Gravação mouse ultra-som vocalizações para avaliar Comunicação Social

Resumo

Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).

Resumo

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.

Introdução

Pacientes com distúrbios neuropsiquiátricos geralmente exibem déficits na comunicação social (por exemplo, pacientes com distúrbios do espectro do autismo, esquizofrenia ou doença de Alzheimer) ^1. Engenharia genética camundongos são mais e mais freqüentemente usado para modelar causas genéticas desses distúrbios ^2. Estudar a comunicação social desses modelos do rato é de grande interesse para a compreensão dos mecanismos de mutações genéticas que conduzem a disfunções sociais atípicos e para testar novas terapias. Desde os ratos são animais sociais e se comunicar uns com os outros usando olfativa, tátil, sinais acústicos e visuais, eles são modelos adequados para avaliar a comunicação social.

Rato vocalizações ultra-sônicas são agora usado atualmente como um proxy para modelar as bases genéticas de déficits de comunicação vocais ^3,4 (mas a existência de aprendizado vocal nesta espécie ainda é debatido ^5,6, mesmo que a maioria dos estudos recentes argue pela ausência de aprendizagem vocal ^7). Ratos de laboratório foram encontrados para emitir vocalizações ultra-sônicas nas relações mãe-filho, em interações sócio-sexual entre homem e mulher, em interações sociais do mesmo sexo (revisto em referência ⁸⁾ e nas interações sociais juvenis-juvenil ^9. Filhotes de rato emitem chamadas de isolamento durante as primeiras duas semanas de vida, quando isolada a partir da barragem e irmãos ^10. Os machos emitem vocalizações ultra-sônicas quando em presença de uma fêmea estro (ou pistas urinário dela) ^11,12. Os machos e as fêmeas emitem vocalização ultra-sónica, ao interagir com uma mesma espécie desconhecida do mesmo sexo ^13,14. A organização e as funções destas vocalizações não são completamente claros e necessitam de mais investigações. O conhecimento atual sobre o aspecto funcional é limitada ao levantamento do comportamento de recuperação em mães de ouvir chamadas de isolamento cachorro, a facilitação da proximidade de fêmeas adultas em direção vocalizat macho adultoiões ¹⁵ e o aumento do comportamento exploratório dos homens adultos auditivos adultos vocalizações femininas ^16.

Caracterizar as anomalias na comunicação vocal em modelos de ratos com distúrbios neuropsiquiátricos deve ser realizado em condições padronizadas para descartar grande contribuição das condições experimentais. Tais caracterizações, combinados com a avaliação das interações sociais simultâneas e estudos neurobiológicos, em vários modelos genéticos deve melhorar o nosso conhecimento sobre a contribuição genética para os diferentes aspectos do rato de comunicação ultra-sônica. Durante um longo prazo, deve dar mais luz sobre algumas bases neurobiológicas de comunicação social em humanos. Nós atualmente visam fornecer protocolos simples para extrair de forma confiável vocalizações ultra-som durante o desenvolvimento e na idade adulta para ambos os ratos macho e fêmea no laboratório. Tais protocolos devem facilitar a padronização de gravações para comparar de forma mais confiável ultremissões de vocalização Asonic entre as linhagens e laboratórios. Ele também deve facilitar a criação de tais gravações em laboratórios que têm nenhuma experiência prévia com rato vocalizações ultra-sônicas gravações. Destacamos também a actual possibilidade de combinar dados vocalizações ultra-sônicas com dados comportamentais detalhados recolhidos simultaneamente durante interações sociais em ratos adultos, para obter informações cruciais sobre prejuízos sociais, bem como no contexto da emissão de vocalizações ultra-sônicas. Tais análises irá lançar uma nova luz sobre a organização e as funções do rato vocalizações ultra-sônicas. Finalmente, nós também anunciar a possibilidade de compartilhar gravações de vocalizações ultra-som com toda a comunidade científica sobre o banco de dados mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). livre acesso a dados de gravação de áudio deve impulsionar o conhecimento do rato de comunicação ultra-som, permitindo que os cientistas para comparar os seus próprios dados com vocalizações de ultra-sons registrados em outros labolabora- (com estirpes / protocolos semelhantes ou diferentes), e / ou para desafiar os seus métodos de análise com arquivos gravados em diferentes condições.

Protocolo

declaração de ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comité d'Ethique en Experimentação Animal (CETEA) n ° 89 no Instituto Pasteur, Paris.

1. Preparação de animais

1. Para gravar as chamadas de isolamento filhote de obter fêmeas grávidas a partir da estirpe de ratinhos de interesse. Nota: Raça machos heterozigotos e fêmeas para obter pelo menos 10 litros, incluindo do tipo selvagem, heterozigoto e filhotes knock-out para obter animais de controle robusto.
2. Obter duas categorias de camundongos adultos para gravar vocalizações durante as interações do mesmo sexo.
   1. Obter, pelo menos, 12 do sexo masculino ou do sexo feminino de 12 cada genótipo como ratinhos de teste a partir da estirpe de interesse (para ter em conta a variabilidade inter-individual). Nota: Este protocolo é bem adaptado para os adultos, mas pode ser ajustado para juvenis, com o tempo de isolamento reduzida antes da experiência ^9. Este teste funciona para machos ou fêmeas. No entanto, evitar ensaios masculinos de linhagens de camundongos que exibem um fenótipo agressivo clara no teste de interação social entre homens.
   2. Para maximizar a quantidade de interacções afiliativas, isolar os animais de teste antes das experiências. Casa machos individualmente durante 3 semanas (para reduzir as interações agressivas para um ^14,17 mínimo) e fêmeas de 3 dias (E. Ey, dados não publicados) para aumentar a sua motivação social.
   3. Obter machos ou fêmeas de estirpes representante do fundo genético da estirpe de teste para usá-los como recém-chegados (por exemplo, como os ratos que interagem, ver 3.1.3). Por exemplo, se a estirpe mutante ser estudada foi gerado no fundo / 6J ratinhos C57BL, usar C57BL / 6J como recém-chegados. Calcular o número de animais necessários para que cada um destes ratinhos não é usado mais do que 2 vezes por dia como recém-chegado. Abrigá-los em grupos.
3. Obter duas categorias de ratos adultos do sexo masculino para gravar vocalizações em presença de uma fêmea do estro.
   1. Obter pelo lleste 12 machos sexualmente maduros de cada genótipo da estirpe de interesse (para ter em conta a variabilidade inter-individual). Nota: Se os homens nunca tiveram experiência com fêmeas antes, colocá-los em gaiolas individuais e deixá-los passar uma noite com uma mulher, dois dias antes do teste para aumentar a sua motivação para emitir vocalizações ultra-sônicas ^6.
   2. Obter fêmeas sexualmente maduros da linhagem dos machos gravadas fundo. Por exemplo, se os machos mutantes serem estudados foram gerados no fundo / 6J ratinhos C57BL, usar C57BL / 6J fêmeas. Calcular o número de fêmeas necessárias para que cada um destes ratinhos não é usado mais do que 3 vezes por dia. Abrigá-los em grupos.

2. Solicita isolamento Pup

1. Identificação pup
   1. Três dias antes do dia de nascimento previsto, isolar as fêmeas grávidas.
   2. Verifique as fêmeas para o nascimento todas as manhãs e todas as noites. Observe o dia do nascimento de P0.
   3. Identificar os filhotes no P1 usando longa duração tatuagens pata (injeção subcutânea de tatuagem verde colar com 0,3 mm x 13 mm [30 G ½ "] agulha). Criar um código com um, dois, três ou quatro patas marcadas. Seja como rápido possível, para perturbar minimamente os filhotes, e colocá-los de volta no ninho o mais rapidamente possível.
2. Configurar a gaiola para chamadas de isolamento Grave filhote.
   1. Usar uma câmara de self-made à prova (Figura 1A) ou uma caixa de isopor simples. Coloque um termómetro dentro da caixa para controlar a temperatura para cada gravação. Certifique-se de que a temperatura se mantenha entre 18 ° C e 22 ° C.
   2. Coloque um microfone na parte superior (através de um orifício na parte superior da caixa). Ajuste a altura do microfone para que a membrana do microfone é de 12-15 cm acima do fundo da caixa onde o cachorro vai deitar-se. Ligue o microfone à placa de som e placa de som para o computador.
   3. Para ajustar o ganho do souND cartão, realizar um ensaio de gravação com um cachorro que não irá ser utilizado na experiência. Coloque o filhote nas mesmas condições que na experiência (ver 2.3.1). Feche a porta. Ajustar o ganho na placa de som, de modo que é no valor máximo (para ter a máxima amplitude possível para as vocalizações), mas sem sobrecarregar (verificar no visor do espectrograma vivo no software de gravação).
      Nota: Alguns chamadas pode ser sobrecarregado se a amplitude da maioria das chamadas é mantido no nível mais alto possível.
   4. Registre o nível de ganho para cada sessão de gravação e não mudá-lo entre filhotes / ninhadas / sessões. Variações nos níveis de ganho levaria à detecção chamada imprecisas e medidas variáveis ​​acústicas com os mesmos limiares nas análises utilizando a detecção e medições (ver 5.1 a 5.4) automática.

Figura 1: configurar para gravar o isolamento chamadas de filhotes de rato e espectrogramas de vocalizações ultra-sônicas (A) Exemplo de uma câmara à prova de som self-made para gravar chamadas de isolamento filhote.. (B) Espectrogramas dos diferentes tipos de chamadas utilizados na presente classificação do tipo de chamada; veja a descrição na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Conduzir a gravação de isolamento pup chama de dois em dois dias. Realizar gravações de manhã para filhotes nascidos no meio da noite, e à tarde para filhotes nascidos durante o dia para evitar a categorização nas mesmas filhotes classe etária com metade de um dia de diferença de idade. Isso é mais perceptível para os muito jovens estágios P2 e P4.
   1. Tome um filhote de cachorro na areia. Coloque-o mais rápido e suavemente quanto possível em um recipiente plástico lavado com etanol a 10% e seca (diâmetro: 9cm; Altura: 10 cm para evitar que os filhotes mais velhos de escapar da área coberta pelo microfone). Coloque o recipiente só sob o microfone.
   2. Feche a caixa de forma tão rápida e silenciosamente possível. Iniciar a gravação de filhote de vocalizações ultra-sônicas no software de gravação (formato de 16 bits, 300 kHz frequência de amostragem para capturar amplitude de som até 150 kHz com uma alta qualidade).
   3. Após o tempo necessário de gravação decorrido (até 5 minutos), parar a gravação. Pegue o cachorro fora da caixa. Anote as tatuagens pata do filhote.
   4. Tome a temperatura axilar do filhote de cachorro com uma sonda termômetro. Mark o filhote em sua parte traseira com um ponto minúsculo com uma caneta cheiro-less (tinta de água), para reconhecer mais facilmente os filhotes já gravadas no ninho quando o próximo é escolhido e para evitar a manipulação de todos os filhotes de cada vez que um novo é escolhido. Coloque o filhote de volta ao ninho.
   5. Lave o recipiente plástico e do plástico que cobre o seu fundo com 10% de etanol e seque-o bemantes de colocar a próxima filhote dentro.
   6. Escolha o próximo cachorro no lixo e repetir 2.3.
4. Verifique o peso corporal, coordenação motora, geotaxis negativos, e as marcas de desenvolvimento (para mais detalhes sobre a bateria de ensaios reduzido por favor, consulte as seções de método em Schmeisser et al. ¹⁸ e em Ey et al. ¹⁹⁾ após um período de repouso de 1 hora para permitir os filhotes para se recuperar após a emissão desgastante de vocalizações ultra-sônicas. Use um outro grupo de animais se a bateria de testes de desenvolvimento completo, tal como em Chadman et al. ²⁰ e Scattoni et al. ²¹ é conduzida.
5. Repita essas gravações a cada dois dias entre P2 e P12 para caracterizar filhote comportamento e desenvolvimento vocal ao longo de suas duas primeiras semanas de vida.

3. Ultrasonic vocalizações durante a pessoas do mesmo sexo Interações Sociais

1. vocalização Recordings
   1. Prepara-se uma gaiola de ensaio (50 x 25 cm x 30 Cm ^3; Plexiglas, 100 lux [baixa intensidade de luz branca]) limpa com água e sabão, seco e cheio de 2 cm camas frescas na câmara à prova de som.
      1. Coloque o microfone para que vocalizações emitidas por todos os cantos da gaiola pode ser gravado. Fixe o microfone num canto da gaiola de teste (quer na gaiola ou em um tripé) e ajustar a parte inferior do microfone-cage ângulo para cobrir toda a superfície da gaiola.
         Nota: Os ultra-sons são muito direcional.
      2. Coloque uma câmara de vídeo na parte superior da câmara à prova de som para capturar a totalidade da superfície da gaiola de teste.
         Nota: Verifique se o microfone não está escondendo um canto da gaiola de teste no vídeo.
      3. Antes do ensaio, ajustar o ganho da placa de som com um macho e uma fêmea de reposição de reposição que não irá ser utilizado na experiência posterior. Coloque estes animais na gaiola de teste na câmara de gravação. Ajustar o nível de ganho na placa de som para maximizar a amplitude das vocalizações gravadas but para minimizar a sobrecarga como visto no visor espectrograma vivo do software de gravação.
         Nota: O ganho depende da distância entre o microfone e os animais vocalizing.
   2. Introduzir o animal a ser testado (macho ou fêmea, que será chamado de "ocupante") na gaiola de teste na roupa fresco. Deixe-o habituar à gaiola de ensaio na câmara à prova de som durante 20 minutos para maximizar o seu interesse para o conspecific desconhecido introduzido no 3.1.3.
   3. Após este tempo de habituação, introduzir o animal ^2ª para a interação (macho ou fêmea, mesmo sexo que o ocupante, mas diferentes marcas auriculares / tatuagem pata para identificá-los mais tarde, ele vai ser chamado de "recém-chegado").
      1. Começar a gravar as vocalizações ultra-sônicas (formato de 16 bits, frequência de amostragem de 300 kHz para capturar amplitude de som até 150 kHz com uma alta qualidade) e o vídeo para capturar a introdução do recém-chegado na gaiola de teste. Iniciar a gravação do uvocalizações ltrasonic durante habituação (ocupante sozinho) se é necessária uma comparação entre o nível basal de emissão de vocalização durante a exploração gaiola e a interação social.
      2. Sincronizar manualmente / visualmente as gravações de áudio e vídeo, pressionando o relógio tempo (som "bip" perto do microfone) exatamente quando as patas traseiras do rato recém-chegado tocar o chão.
      3. Deixar os dois animais interagem durante o tempo desejado (por exemplo, 4 min, um tempo suficiente para recolher vocalizações ultra-sónicas suficientes).
   4. Coloque o ocupante eo recém-chegado de volta em suas respectivas gaiolas. Esvaziar a cama utilizado da gaiola teste, lave-o com água e sabão e seque-o com toalhas de papel. Coloque roupas de cama e colocá-lo de volta na câmara à prova de som para o próximo teste.

4. Vocalizações masculinos durante a interação com um Estrus Feminino

1. No início da manhã do dia de testar amachos, tome esfregaço vaginal de cada mulher para determinar o seu estatuto sexual dentro do ciclo estral.
   1. Segure a fêmea pela cauda e manter sua posição da grelha gaiola. Usar uma pipeta para lavar as vagina várias vezes com 20 ul de PBS (isto é, injectar e recordar as mesmas 20 ul de PBS várias vezes). Recordar a 20 ul PBS com a mesma ponta de pipeta. Use PBS estéril, para evitar qualquer infecção se as fêmeas estão a ser testado durante vários dias consecutivos.
   2. Espalhe o PBS que contém a suspensão de células numa lâmina de vaginais. Coloque quatro amostras em uma corrediça (identificar os indivíduos na parte lateral da lâmina com um lápis). Deixe as lâminas secar antes de realizar a coloração.
   3. Trabalhar sob o capô laboratório fume.
      1. Preparar um banho de puro pode-Grunwald, um banho de solução de tampão fosfato (0,1 M) e um banho de Giemsa R (1/20 em solução tampão de fosfato).
      2. Coloque os slides no banho de puro May-Grünwald para 3 min, em seguida,lavá-los no banho de solução tampão de fosfato durante 1 minuto e, finalmente, transferi-los durante 10 min no banho de Giemsa R (1/20 em solução tampão de fosfato).
      3. Depois disso, enxaguar as lâminas de novo no banho de solução tampão de fosfato durante 10 segundos e deixar secar.
   4. Examine as lâminas coradas ao microscópio. As fêmeas que podem ser usados ​​durante o dia são aqueles cujas amostras apresentam células epiteliais cornified apenas as grandes (sem núcleo, com detalhes em azul; cio completo).
2. Colocar os machos na sala de ensaio, pelo menos, 30 min antes de testar-los.
3. vocalização Recordings
   1. Repetir 3,1, se necessário.
   2. Introduzir o macho para ser testado (em camas frescas). Deixe-o habituar à gaiola de ensaio na câmara à prova de som por 10 min.
   3. Após este período de habituação, introduzir uma fêmea no cio (entre aqueles seleccionados de entre o manchamento).
      1. Começar a gravar as vocalizações ultra-som e o vídeopara capturar a introdução da fêmea na gaiola de teste. Começar a gravar as vocalizações ultra-som durante a habituação (masculino sozinho) se é necessária uma comparação entre o nível basal de emissão de vocalização durante a exploração gaiola e a interação social.
      2. Sincronizar manualmente / visualmente as gravações de áudio e vídeo, pressionando o relógio tempo (som "bip" perto do microfone) exatamente quando as patas traseiras do rato fêmea tocar o chão.
      3. Deixar os dois animais interagem durante o tempo desejado (por exemplo, 4 min, um tempo suficiente para recolher vocalizações ultra-sónicas suficientes).
   4. Coloque o macho ea fêmea de volta em suas respectivas gaiolas. Esvaziar a cama utilizado da gaiola teste, lave-o com água e sabão e seque-o com toalhas de papel. Coloque roupas de cama e colocá-lo de volta na câmara à prova de som para o próximo teste.
      Nota: É ideal para usar cada fêmea estro apenas uma vez por dia (mas se necessário, ele podeser usado até 3 vezes no mesmo dia, mas não em uma linha).

5. Variáveis ​​a ser extraído

1. Prepare arquivos de áudio para as análises. Nota: O procedimento a seguir é específico para um visoft SASLab Pro e pode mudar de acordo com o software usado.
   1. Corte os arquivos para que eles começam exatamente no "bip" do relógio do tempo, e termina após a duração desejada (5 min para gravações de cachorro, 4 min para gravações de adultos).
   2. Filtrar a amplitude inferior a 30 kHz usando um filtro passa-alta (Edit> Filtro> Filtro FIR no Domínio do Tempo; High Pass com frequências de 30 kHz cortadas). Use processamento em lote para filtrar todos os arquivos de interesse (Ações> Processamento em lote> filtro FIR).
   3. Identificar cada vocalização ultra-som, rotulando-os com o software.
      1. Use a detecção automática para gravações de cachorro (Ferramentas> Labels> Criar marcadores de seção de eventos de forma de onda). Ajuste o limiar, segure tempo e margem de fou a detecção mais precisa. Verificar manualmente a detecção e ajustar os rótulos se necessário (recomendado).
      2. Use a detecção visual (inserção manual dos rótulos) para gravações de adultos com ruído de fundo (selecione as vocalizações, clique direito, e inserir rótulo secção de marcador).
   4. Criar o espectrograma. Ative medições automáticas de parâmetros (Ferramentas> medição de parâmetros automáticos> medição de parâmetros configuração automática).
   5. Verificar "permite medições automáticas", os "parâmetros de computação de todo espectrograma", e as caixas "Actualização automática". Selecione "Elemento de separação": interativamente (etiquetas de seção).
   6. As caixas de seleção para calcular os parâmetros desejados temporais (Duração do elemento tempo, intervalo, Start / End) e parâmetros baseados em espectro (freqüência de pico), e a localização das medições (início do elemento, Fim do elemento, dizer, Max, Min) .
   7. Copie as medições e cole om em uma planilha.
      Nota: Para gravações realizadas com adultos, as medições de parâmetros baseados em espectro pode ser impossível por causa do ruído de fundo. Use medições manuais de frequência de pico, clicando sobre os diferentes valores de freqüência diretamente no espectrograma e colando os valores manualmente em uma tabela.
2. Determinar a taxa de chamada, ou seja, número de chamadas por minuto pelo primeiro determinar o número de vocalizações emitidas (número total de etiquetas). Em seguida, calcular a taxa de chamada pela divisão do número total de vocalizações gravadas pela duração (em minutos) do arquivo.
3. Determinar organização temporal, ou seja, a distribuição de intervalos de tempo entre as chamadas para determinar organização sequência.
   1. Calcular os intervalos de tempo entre o final da vocalização n e o início da vocalização n + 1 usando a hora de início / fim de cada etiqueta.
   2. Estabelecer a densidade de distribuição dos intervalos de tempo entre ultrasomvocalizações CI.
4. Determinar repertório chamada, ou seja, definir os tipos de chamada presentes na gravação. Usar o exemplo de classificação apresentada na Tabela 1 e na Figura 1B.
   1. Quando identificar cada vocalização em 5.1.3, escreva o nome do tipo de chamada no rótulo.
   2. Calcular o número exato ea proporção de cada tipo de chamada para construir o repertório vocal.
5. Determinar as características acústicas de cada vocalização, ou seja, a duração, a frequência de pico (ou seja, a frequência com a maior amplitude) no início e no final da chamada, máximo e mínimo de freqüência de pico e média frequência se a medição automática é possível (Figura 1B) .
   1. Use a função de medição de parâmetros automática no software para medir a duração automaticamente, características de pico de frequência (por exemplo, início, fim, média, máxima, mínima) em gravações filhote.
   2. Utilizar a duração da etiqueta, conforme a duração da vocalização para gravações adultos. Medir manualmente na janela do espectrograma as características de frequência de pico (por exemplo, início, fim, no máximo, mínimo).
6. Casal de dados vocalização ultra-som e dados de interações sociais (MiceProfiler plug-in a partir da plataforma ICY ^22).
   1. Certifique-se de sincronizar o mais precisamente possível o as gravações de vídeo, conforme descrito no protocolo de áudio e.
   2. Codificar o vídeo da interação social usando os ratos Profiler Rastreador plug-in da plataforma ICY como descrito em de Chaumont et al. ^22. Inicie o rastreamento exatamente quando as patas traseiras do animal introduzido tocar o chão.
   3. Faça o upload do arquivo de vídeo codificado e seu arquivo xml correspondente (gerada por Mice Profiler Tracker) nos ratos Profiler Vídeo Label Maker plug-in da plataforma ICY como descrito em de Chaumont etal. ^22.
      Nota: Os ratos Profiler Vídeo Label Maker plugin irá ligar automaticamente o arquivo de vídeo eo arquivo de texto gerado a partir da análise do arquivo de áudio, se eles têm o mesmo nome (ver: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) .
   4. Depois de verificar que a escala do mouse estiver correto, clique em "Criar USV estatísticas" para cada arquivo para obter o número ea proporção de vocalizações emitidas durante cada evento social em um arquivo separado.

6. upload de arquivos no banco de dados mouseTube

1. Verifique se os arquivos estão em um servidor de armazenamento que pode ser acessado de fora da instituição.
   Nota: Os servidores hospedados em algumas instituições com altos níveis de segurança terá uma configuração específica para ser acessível por pessoas que ligam de fora da instituição.
2. Ir para o site mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Log (Acesso apassword nd são atribuídos a cada usuário pelos administradores).
3. Verifique se a estirpe de ratinhos já gravada existe no banco de dados mouseTube clicando no botão "linhagens". Se não, pergunte aos administradores para criá-lo.
4. Criar indivíduos usando os "assuntos> Criar" botão. Entre os códigos de identificação registados os animais. Reuni-los em grupos para facilitar a recuperação posterior dos dados.
5. Introduza a descrição do protocolo usado para gravar vocalizações ultra-som usando os "Protocolos> Criar" botão.
6. Criar uma experiência para cada sessão de gravação usando os "Experimentos> Criar" botão. Especifique o protocolo, o grupo de indivíduos que foi gravada, o hardware eo software utilizado e as suas especificidades.
   Nota: O experimento reúne todos os metadados correspondentes aos arquivos de vocalização.
7. Criar o link para os arquivos de vocalização usando o "vocalizações> criar & #34; botão. Escolha a experiência dentro da lista. Copie e cole o URL do arquivo de vocalização (este link começa com http: // ...) no campo correspondente do "Arquivos de ligar" coluna. Validar as entradas clicando no botão "Criar uma ligação entre mouseTube e os arquivos".
   Nota: Não é necessária para preencher cada quadro para cada arquivo ao mesmo tempo.
8. Se necessário, modificar os links inseridos em qualquer momento, e adicionar detalhes na seção "Notas". Não hesite em escrever notas para dar mais detalhes. Por exemplo, se um link para um arquivo de vídeo que foi gravado simultaneamente com o arquivo de áudio foi inserido, isto pode ser especificado nas "Notas".

Resultados

Com os actuais protocolos, que caracterizou o comportamento vocal de ratos sem ProSAP1 / Shank2, um gene associado com transtornos do espectro do autismo (ASD) ^23-25. ASD são caracterizadas por deficiências na comunicação social e comportamentos estereotipados ^1. Nossos Shank2 ^{- / -} ratos exibido hiperatividade, aumento da ansiedade e da comunicação vocal atípico ^18,26. De fato, observamos que Shank2 ^{- / -} ratos mostraram um perfil de desenvolvimento atípico em sua taxa de emissão de chamadas de isolamento filhote de cachorro em comparação com o invertida curva típica em forma de U nos seus companheiros de ninhada de tipo selvagem Shank2 ^{-. / -} Ratos mostraram um aumento da taxa de chamada em P4 e diminuição da taxa de chamada de P6, em comparação com os seus companheiros de ninhada de tipo selvagem (Figura 2). Observamos também uma taxa de chamadas diminuiu em interações do sexo feminino envolvendo um Shank2 ^{- / -} fêmea na COMPARAÇÃON com interacções que envolvem uma ninhada de tipo selvagem (Figura 2). Nós examinamos o repertório das 5 categorias diferentes de chamadas. Parecia ser diferente entre os filhotes (por exemplo, aqui P2, P6 e P10) e adultos (Figura 3). diferenças relacionadas ao genótipo foram significativas principalmente na idade adulta. Durante as interações sociais envolvendo adultos Shank2 ^{- / -} machos ou fêmeas com uma fêmea C57BL / 6N, mais curtas e chamadas não estruturadas foram gravadas em comparação com interações envolvendo seus companheiros de ninhada de tipo selvagem (Figura 3D e E). Chamadas de menor complexidade e frequência salta chamadas também foram registrados durante as interações com uma fêmea / 6N C57BL envolvendo Shank2 adulto ^{- / -} do sexo feminino em comparação com interações envolvendo Shank2 fêmeas ^{+ / +} (Figura 3E). Finalmente, também medido variáveis ​​acústicas manualmente. Não houve significativa relacionada com o genótipo diferença dudesenvolvimento anel. Em contrapartida, a duração das chamadas gravadas durante as interações que envolvem Shank2 adulto ^{- / -} fêmeas eram mais curtos do que aqueles registrados durante interações envolvendo seus companheiros de ninhada de tipo selvagem (Figura 4A). Também destacou que a freqüência de pico de vocalizações ultra-som aumentou durante o desenvolvimento do filhote, sem diferença relacionada com o genótipo significativa ^26. Durante interações envolvendo Shank2 ^{- / -} machos ou fêmeas com uma fêmea C57BL / 6N, vocalizações ultra-som tinha uma freqüência de pico menor em comparação com chamadas gravadas durante as interações envolvendo seus companheiros de ninhada de tipo selvagem (Figura 4B).

Além disso, o presente protocolo também permitiu estudar o contexto de emissão de vocalizações ultra-sónicas através da combinação dos dados de gravações de áudio para os dados extraídos das MiceProfiler comportamentais (software gelado, Institut Passadoeur, Paris). Por exemplo, em interações fêmea-fêmea, a maioria das vocalizações ultra-sônicas foram emitidos quando os animais estavam em contato e mais especificamente o ocupante sniffing região ano-genital do recém-chegado, ou pelo menos o ocupante estar por trás do recém-chegado. Os ratinhos também emitida muitas vocalizações ultra-sons, quando o ocupante aproximou-se do recém-chegado (Figura 5, painel superior). Menos vocalizações foram registrados quando o Shank2 ocupante ^{- / -} ratos estavam em contato físico com o recém-chegado (por exemplo, cheirando a região ano-genital do recém-chegado) do que quando o ocupante era um rato do tipo selvagem. Menos vocalizações foram acionados quando o ocupante atrás do recém-chegado era um Shank2 ^{- / -} rato do que quando era um rato do tipo selvagem. Mais vocalizações também foram anotados quando o recém-chegado estava no campo visual do rato ocupante, e mais ainda no selvagem-tipos do que nos mutantes (Figura 5, painel inferior).

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Figura 2:. Taxa de emissão de vocalizações ultra-som durante o desenvolvimento e no adulto masculino e feminino Shank2 ^{- / -} ratos e do tipo selvagem littermates Chamada taxa de filhotes (a cada dois dias a partir de P2 a P12, n = 18-19 Shank2 ^{+ / +,} n = 15-16 Shank2 ^{- / -)} e adultos do sexo masculino durante as interacções de estro-fêmea (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -)} e as interações entre fêmeas (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^{- / -)} em ratinhos de tipo selvagem (painel esquerdo) e Shank2 ^{- / -} ratos (painel direito). Os dados são apresentados como a média +/- SEM e os pontos individuais (não pareado Wilcoxon: * p <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001).ge.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:. Repertório vocal de Shank2 ^{- / -} murganhos e de tipo selvagem da mesma ninhada proporções dos cinco tipos de chamadas diferentes emitidas por crias P2 (a; n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} filhotes P6 (B; n = 19 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} filhotes P10 (C; n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} machos adultos com uma fêmea de cio (D ; n = 16 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -)} e fêmeas adultos com outra fêmea (e; n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^{- / -)} em ratinhos de tipo selvagem (painéis à esquerda) e Shank2 ^{- / -} ratos (painéis da direita). Os dados são apresentados como média +/- SEM e pontos individuais (qui-quadrado: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. Variáveis ​​acústicas extraídos de vocalizações ultra-sónicas no Shank2 ^{- / -} murganhos e de tipo selvagem da mesma ninhada (A) Duração de todos os tipos de chamadas confundidos emitida por filhotes P2 (n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -} ), filhotes P6 (n = 19 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} filhotes P10 (n = 20 Shank2 ^{+ / +} , n = 18 Shank2 ^{- / -),} machos adultos com uma fêmea estro (n = 16 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -)} e fêmeas adultas com outra fêmea (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^{- / -)} em murganhos de tipo selvagem (painel da esquerda) e Shank2 ^{- / -} ratinhos (painel da direita). (B) Freqüência máxima de pico medido em todos os tipos de chamadas confundidos em filhotes P2, filhotes P6, P10 filhotes, machos adultos com uma fêmea estro e feminino adulto com outra fêmea (mesmos Ns como acima). Os dados são apresentados como média +/- SEM e pontos individuais (não pareado Wilcoxon: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Contexto. s de emissão de rato vocalizações ultra-sônicas em interações adulto fêmea-fêmea sociais Proporção de vocalizações ultra-som emitido pelos pares envolvendo um Shank2 ^{+ / +} com um rato C57BL / 6N (n = 16, A) e pares envolvendo um Shank2 ^{- / -} com um rato C57BL / 6N (n = 13, B) durante os seguintes tipos de eventos comportamentais (vermelho: ocupante, verde: recém-chegado): contatos sociais, oro-oral contato, sniffing ano-genital do rato ocupante, ano- genital sniffing do rato recém-chegado, ocupante trás recém-chegado, recém-chegado por trás dos ocupantes, a imobilidade do ocupante, imobilidade do recém-chegado, a abordagem do ocupante e escapar do recém-chegado, a abordagem do recém-chegado & escapar do ocupante, a abordagem e escapar do ocupante, a abordagem e escapar do recém-chegado, ocupante seguindo o recém-chegado, recém-chegado no campo da visão do ocupante, ocupante no campo de visão do recém-chegado. Os dados são pressentia como média +/- SEM e pontos individuais (testes não-pareado de Wilcoxon: * p <0,05, ** p <0,01). Dados não publicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tipos de chamadas	Descrição
baixo	duração ≤5 ms e de frequência ≤6.25 kHz
simples	duração> 5 ms e de frequência ≤6.25 kHz (flat) ou modulação de frequência em apenas um sentido (ascendente ou descendente), com frequência de gama> 6,25 kHz
complexo	modulações de frequência em mais de uma direção e de frequência> 6,25 kHz (modulada), ou inclusão de um ou mais frequência component (fenômenos harmônicas ou não lineares, mas sem saturação), mas nenhuma restrição sobre faixa de freqüência (complexo)
saltos de frequência	inclusão de um salto (um salto de freqüência) ou mais saltos (frequência de saltos, outros) na frequência sem intervalo de tempo entre os componentes de frequência consecutivos, com (misto) ou sem qualquer parte barulhenta dentro da chamada tom puro
desestruturado	não identificável componente tonal; chamadas "Noisy"

Tabela 1:. Características dos cinco tipos de rato vocalizações ultra-sônicas Exemplos de critérios de duração, faixa de freqüência, modulações de frequência e de saltos de frequência utilizadas para determinar 5 tipos de chamada diferentes dentro do mouse vocalizações ultra-sônicas.

Discussão

O protocolo aqui apresentado fornece formas padronizadas e confiáveis ​​para recolher rato vocalizações ultra-sônicas no laboratório. Estas situações restritas muito apresentar a vantagem de normalização. Eles são usados ​​com sucesso para comparar estirpes ou genótipos dentro estirpes ^18,19,26,27. Conforme apresentado nos resultados representativos, esses métodos permitem a identificação de Comunicação Social atípico em camundongos mutantes para Shank2, um gene associado a perturbações do espectro do autismo. As comparações entre linhagens de camundongos, entre diferentes contextos ou mesmo entre laboratórios será acionado pela disponibilidade de conjuntos de dados maiores na base de dados mouseTube. Esta ferramenta deve impulsionar os estudos sobre rato vocalizações ultra-sônicas, permitindo análises multivariadas.

Os protocolos aqui descritos são optimizados para testar ratinhos de diferentes genótipos dentro de uma estirpe, como é feito na maior parte dos estudos de modelação a C genéticaONTRIBUIÇÃO a distúrbios neuropsiquiátricos. Recomenda-se a projetar experimentalmente cada estudo para ter os melhores controles possíveis. Na verdade, os efeitos da maca pode mascarar ou inflar artificialmente os efeitos genéticos ^28,29. Por isso, é aconselhável incluir controles da mesma ninhada de cada genótipo. Breeding pais heterozigotos deve, portanto, ser favorecida, uma vez que permitirá a correspondência correta de ratos mutantes e controle dentro de uma ninhada. Isto justifica a marcação de todos os filhotes tatuagem da pata (cego para o genótipo) para rastrear indivíduos ao longo das gravações a cada dois dias. A genotipagem é feito ao desmame, tomando amostras de cauda. Ao gravar chamadas de isolamento filhote de P2, nós não recomendaria a recolha de amostras de cauda já nos filhotes, uma vez que esta operação inclui a manipulação suplementar e estresse muito perto no tempo para uma sessão de gravação.

Os protocolos sugeridos aqui para obter vocalizações ultra-sônicas em adultos não permite uma identificação clara do emitter das vocalizações. Isso explica por que manipular a motivação do animal de teste. Na verdade, os ratinhos de teste são isoladas e não o recém-chegado e os animais de teste se habituem durante um longo período de tempo para a gaiola de teste durante interacções do mesmo sexo. Em interacções macho-fêmea, a fêmea introduzido não é isolado e o macho de teste habitua de tempo mais curto, uma vez motivação pode ser mais elevado neste contexto sexual. Estas manipulações de motivação deve maximizar a probabilidade de o rato teste de emissão de vocalizações e não o apresentou. Para gravar vocalizações ultra-sónicas macho num contexto sexual, um cotonete simples com urina (ou seja, não congelada) fresco de uma fêmea estro também pode ser introduzido na gaiola ^30. Este método permite a atribuição de vocalizações ultra-sônicas para o macho teste com 100% de certeza, mas impede a coleta qualquer informação específica sobre o contexto social real da emissão destas vocalizações. Portanto, somos a favor da Protocol descrito aqui (com uma fêmea estro livremente em movimento). Recomendamos também usar sempre ratos introduzido a partir da mesma estirpe ao testar os ratos a partir de uma estirpe mutante e analisar os dados como um par de ratos vocalizando. Um estudo recente promove o uso da triangulação para localizar o emissor ^31. Neste estudo, as fêmeas foram encontrados para também emitem vocalizações ultra-sónicas durante encontros com um macho. Isto pode ser explicado pelo fato de que foram isolados por pelo menos duas semanas antes da sessão de gravação. A generalização do uso da triangulação proposto neste estudo devem, no entanto, permitir a identificação do emissor das vocalizações na maioria dos casos, se as gravações de vídeo são devidamente sincronizados.

As chamadas de isolamento de filhotes registrados durante o desenvolvimento não sejam perturbados pelo ruído de fundo da cama. Normalmente uma análise automática funciona muito bem para extrair os principais variáveis. Em contraste, as vocalizações gravadas de adultos são disturbed pelo ruído de fundo dos animais que se deslocam na cama. A análise automática pode falhar, e por conseguinte a análise manual deve ser usado. No entanto, a adição de cama na gaiola de ensaio deve proporcionar condições que são menos estressante para os animais do que o solo descoberto (que os ratos não gostam). Mais esforços da comunidade estão concentrados em melhorar a detecção automática de vocalizações ultra-sônicas sob várias condições, mesmo aqueles que impliquem os ruídos de fundo. Por exemplo, o software de voz permite analisar vocalizações que tinham sido seleccionadas manualmente para a ausência de ruído de fundo ^32. Neste software, a extração das variáveis ​​acústicas é automática, mas necessita da selecção manual inicial.

Deve notar-se que a variabilidade inter-individual é muito importante no comportamento vocal de ratinhos. Por exemplo, a taxa de chamada de machos adultos em presença de uma fêmea estro é muito distribuído (Figura 1). Nós suggest desses protocolos padronizados para eliciar vocalizações ultra-sónicas já para limitar a variabilidade relacionada com o contexto experimental. No entanto, gostaríamos de salientar a importância de apresentar não apenas a média e SEM para os dados, mas o mais importante os pontos individuais em amostras de pequeno tamanho ^33. Ele também é muito relevante - se não for necessário - para gravar pelo menos 12 indivíduos de cada grupo / genótipo para recolher dados representativos. Em muitos casos, a variabilidade inter-individual não deve ser escondido (normalmente ele não pode ser), e pode ser de grande importância para identificar os indivíduos portadores da mutação genética estudada, mas não exibem qualquer fenótipo atípico. Tais indivíduos poderiam fornecer pistas sobre compensações, o que pode abrir novos caminhos para terapias de doenças genéticas.

Na maioria das caracterizações de comportamento de modelos de rato para distúrbios neuropsiquiátricos, comportamento vocal e contatos sociais são considereEd para além (por exemplo, ^{19,27,34,35).} Recentemente, métodos de análise agora fornecer uma caracterização detalhada semi-automática dos eventos sociais e sequências de eventos durante uma interacção (por exemplo, usando MiceProfiler) ^36, bem como a possibilidade de combinar este com a análise de dados a partir de gravações de áudio. A principal vantagem deste método é fornecer uma visão abrangente da comunicação social nos modelos do rato do ASD, para identificar mais precisamente quais os aspectos de comunicação social são afetados. No presente protocolo é a sincronização ainda manual, mas isto pode ser melhorado pelo desencadeamento da gravação de vídeo através do software de gravação de áudio. Este tipo de análise deve se tornar o padrão para fornecer uma visão mais abrangente de déficits de comunicação social no mouse modelos de distúrbios neuropsiquiátricos. Além disso, até agora, os sinais vocais são principalmente analisadas a partir do lado do emissor (isto é, os testes são construídos para favorecer a emissão de VOsinais de cal por o rato testados, como no presente protocolos). O foco agora deve também ser definida no receptor desses sinais, para melhor identificar as funções desses sinais acústicos. Isto deve ser feito avaliando também o comportamento dos camundongos recém-chegado nos actuais protocolos em adultos (usando MiceProfiler por exemplo) ^36, utilizando experimentos de reprodução ^16, ou através da criação de novos protocolos. Na verdade, os actuais protocolos proporcionam situações muito restritas que talvez não reflitam as condições etológicas exatas de emissão de vocalização em camundongos. A emissão espontânea de vocalizações ultra-som terá de ser mais bem caracterizados usando gravações de áudio e vídeo contínuos para lançar mais luz sobre o comportamento vocal espontânea de camundongos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
needles 0.3mm x 13 mm [30 G 1/2"]	BD Microlance	304000	-
green tattoo paste	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA	-
thermometer	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
self-made soundproof chamber (pups)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 cm x 33 cm x 32 cm
small surface thermister + single probe thermocouple	Harvard Apparatus	599814 + 601956	-
smell-less pen	for instance: Giotto	-	ink made with water, washable: these pens are designed for babies
Ethanol absolute (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, France	24103	diluted 1/10
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#40011	furnished with extension cables by the Avisoft company
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#34163	sound card
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10301; #10302	recording software for Windows Vista, 7 and 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany	#10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software.
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp	-	-	running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints
plastic recipient (pup recordings)	Lock & Lock, Chatswood, USA	HPL932D	Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700 ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height
PBS 1x (pH = 7.4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023	-
slides	Menzel-Gläser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grünwald solution 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	320070-0500	-
Giemsa R 500 ml	RAL Réactifs, Martillac, France	720-1107	diluted 1/20 in phosphate buffer solution
phosphate buffer solution (self-made)	-	-	pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml)
test cage	Institut Pasteur, Paris	-	50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas
self-made soundproof chamber (adult recordings)	Institut Pasteur, Paris	-	acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm
video camera	From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands	-	high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	video acquisition software
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform	Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	tracking software to analyse behavioral events during social interactions