standardizasyon avantajı sunuyoruz. Bu suşlar ^18,19,26,27 olan ırkları veya genotipleri karşılaştırma başarı ile kullanılmaktadır. Örnek sonuçlar de görüldüğü gibi, bu yöntemler, Shank2, otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı bir genin mutasyona uğramış farelerde atipik sosyal iletişim tanımlanmasına izin verir. Laboratuarlar farklı bağlamlarda arasında, hatta aralarında fare suşları arasındaki karşılaştırmalar, mouseTube veritabanı üzerinde büyük veri kümelerinin kullanılabilirliği ile tetiklenir. Bu araç çok değişkenli analizler izin vererek fare ultrasonik sesler çıkarma çalışmaları artırmak gerekir.

genetik c modelleme çalışmaların çoğunda yapıldığı gibi burada açıklanan protokoller, bir suş içinde farklı genotipleri fareler test etmek için optimize edilmiştirnöropsikiyatrik bozukluklar ontribution. Deneysel olarak mümkün olan en iyi kontrol bilgisi için her bir çalışma tasarımı önerilmektedir. Nitekim, çöp etkileri maskelemek veya yapay genetik etkiler ^28,29 şişirmek olabilir. Her genotip için yavru kontroller için tavsiye edilir. Bir çöp içinde mutant ve kontrol fareleri doğru eşleme sağlayacak beri Islahı heterozigot anne nedenle tercih edilmelidir. Bu iki günde kayıtları boyunca bireyleri izlemek için (genotip kör) tüm yavruların işaretleme pençe dövme haklı. Genotiplendirme kuyruk numune alarak, sütten yapılır. P2 yavru izolasyon çağrıları üzerine kayıt yaparken, biz bu operasyon ek manipülasyon ve bir kayıt oturumu zaman çok yakın stres içerdiğinden, yavrular zaten kuyruk örnekleri alarak tavsiye etmem.

Burada önerilen protokoller emi açık kimlik izin vermez yetişkinlerde ultrasonik seslenmelere ortaya çıkarmak içinseslerin tter. Biz test hayvanının motivasyonunu manipüle açıklıyor. Nitekim, deney fareleri izole edilir ve yeni köşe ve deney hayvanları eşcinsel etkileşimler sırasında deney kafesine uzun süre alışabilir. kadın-erkek etkileşimleri tanıtıldı kadın izole değildir ve test erkek motivasyon bu cinsel bağlamda yüksek olabilir çünkü kısa süre alıştırır. motivasyon bu manipülasyonlar seslenmelere ve tanıtılan bir yayan Test fare olasılığını maksimize edilmelidir. Cinsel bağlamda erkek ultrasonik seslenmelere kaydetmek için, bir kızgınlık kadın taze (yani, dondurulmuş değil) idrar ile basit pamuklu çubukla da kafeste ³⁰ sokulabilir. Bu yöntem% 100 kesin test erkek ultrasonik seslerin atanmasına olanak verir ancak bu seslerin emisyon gerçek toplumsal bağlam hakkında herhangi bir özel bilgi toplama önler. Bu nedenle, tercih Protocol (serbestçe hareket eden kızışma kadın ile) burada açıklanan. Biz de bir mutant suşu fareleri test ederken her zaman aynı soydan tanıtıldı fareler kullanmak ve vokal farelerin bir çift olarak verileri analiz etmek önerilir. Bir son çalışmada yayıcı ³¹ lokalize nirengi kullanımını teşvik etmektedir. Bu çalışmada, dişiler de bir erkek ile karşılaştığında sırasında ultrasonik seslenmelere yayarlar bulundu. Bu da kayıt seansından önce en az iki hafta içinde izole edilmiştir gerçeği ile açıklanabilir. video kayıtları düzgün senkronize edilir, bu çalışmada önerilen nirengi kullanımının genelleştirilmesi yine çoğu durumda seslerin yayıcı belirlenmesini izin vermelidir.

gelişimi sırasında kaydedilen yavrular izolasyon aramalar yatak arka plan gürültü ile rahatsız değil. Genellikle otomatik analiz ana değişkenleri ayıklamak için çok iyi çalışıyor. Buna karşılık, yetişkinlerin kaydedilen seslerin d vardıryatak hareket hayvanlardan arka plan gürültü isturbed. Otomatik analiz başarısız olabilir, ve bu nedenle de manuel analizi kullanılmalıdır. Bununla birlikte, deney kafesine yatak ekleme (fareler sevmiyorum) çıplak toprak daha hayvanlar için daha az stresli olan koşulları sağlamak gerekir. Toplumda daha fazla çaba, çeşitli koşullar altında bile bu ima arka plan gürültülerini ultrasonik seslerin otomatik algılama geliştirmeye yoğunlaşmıştır. Örneğin, ses yazılımı manuel arka plan gürültüsü ³² yokluğu nedeniyle seçilmiştir olan seslenmelere analiz etmeyi sağlar. Bu yazılım, akustik değişkenlerin çıkarma otomatik ama ilk manuel seçim ihtiyacı vardır.

Bireyler arası değişkenliği farelerin ses davranışı çok önemli olduğu unutulmamalıdır. Örneğin, bir kızgınlık kadın varlığında yetişkin erkeklerin çağrı oranı çok (Şekil 1) dağıtılır. Biz suDeneysel bağlamda ilgili değişkenliği sınırlamak için zaten ultrasonik seslenmelere ortaya çıkarmak için bu standart protokolleri ggest. Yine de, biz en önemlisi küçük boyutu ³³ örneklerinde bireysel noktaları veri ortalama ve SEM sadece sunulmasının önemini işaret etmek istiyorum, ama istiyorum. temsili veri toplamak için her grup / genotip en az 12 bireyleri kayıt - eğer gerekli değildir - o da çok uygundur. Birçok durumda, bireyler arası değişkenlik (genellikle olamaz) gizli olmamalı ve bu bireyleri çalışılan genetik mutasyonu taşıyan ancak herhangi bir atipik fenotip görüntülenmiyor tanımlamak için yüksek öneme sahip olabilir. Bu tür bireyler, genetik bozuklukların tedavileri için yeni yollar açabilir tazminatlar, ilgili ipuçları sağlayabilir.

nöropsikiyatrik bozukluklar, vokal davranış ve sosyal kişiler için fare modellerinin en davranışsal karakterizasyonları düşünün vardıred dışında (örneğin, ^{19,27,34,35).} Son analiz yöntemleri artık (örneğin MiceProfiler kullanarak) bir etkileşimin ^36, yanı sıra ses kayıtları verilerle bu analizi birleştirmek imkanı sırasında sosyal etkinlikler ve olaylar dizilerin yarı otomatik detaylı karakterizasyonu sağlar. Bu yöntemin en önemli avantajı daha doğrusu toplumsal iletişimin yönlerinin etkilenen olduğunu belirlemek için, ASD fare modellerinde sosyal iletişimin kapsamlı bir görünümünü sağlamaktır. Mevcut protokol senkronizasyon hala manuel ama bu ses kayıt yazılımı aracılığıyla video kayıt tetikleyerek geliştirilebilir. analizler Bu tip nöropsikiyatrik bozuklukların fare modellerinde sosyal iletişim açıklarının daha kapsamlı bir görünüm sağlamak için standart haline gelmelidir. Buna ek olarak, şu ana kadar, vokal sinyaller çoğunlukla yayıcı tarafından analiz edilir (yani, testler vo emisyonunu lehine inşa edilirTest fare tarafından cal sinyaller, mevcut protokollerde olduğu gibi). Odak şimdi de daha iyi bu akustik sinyaller fonksiyonlarını belirlemek için, bu sinyallerin alıcı üzerinde ayarlanması gerekir. Bu, ya da yeni protokoller kurarak oynatma deneyleri ¹⁶ kullanılarak, aynı zamanda (örneğin MiceProfiler kullanarak) erişkinlerde mevcut protokollerde yeni köşe farelerin davranışlarını ³⁶ değerlendirilerek yapılmalıdır. Nitekim, mevcut protokoller farelerde seslendirme emisyon tam etolojik koşullarını yansıtmak olmayabilir çok kısıtlı durumlar sağlar. ultrasonik seslerin spontan emisyon farelerin spontan vokal davranışı üzerinde daha fazla ışık tutacak sürekli ses ve video kayıtları kullanılarak daha iyi karakterize edilmesi gerekecektir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]	BD Microlance	304000	-
green tattoo paste	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA	-
thermometer	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
self-made soundproof chamber (pups)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple	Harvard Apparatus	599814 + 601956	-
smell-less pen	for instance: Giotto	-	ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France	24103	diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34163	sound card
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10301; #10302	recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp	-	-	running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)	Lock & Lock, Chatswood, USA	HPL932D	Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023	-
slides	Menzel-Gläser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	320070-0500	-
Giemsa R 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	720-1107	diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)	-	-	pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage	Institut Pasteur, Paris	-	50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera	From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands	-	high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform	Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	tracking software to analyse behavioral events during social interactions