بمساعدة الليزر تسليخ مجهري (لام) كأداة للالترانسكربتي التنميط من أنواع الخلايا الفردية

Summary

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Abstract

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Introduction

في دراسات النسخي به على مستوى الأنسجة، وغالبا ما يتم حجب ترنسكربيتوم من أنواع الخلايا المتخصصة جدا ولكن نادرة من الخلايا المحيطة بها أكثر وفرة. مثال لمثل هذه أنواع الخلايا المتخصصة جدا هي خلايا النسب التناسلي للأنثى (الخط الجرثومي) في النباتات. يتم تحديد سلالة الجرثومية الإناث داخل البويضات النامية، والسلائف من البذور داخل وزيم من ^1،2 زهرة. الخلية أبواغ الضخمة الأم (MMC) هي الخلية الأولى من سلالة الجرثومية الإناث. فإنه يخضع لالانقسام الاختزالي لتشكيل الرباعيات انخفاض megaspores. عادة، واحد فقط من هذه megaspores على قيد الحياة ويقسم ميتوتيكلي دون الانقسام السيتوبلازمي، أي في مخلى. يتم اتباع هذه mitoses من cellularization لتشكيل الأمشاج ناضجة، الذي يتكون عادة من أربعة أنواع الخلايا: ثلاثة antipodals، خليتين synergid، والبيض، والخلية المركزية. الخلايا البيض والمركزية هي الأمشاج الأنثوية التي تحصل المخصبة من قبل اثنين من الخلايا المنوية خلال ضوالإخصاب بلي لتؤدي إلى الجنين والسويداء من ^1،2 البذور النامية. في النظام النموذجي نبات الأرابيدوبسيس thaliana الجنسي، فقط ~ 50 البذور تنمو في زهرة حين أن حوالي 50 - 80 وضع البذور في زهرة في جنس ترتبط ارتباطا وثيقا Boechera. وهكذا، فإن سلالة الجرثومية الإناث يتكون من عدد قليل من أنواع الخلايا المتخصصة للغاية، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية، مثل مواصفات الخلايا والتمايز.

وعلاوة على ذلك، يمكن رؤية واضحة حول العمليات التنظيمية الجينات التي تنظم تكاثر النبات تكون ذات قيمة تطبيقية. في النباتات، ويمكن أن يحدث كل من التكاثر الجنسي واللاجنسي من خلال البذور (تكاثر لاتعرسي). في حين التكاثر الجنسي يولد التنوع الجيني في عدد السكان، تكاثر لاتعرسي يؤدي إلى تشكيل ذرية نسيلي مطابق وراثيا للنبات الأم. لذلك، تكاثر لاتعرسي لديها امكانات كبيرة للتطبيقات في مجال الإنتاج الزراعي والبذور، وكذلك يمكن المورثات الأمهات حتى المعقدةالإبقاء دون تغيير على مدى أجيال عدة ^3،4،5. بسبب تكاثر لاتعرسي لا تحدث طبيعيا في أي نوع من المحاصيل الرئيسية، هندسة تكاثر لاتعرسي في المحاصيل ذات ^3،4،5 اهتمام كبير. ومع ذلك، فإن هذا الهدف على المدى الطويل هو من الصعب تحقيق لأنه لم يفهم الأساس الجيني والجزيئي الكامن وراء تكاثر لاتعرسي بتفصيل كاف ^6.

للحصول على نظرة ثاقبة أساس النسخي تحكم الاستنساخ apomictic، خلية نوع محدد النسخي التنميط باستخدام تسليخ مجهري بمساعدة الليزر (لام) وتسلسل الجيل القادم (خ ع) يمثل طريقة فعالة جدا ^7،8. وأول مرة يتم إنشاء LAM للبحوث الطبية الحيوية الحيوانية و. في السنوات القليلة الماضية، كما تم تطبيق لام لبيولوجيا النبات ^6،9،10. وعلى النقيض من أساليب أخرى تسمح التنميط من أنواع الخلايا والأنسجة الفردية، لا لام لا تتطلب جيل من خطوط علامة ^6،9،10. لذلك، يمكن أن يكون التطبيقكذب على أي خلية أو نسيج نوع دون معرفة الجزيئية السابقة. ميزة أخرى للام هو أنه يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا طالما يمكن التعرف على الخلية في أقسام الجافة على أساس الموقف و / أو السمات الهيكلية. لام لديه ميزة إضافية أن تستخدم الأنسجة الثابتة، والذي يمنع التغييرات في الشخصية النسخي أثناء معالجة.

الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال، الأنسجة النباتية، ثابتة في تثبيتي غير يشابك قبل التضمين في شمع البارافين. التضمين في شمع البارافين ويمكن أن يتم يدويا، بعد البروتوكولات المعمول ^9،11. ومع ذلك، فإن استخدام معالج النسيج الآلي للجفاف وتسلل مع الشمع النتائج بشكل عام في أعلى استنساخ من حيث الحفاظ على الحمض النووي الريبي الجودة والتشكل الأنسجة. كما تم استخدام استراتيجية بديلة من تضمين الأنسجة في الراتنج بنجاح لتحليل نوع معين من الخلايا LAM ^8. ومع ذلك، فإن استخدام وسيلة أبواATED معالج الأنسجة مبنية الشمع هو وقتا طويلا جدا كفاءة، كما العديد من العينات يمكن معالجتها في تتطلب مرة واحدة كحد أدنى من التدريب العملي في الوقت المحدد. في حين تحدث عادة أي خسائر كبيرة في الحمض النووي الريبي الجودة أثناء التثبيت والتضمين، وإعداد الشرائح الرقيقة مع مشراح، وعلى وجه الخصوص، وتصاعد على frameslides تستخدم للام يبقى خطوة حاسمة للحفاظ على نوعية الحمض النووي الريبي. وقد سبق الإشارة إلى ذلك، وصفت استخدام نظام نقل الشريط أن يؤدي إلى تحسين نوعية الحمض النووي الريبي في هذه الخطوة ^12. ومع ذلك، وهذا يضيف خطوة إضافية تستغرق وقتا طويلا أثناء إعداد الشرائح ويتطلب أيضا معدات خاصة. بروتوكول الأمثل هو موضح أدناه ينتج بتكاثر الحمض النووي الريبي التي هي ذات نوعية كافية لتحديد ملامح النسخي مع GeneCHIPs والجيل القادم التسلسل (خ ع) النهج ^{7،11،13،14.} وبالإضافة إلى ذلك، مع المجهر تسليخ مجهري الليزر المستخدمة، ونقاء عالية من أنواع الخلايا المعزولة هو هزيمةأنتجت inely ^{7،11،13،14.}

جنس Boechera هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخطوات الرئيسية لاستنساخ apomictic. في Boechera، وقد تم تحديد مجموعة متنوعة من مختلف انضمام الجنسية وapomictic، ويمكن استخدامها لتحليلات مقارنة ^15،16،17. في مقارنة بين ترنسكربيتوم خلية نوع محدد من الخلايا من سلالة الجرثومية الإناث من نبات الأرابيدوبسيس الجنسي وapomictic Boechera، حددنا الجينات والممرات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف، وبالتالي تحديد جوانب جديدة من العمليات التنظيمية التي تحكم تكاثر لاتعرسي ^7. وبالإضافة إلى ذلك، التحقق منها هذه الدراسة مدى ملاءمة لام لنوع محدد خلية النسخي تحليل أنواع الخلايا الصغيرة ونادرة. لقد استخدمت بالفعل هذا البروتوكول لتحليل أنواع مختلفة من الخلايا في مجموعة متنوعة من أنواع النباتات، ولكن species- وقد تكون هناك حاجة تعديلات الأنسجة محددة للبروتوكول في بعض الحالات.

Protocol

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إعداد الأنسجة، ليزر بمساعدة تسليخ مجهري، واستخراج الحمض النووي الريبي لتحديد ملامح النسخي. دائما استخدام قفازات في جميع الخطوات من البروتوكول. دراسة والنظر في تعليمات السلامة لكل المواد الكيميائية المستخدمة. على وجه الخصوص، أن نضع في اعتبارنا أن زايلول هو ضار ويمكن ان تخترق قفازات والميثانول السامة. لجميع الأدوات المستخدمة، يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم وفقا لذلك.

1. إزالة آخر ريبونوكلياز من الأواني الزجاجية ومعدات أخرى

1. قبل استخدامها، والتفاف أي الأواني الزجاجية في رقائق الألومنيوم قبل الخبز ل~ 8 ساعة على حرارة 180 درجة مئوية لضمان ريبونوكلياز عالية الجودة مجانا.
2. علاج أي الأسطح المعدنية (على سبيل المثال، زوج من ملاقط)، وكذلك العمل على مقاعد البدلاء ولوحة التدفئة مع محلول تطهير ريبونوكلياز المناسب. بعد ذلك، وغسل الأسطح بالماء خالية من ريبونوكلياز لإزالة الحل إزالة التلوث. وفي وقت لاحق، وتنظيف الأسطح مع مزيد من ETOH 70٪.
3. استخدام كل بلاسالمواد الاستهلاكية التشنج (على سبيل المثال، وأنابيب) العلامة التجارية الجديدة من دون أي معالجة مسبقة. إذا كان متوفرا، استخدام المواد الاستهلاكية البلاستيكية التي هي معتمدة إلى أن ريبونوكلياز مجانا.

2. الأنسجة التثبيت

1. إعداد 10 مل من تثبيتي المزارعين (3: 1؛ ت / ت الإيثانول: حامض الخليك) في أنبوب 15 مل الطازجة على الجليد. (دائما إعداد تثبيتي المزارع الطازج قبل الاستخدام). وكبديل لذلك، والإيثانول غير يشابك مثبت: حامض الخليك (5: 1؛ ت / ت) يمكن استخدامها ^18.
2. استخدام زوج جيد من ملاقط لجمع البراعم في هذه المرحلة التنموية التي تهم. غمر فورا البراعم في تثبيتي الجليد الباردة. استخدام 10 مل من تثبيتي للتثبيت من ~ 20 براعم الزهور أو من نبات الأرابيدوبسيس أو Boechera ملاحظة: عند استخدام الأنواع النباتية مع الزهور الكبيرة فمن المستحسن أن تشريح الزهور بشفرة حلاقة لتوليد أجزاء أصغر قبل التثبيت.
   1. من أجل الحصول على نابتة عرسية ناضجة، تؤدي إلى إضعاف و2-3 أكبر براعم زهرة inflorescence 2 أيام قبل الحصاد.
3. ملء الجزء السفلي من exsiccator مع الثلج. فتح الأنابيب التي تحتوي على عينات، على سبيل المثال، والزهور، ووضعها على الجليد، إما عن طريق وضعها مباشرة في الجليد في هذه الطريقة أنها لا يمكن أن تقع على أو باستخدام حامل المناسب. فراغ التسلل لمدة 15 دقيقة قبل إطلاقها من فراغ.
   1. تكرار تسلل فراغ مرة واحدة لمدة 15 دقيقة.
4. الافراج عن فراغ وتخزينها بين عشية وضحاها (~ 12 ساعة) على الجليد. تغطية دلو الثلج مع غطاء أو رقائق الألومنيوم وتخزين دلو في غرفة C 4 درجات أو الثلاجة من أجل منع الجليد من الذوبان. ملاحظة: إطالة الوقت التثبيت غير مستحسن.

3. الأنسجة التضمين، رقيقة باجتزاء، وتصاعد على الشرائح للام

1. الأنسجة التضمين.
   1. تبادل تثبيتي إلى 70٪ من الإيثانول أعدت مع الإيثانول النقي وريبونوكلياز المياه مجانا. ترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة. بدء embedding من العينات في نفس اليوم. في القضية رقم آلة معالجة الأنسجة متاح، انتقل إلى تضمين اليدوي كما هو موضح في أماكن أخرى ^9،11 وتابع الخطوة 3.1.11.
   2. نقل بلطف عينات لأشرطة الأنسجة تضمين مع زوج من ملاقط. بحزم إغلاق أشرطة. خطوة حاسمة: تجنب تجفيف حتى الجزئي للعينة خلال هذه الخطوة. تجنب الضغط من عينات مع ملاقط.
      ملاحظة: لتسمية أشرطة يجب استخدام قلم رصاص، من الناحية المثالية عن طريق الكتابة على سطح مائل للكاسيت.
   3. تخزين كاسيت تضمين محملة براعم الزهور أو في الايثانول 70٪ حتى يتم نقل جميع المواد لأشرطة وآلة تضمين يمكن تحميل. لهذا الغرض، واستخدام حوض الزجاج تلطيخ مليئة الايثانول 70٪.
   4. إزالة سلة من المعالج الأنسجة من معوجة الجهاز ونقل أشرطة التضمين إلى سلة مع أسطح مائلة تواجه أعلى وفي نفس الاتجاه. CRIالخطوة TICAL: تنفيذ ذلك بسرعة لمنع أي جفاف الأنسجة. إذا تجهيز العديد من أشرطة التضمين في آن واحد، ضع سلة إلى ريبونوكلياز حاوية حرة المناسبة مليئة الايثانول 70٪ قبل تحميل العينات.
   5. وضع غطاء على السلة ووضع سلة العودة الى معوجة. إغلاق معوجة.
      ملاحظة: المعالج الأنسجة يجفف تلقائيا العينات، تغير المذيب إلى زايلول، ويفعل تسلل مع شمع البارافين ذاب. عادة، يتم ذلك بين عشية وضحاها.
   6. بدء تشغيل البرنامج من المعالج الأنسجة. الإعدادات القياسية الموصى بها هي 1 ساعة 70٪ ETOH، ثلاث مرات 1 ساعة 90٪ ETOH، ثلاث مرات 1 ساعة 100٪ ETOH، مرتين 1 ساعة 100٪ زايلول، مرة واحدة 1 ساعة 15 دقيقة 100٪ زايلول في درجة حرارة الغرفة، تليها تسلل مع شمع البارافين مرتين لمدة 1 ساعة ومرة واحدة لمدة 3 ساعة على 56 درجة مئوية ^(11).
      ملاحظة: للتأكد من أن محطة حجب جاهزة مع الشمع ذاب، تبديل الجهاز على عدة ساعات قبل بداية أواستخدام وظيفة موقت لتحديد وقت انطلاق تقريبي.
      ملاحظة: في حالة الأنسجة لا يمكن معالجة بعد ذلك على الفور، مرات حضانة أطول في شمع البارافين في 56 درجة مئوية والممكن بدلا من ساعة 3 عند 56 درجة مئوية. الرجوع إلى دليل المستخدم من الصك. عادة، فإن الأشرطة مع الأنسجة تبقى تلقائيا في ذاب الشمع حتى تتم الموافقة على "معوجة فارغة" القيادة. إذا لم يتم ذاب الشمع عند بدء تشغيل معالج الأنسجة، ويتم تعبئة معوجة مع الايثانول 70٪ ويبقى البرنامج على عقد حتى على استعداد للبدء.
   7. إفراغ معوجة ونقل على الفور العينات إلى حمام شمع البارافين عند 56 درجة مئوية في محطة حظر. إزالة الغطاء من السلة وتغطية حمام البارافين من محطة حجب مع غطائه.
   8. يسخن كومة العديد من صواني موازنة جديدة على سطح محطة الحجب إلى 56 درجة مئوية كما أن هناك أشرطة في السلة.
      ملاحظة: إن علامة دائمة مقاومة للالإيثانول يمكن استخدامهاد لتسمية الجزء السفلي من علب موازنة. لا ينصح علامات دائمة مقاومة للالأسيتون.
   9. باستخدام محطة الحجب، وملء علبة موازنة بلاستيكية جديدة قبل تحسنت مع شمع البارافين ذاب عند 56 درجة مئوية. رفع غطاء للحمام البارافين، والتقاط كاسيت واحد فقط في وقت واحد ونقل عينات من أشرطة للشمع البرافين السائل عند 56 درجة مئوية في علبة التوازن باستخدام زوج من ملاقط.
      خطوة حاسمة: تجنب أي تصلب شمع المحيطة العينة أثناء التعامل مع الكاسيت من خلال العمل بسرعة.
      1. ضع كل العينات وفقا لاحتياجات باستخدام إبرة التحضير قبل تصلب الشمع. عادة، يتم ترتيب العديد من الزهور في علبة موازنة متباعدة بشكل فردي حوالي 1 سم في كل اتجاه.
      2. كرر الخطوة 3.1.9 حتى يتم نقل جميع العينات.
   10. وضع سلة العودة إلى المعالج الأنسجة وتنظيف معوجة باستخدام البرنامج المناسب (يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم).
   11. إيقاف معالج الأنسجة ومحطة حظر. تابع الخطوة 3.1.13.
   12. في حال لم آلة تسلل الأنسجة وليس محطة التضمين المتاحة، واستخدام فرن تسخين لإذابة شمع البارافين عند 56 درجة مئوية. على مقاعد البدلاء، وملء الشمع ذاب في صواني موازنة البلاستيكية، ونقل العينات إلى الشمع، واستخدام الإبر تمهيدا لوضع العينات.
   13. السماح للشمع البارافين لتتصلب في درجة حرارة الغرفة ل~ 1-3 ساعة قبل تخزين العينات في 4 درجات مئوية. ويمكن بعد ذلك عينات سيتم تجهيزها حديثا أو تخزينها لمدة تصل إلى عدة أشهر.
2. إعداد أقسام وشرائح رقيقة للام.
   1. على طاولة ضوء ينير كتلة الشمع من أسفل، وإزالة شمع البارافين مع عينات من الصواني البلاستيكية المحيطة بها. تشريح خارج كتلة الشمع التربيعية التي تحتوي على الأنسجة، وعلى سبيل المثال، برعم أو زهرة، وذلك باستخدام ريبونوكلياز الحلاقة المجانية شفرة. لتحقيق هذا الهدف، ودائما توجيه عينات نحو الجزء العلوي من كتلة الشمع (انظر أيضا الشكل 1).
      1. إعداد كتل الشمع من جميع العينات التي ينبغي استخدامها للام في وقت واحد.
   2. جبل الكتل لمعالجة تضمين أشرطة مليئة شمع البارافين تصلب: تذوب قطعة صغيرة أو قطرة من شمع البارافين على طرف ملعقة المناسبة باستخدام مصباح الإيثانول واستخدام الشمع الساخن لإصلاح كتلة على الدعم (مع الأنسجة جزءا لا يتجزأ من في القمة).
      1. السماح للشمع لتتصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية.
   3. إزالة الشمع فائض المحيطة عينة بشفرة حلاقة على الطاولة الخفيفة. تأكد للحفاظ على سطح مربع مع ​​حواف متوازية (انظر الشكل 1).
   4. تعيين لوحة التدفئة إلى 42 درجة مئوية.
   5. جبل بأمان العينات إلى مبضع للفحص المجهري وإعداد 6-10 ميكرون أبواب سميكة. الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة لاستخدام مبضع للفحص المجهري. ملاحظة: في حين أقسام أرق وغالبا ما تعطي قرار الهيكلي أفضل، كمية أكبر من الحمض النووي الريبي من higheويمكن الحصول على جودة ص مع أقسام سمكا. لخلايا Boechera تنضج نابتة عرسية نستخدم 7 ميكرون كما الافتراضي. تتحرك ببطء مع العينات على السكين مشراح غالبا ما يؤدي إلى أفضل الأنسجة.
   6. نقل دائما شرائط البارافين بطول حوالي 10-15 سم في صندوق من البلاستيك مع الكرتون الأسود في الأسفل قبل وضعهم في الشرائح لام.
   7. إذا كان ذلك ممكنا، قبل تحديد أجزاء من شرائط البارافين تحتوي على الخلوي أو أنسجة أنواع من الفائدة، على سبيل المثال، البويضات، تحت النطاق تشريح وتجاهل بقية.
3. إعداد الشرائح للام.
   1. ضع المبلغ المطلوب من الشرائح مؤطرة المعدنية (عادة 5-10) مع سطح مستو على رأس على لوحة التدفئة.
   2. الماصة ~ 1-2 مل من ريبونوكلياز المياه مجانا على جزء من البلاستيك من الشريحة. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع شرائط البارافين في قطع قصيرة من حوالي 4-5 سم طويلة بما يكفي لتغطي النوافذ البلاستيكية. Uحد ذاتها زوج من ملاقط وإبرة تمهيدا لوضع مثالي شرائط البارافين موازية لبعضها البعض على نوافذ من البلاستيك الشرائح. رفع بعناية الشريحة في نهاية واحدة لإزالة المياه ووضع الشرائح الظهر.
      1. بدلا من ذلك، وضع لوحة التدفئة تحت غطاء الكيميائية. تطبيق كمية صغيرة من الميثانول إلى جزء من البلاستيك من الشريحة فقط كافية لتبلل السطح (وهذا يمكن أن يؤدي إلى تجعد طفيف للشرائح). وضع شرائط البارافين على الشرائح.
         ملاحظة: لأسباب التسمم، وتجنب استخدام الميثانول إن أمكن. ومع ذلك، فإن استخدام الميثانول في هذه الخطوة لا تحسين نوعية الحمض النووي الريبي في حالة نوعية من قبل المتزايدة على المياه التي تحققت ليست كافية. ومن الجدير اختبار هذه البدائل في بداية مشروع جديد، حيث أن الحمض النووي الريبي الجودة تحقق يختلف مع نوع من الخلايا والأنواع قيد التحقيق.
   3. تجفيف الشرائح بين عشية وضحاها على لوحة التدفئة في 42 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ~. تغطية لوحة التدفئة معغطاء البلاستيك الذي لا يمس الشرائح. تأكد من أن غطاء من البلاستيك لا يمنع تبادل الهواء. لهذا الهدف غطاء يمكن وضعها على علب الماصة أو ما شابه ذلك لرفعه.
      1. بدلا من ذلك، والحد من وقت التجفيف لمدة لا تقل عن ساعتين أو حتى تظهر الأنسجة جافة تماما. الحد من الوقت تشريح لجمع من قد يحسن نوعية الحمض النووي الريبي.
   4. تحت غطاء الكيميائية، وإزالة الشمع الشرائح 2 مرات لمدة 10 دقيقة في زايلول باستخدام حاملي الشرائح المناسبة. تأكد من أن يغرق بالكامل جزء من البلاستيك من كل شريحة فقط ولكن السماح بإزالة الشريحة عن طريق لمس نهاية أوسع من الإطار المعدني التي يتم الاحتفاظ بها جافة.
   5. السماح للشرائح لتجف لمدة 10 دقيقة ~ تحت غطاء الكيميائية قبل لام.
      ملاحظة: الشرائح يتم معالجتها فورا يمكن وضعها مرة أخرى على لوحة التدفئة في 42 درجة مئوية مع الأنسجة التي تواجه تصل لمدة تصل إلى عدة ساعات. هذا سيمنع أي الرطوبة من المساومة على جودة RNA حتى مزيد من المعالجة.

4. تسليخ مجهري بمساعدة الليزر (لام)

ملاحظة: الإجراء للام تختلف مع الأداة المستخدمة. يتم تكييفها بعض التفاصيل من هذا البروتوكول إلى أداة محددة والتكنولوجيا لجمع العينات على استخدام صنع غطاء من قوات كهرباء. وبالإضافة إلى ذلك، قد تختلف التفاصيل حتى بين الإصدارات المختلفة من البرنامج. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة الصانعة وكتيبات المستخدم للحصول على وصف مفصل وتعليمات محددة بشأن الأدوات والبرمجيات.

1. التبديل على الأجهزة للام (الكمبيوتر، المجهر، مربع عنصر التحكم ليزر).
2. بدء تشغيل البرنامج توجيه المجهر والليزر.
3. التبديل على الليزر عن طريق الضغط على زر المقابلة على السيطرة على المربع.
4. وضع سقف (0.5 مل، دون موزع موجات الصوت بالتساوي) في حامل الغطاء ووضعه في الصك.
5. دعم الشريحة لام مع شريحة زجاجية للفحص المجهري. تأكد من أن سطح مستو من الشريحة معالأنسجة المرفقة تواجه شريحة زجاجية.
6. ضع الشريحة في الصك مع شريحة زجاجية تحت.
7. حدد الهدف 4X. في البرنامج، وتحديد لتحريك الحد الأقصى للموقف "حتى"، والشروع في إجراء الفحص الشريحة.
8. بحث عن طريق الشريحة وتحديد هياكل الفائدة. تحديد وحفظ مواقعهم على الشريحة لتكون قادرة على نقل مرة أخرى إلى الموضع الدقيق للخطوة القطع.
9. تحديد الهدف المناسب (على سبيل المثال 40X أو 60X).
10. إذا لزم الأمر، وضبط سرعة الليزر، والتركيز، وقوة الليزر، وكذلك معايرة حركة مرحلة بالرجوع إلى دليل المستخدم من الصك. مرة واحدة يتم تعيين حساب يصل للأنسجة معينة من الفائدة، ويمكن إعادة استخدامها الإعدادات.
11. التحقق من موقف ليزر برصاصة واحدة عن طريق الضغط على زر "طلقة ليزر" للبرنامج، من الناحية المثالية في جزء من الغشاء دون الأنسجة.
    1. إذا لزم الأمر، معايرة موقف الليزر باتباع عشرتعليمات الإلكترونية المصنعة للصك.
12. تحقق من معايرة الهدف عن طريق تحريك هيكل واضحا للجميع الزوايا الأربع من نافذة البرنامج على الشاشة، والحفاظ على زر الفأرة الأيمن الضغط عليه. تأكد من أن الموقف من ناحية فيما يتعلق هيكل واضح هو نفسه في جميع الزوايا الأربع. إلا معايرة الأهداف التالية دليل البرامج.
13. مع سقف في موقف "أسفل"، استخدام أداة "اليد القلم 'للاحتفال حدود نوع من الخلايا أو الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال، خلية البويضة. تشريح الخلية في المصالح مع ليزر عن طريق الضغط على 'قطع'. ملاحظة: في كثير من الأحيان، باجتزاء احتياجات أن يتكرر إذا كانت الحدود حول الخلية لم يكن تشريح تماما في آن واحد. في هذه الحالة، فمن المستحسن لوضع برنامج للقيام اثنين من يكرر القسم كمعيار تلقائيا.
14. رفع الغطاء والانتقال إلى موقف حفظها المقبل مع هيكل من الفائدة. كرر الخطوة 4.13من إجراء تشريح الأقسام الخلية التالية حتى يتم جمع كل خلايا الفائدة من شريحة واحدة. تأكد من وضع الغطاء في هذه الطريقة أن القسم الجديد العصي لموقف فارغة على الغطاء.
    ملاحظة: من المستحسن لعزل أكبر قطعة من الأنسجة (على سبيل المثال، أجزاء من الزهور كلها أو أجزاء منها) من كل شريحة بعد عزل أقسام خلية واحدة على سقف جديد. هذه يمكن استخدامها لمراقبة الجودة الحمض النووي الريبي.
15. إزالة الشريحة وتواصل مع الشريحة التالية بتكرار الخطوات 4،4-4،9 و4،13-4،14.
16. وقد تم عزل كرر الخطوة 4.15 والخطوات ذات الصلة الى أن أنواع الخلايا من الاهتمام من كافة الشرائح. ملاحظة: لا ينصح لموسم الحصاد لمدة أطول من ~ 4-5 ساعة على نفس الغطاء.
17. تفقد البصر سطح الغطاء بعد LAM استبعاد التلوث غير محددة من العينة. في حين أن الأنسجة غير تشريح محمية مع احباط، ويمكن أن الغبار عصا على السطح بسبب التصاق كهرباء.
    1. تس بصريا تفقد كأب، وإزالة الشريحة من الصك. وضع حامل غطاء في موقف 'أسفل' وافحص السطح مع الهدف 4X.
    2. في حالة قطع صغيرة من الغبار مرئية، إزالتها مع صغيرة (2 ميكرولتر) ماصة. بدلا من ذلك، جبل الشريحة مرة أخرى على الصك، ضع الغطاء على جزء خالية من الشريحة (لا الأنسجة)، وتدمر تماما من التلوث باستخدام الليزر.
18. قبعات وثيقة وتجميد الأجزاء الجافة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. إذا لزم الأمر، والعينات ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى عدة أسابيع. ومع ذلك، وانطلاقا بسرعة في هذه الخطوة ينصح.

5. عزل الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة

ملاحظة: RNA يمكن عزلها بأي طريقة مناسبة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي. في هذا البروتوكول وصفت استخدام طقم RNA العزلة المحددة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.

1. استخدام أنابيب مع العينة المرفقة لغطاء إما مباشرة أو بعد إزالة من -80 درجة مئوية.
   1. فتح الأنابيب والماصة بعناية 11 ميكرولتر من استخراج العازلة على جدار كل أنبوب باستخدام نصائح فلتر. تغيير نصائح بين العينات.
   2. إغلاق الغطاء ويهز استخراج العازلة وصولا الى الحد الأقصى من الأنبوب.
   3. وضع أنابيب مع غطاء أسفل في فرن مسخن التدفئة إلى 42 درجة مئوية. احتضان لمدة 30 دقيقة بعد تعليمات الشركة الصانعة.
2. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد عمود وجمع استخراج في الجزء السفلي من الأنابيب.
   1. إذا كانت المادة من الغطاء أكثر من واحد يجب أن تكون مجتمعة في عينة واحدة، والمضي قدما بخطوات 5.1.1 - 5.1.2 بشكل فردي لكل أنبوب / سقف.
   2. بعد ذلك، تجميع مقتطفات لعينة واحدة في أنبوب واحد وقياس كمية استخراج المجمعة مع ماصة قبل إضافة مبلغ مساو من ETOH (انظر تعليمات الشركة الصانعة).
   3. تأكد من أن كمية إتوأضاف OH قبل تحميل العمود يساوي حجم استخراج المجمعة.
   4. بعد هطول الأمطار RNA مع ETOH، والمضي قدما بسرعة في التحميل من الأعمدة التالية تعليمات الشركة الصانعة. مواصلة بروتوكول مع خطوة الطرد المركزي 100 x ج.
   5. بعد أن تم تمرير محتويات كل أنبوب جمع من خلال العمود، نفذ خطوة الطرد المركزي 16000 x ج لمدة 30 ثانية لإزالة إرشادات الشركة المصنعة التدفق من خلال التالي ل.
   6. تواصل مع استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
   7. بعد تحميل وشطف العازلة إلى العمود السماح العمود لاحتضان لمدة 1 دقيقة. الاستمرار في تحميل هذه الانابيب بداخل الطرد المركزي اتباع التعليمات في تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: خطوة الطرد المركزي إضافية لمدة 1 دقيقة في 100 x ج قبل شطف كما هو مشار إليه في البروتوكول يمكن أن تزيد من كفاءة شطف.
3. استخراج الحمض النووي الريبي من تابعسيادة القانون والأمن (أقسام الأنسجة أكبر) لمراقبة الجودة RNA الخطوات التالية 5.1 إلى 5.2.7 من هذا البروتوكول.
4. لRNA تحميل مراقبة الجودة 1 ميكرولتر الحمض النووي الريبي مجموع مخفف من كل عينة السيطرة على Bioanalyzer باستخدام الحمض النووي الريبي بيكو رقاقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أن تستخدم لتضخيم الخطي والتحليل Transcriptome على استخدام المجهرية أو RNA تسلسل ^{7،11،13،14.} من الناحية المثالية، ينبغي أن يذكر في مراقبة الجودة والنزاهة عدد RNA (رين) من 7. ما لا يقل عن عدد من الموردين توفر مجموعات مناسبة لالتضخيم، وهناك أمثلة مناسبة في ^9.

النتائج

تتم تحضير عينة ولام في خطوات متتالية

وثمة حاجة إلى عدد من الخطوات المتتالية للتحضير الحمض النووي الريبي لتحليل النسخي من أنواع الخلايا التي اختارها لام (الشكل 1). ويبدأ هذا ال...

Discussion

بروتوكول غير مناسبة للخلية مختلفة وأنواع الأنسجة

لام جنبا إلى جنب مع Transcriptome على التحليلات التي المجهرية أو RNA تسلسل هو أداة قيمة لاكتساب نظرة ثاقبة لأنماط معينة من النشاط الجيني تنظيم العمليات التنموية أو الفسيولوجية <...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	1,009,861,000	absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Ambion Nuclease free water	life technologies	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	tissue processor
black cardboard			can be purchased in special paper shops
DNA- and RNAse-free Frame Slides	Micro Dissect GmbH		1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
ethanol lamp
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
filter tips 10 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 1,000 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 20 µl	Axon Lab AG	AL60020	can be replaced by similar tips
filter tips 200 µl	Axon Lab AG	AL60200	can be replaced by similar tips
forceps precision	VWE	232-1221
glass slide holder	Huber & Co.AG	10.0540.01	Färbekästen nach Hellendahl
glass staining trough	Huber & Co.AG	10.0570.01	Färbekasten
Heated Paraffin Embedding Module Leica	Leica	Leica EG 1150 H	blocking station, similar devises are suitable
Heating and Drying Table	Medax	15501	other models and/or suppliers are suitable
ice bucket	VWR ice bucket with lid	10146-184	similar buckets equally suitable
light table	UVP An Analytical Jena Company	TW-26	white light transluminator
microscope slide	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
microtome blade	Thermo Scientific	FEAHS35	S35 microtome blade disposable
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml	life technologies	AM12475
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	for histology
PicoPure RNA Isolation Kit	life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
plastic balancing trays	Semadeni AG	2513
plastic box	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
plastic lid for heating plate			homemade
preparation needle	VWR	631-7159
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
RNAse free microfuge tubes	life technologies	AM12400
RNAse ZAP Decontamination Solution	life technologies	AM9780
Semi-automated Rotary Microtome	Leica	RM2245	similar devices are equally suitable
Tissue Loc Histo Screen Cassettes	Thermo Scientific	C-1000_AQ	similar cassettes of other suppliers are suitable
Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xylol (Isomere) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
process embedding cassettes	Leica	14039440000	Leica Jet Cassette I without lid
Universal Oven	Memmert	UF55	other models and/or suppliers are suitable