Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Özet

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Özet

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Giriş

Doku seviyesinde yapılan transkripsiyon çalışmalarda, son derece özel ama nadir hücre tiplerinin transcriptomes genellikle daha bol çevreleyen hücreler tarafından maskelenir. Bu son derece özel hücre tipleri için bir örnek, bitkilerde dişi üreme soy (tohum çizgisi) hücreleri bulunmaktadır. Kadın germ çiçek ^1,2 dişi organ içinde, gelişmekte olan Yumurtacığa içinde tohum öncülerini belirtildi. megaspor anne hücre (MMC) kadın germline ilk hücresidir. Bu düşük megasporların bir tetrad oluşturulması için mayoz maruz kalır. Bir Sinsityum içinde, yani Tipik olarak, bu megasporların sadece biri hayatta ve sitokinez olmadan mitotik böler. Üç zıtlar iki synergid hücreleri, yumurta ve merkezi hücre: Bu mitoz tipik olarak dört hücre tipleri oluşur olgun gametofit oluşturmak üzere Hücreselleştirmeden tarafından takip edilmektedir. Yumurta ve merkezi hücreler dou sırasında iki sperm hücreleri tarafından döllenir olsun dişi gametlerin vardırble gübreleme gelişmekte tohum ^1,2 embriyo ve endosperm yol vermek. 80 tohumlar yakından ilgili cinsi Boechera içinde çiçek başına geliştirmek - yaklaşık 50 iken cinsel model sistem Arabidopsis thaliana olarak, sadece ~ 50 tohum çiçek başına gelişir. Bu nedenle, kadın germ böyle hücre özellikleri ve farklılaşma gibi gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model yapma, sadece birkaç derece uzmanlaşmış hücre tipleri oluşur.

Ayrıca, bitki üreme yöneten gen düzenleyici süreçlerine anlayışlar uygulamalı bir değer olabilir. Bitkilerde, tohumlar (Apomiksisin) aracılığıyla hem cinsel ve eşeysiz üreme oluşabilir. eşeyli üreme popülasyondaki genetik çeşitliliği oluşturur iken, anne bitki genetik olarak özdeş olan klonal yavrular oluşmasına yol açar apomiksis. Bu nedenle, apomiksis bile karmaşık anne genotipler can, tarım ve tohum üretimi uygulamaları için büyük bir potansiyele sahiptirbirkaç kuşak ^3,4,5 üzerinde değişmeden muhafaza edilmesi. Apomiksis doğal olarak herhangi bir önemli bitki türlerinde oluşmaz, çünkü ürünlerde Apomiksisin mühendislik büyük ilgi ^3,4,5 taşımaktadır. Ancak, bu uzun vadeli bir hedef Apomiksisin altta yatan genetik ve moleküler temeli yeterli detayda ⁶ anlaşılır değildir, çünkü elde etmek zordur.

Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM) ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanarak apomiktik üreme, hücre tipine spesifik transkripsiyonel profilleme düzenleyen transkripsiyon bazda içgörüler kazanmak için çok güçlü bir yaklaşım ^7,8 temsil etmektedir. LAM ilk hayvan ve biyomedikal araştırmalar için kurulmuştur. Son birkaç yıl içinde LAM bitki biyolojisi ^6,9,10 uygulanmıştır. Tek tek hücre ve doku tiplerinin profil sağlayan diğer yöntemlerin aksine, LAM markör hatları ^6,9,10 üretilmesini gerektirmez. Bu nedenle, uygulama olabilirönceden moleküler bilgisi olmadan herhangi bir hücre veya doku tipine yalan. LAM diğer bir avantajı, hücre konumu ve / veya yapısal özelliklerine göre, kuru bölümlerde kabul edilebilir gibi sürece, herhangi bir hücre tipinde uygulanabilir olmasıdır. LAM işlem esnasında transkripsiyonel profili değişiklikleri önler sabit dokular kullanılan ek bir avantaja sahiptir.

Çevrede, örneğin, çiçek dokusu dokusu, önceden parafın balmumu içine yerleştirilmeden olmayan bir çapraz bağlama sabitleyici sabitlenmiştir. Parafin gömme kurulan protokolleri ^9,11 aşağıdaki elle yapılabilir. Ancak, balmumu ile dehidratasyon ve infiltrasyon için otomatik doku işlemci kullanımı genellikle RNA kalitesi ve doku morfolojisi korunması açısından yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır. Reçine dokuların gömme alternatif strateji de başarılı bir LAM ⁸ hücre tip spesifik analizler için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bir autom kullanımıBirçok örnekleri kez zamanında eller en az gerektiren işlenebilir olarak mum gömmek için ated doku işlemci, çok zaman etkilidir. RNA kalitesi, tipik olarak önemli bir kayıp tespit ve gömme sırasında ortaya birlikte, mikrotom ile kesitlerin hazırlanması ve özellikle LAM kullanılan frameslides montaj RNA kalitesinin korunması için kritik bir aşama olarak kalır. Bu, daha önce not edilmiştir ve bir bant transfer sisteminin kullanımı, bu aşamada ^12, daha iyi bir RNA kalitesi elde etmek tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu preparatların hazırlanması sırasında ilave bir zaman alan bir adım ekler ve özel ekipman gerektirmektedir. Aşağıda açıklanan optimize edilmiş protokol tekrarlanabilir GeneCHIPs ve Yeni Nesil Dizi (NGS) ^7,11,13,14 yaklaşımları ile transkripsiyonel profilleme için yeterli kalitede RNA üretir. Buna ek olarak, kullanılan lazer mikrodiseksiyon mikroskobu ile izole edilmiş, hücre tipleri, yüksek saflıkta yatağından olaninely ^7,11,13,14 üretti.

Cins Boechera apomiktik üreme kilit adımları incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Boechera, farklı cinsel ve apomiktik katılımların çeşitli tanımlanmıştır ve Karşılaştırmalı için kullanılabilir ^15,16,17 analiz eder. Cinsel Arabidopsis ve apomiktik Boechera Kadın germline hücrelerin hücre tipine spesifik transcriptomes bir karşılaştırma olarak, bu şekilde ⁷ apomiksis yöneten düzenleyici süreçlerin yeni yönlerini tanımlayan farklı şekilde ifade edilen genleri ve yolların tespit edilmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma hücre tipine spesifik transkripsiyonel Lam uygunluğunu küçük ve nadir hücre tiplerinin analizi sunmaktadır. Daha önce bitki türlerinin çeşitli farklı hücre tiplerinin analizi için bu protokol kullanılır, ancak türlerin ve protokole dokuya özel modifikasyonları, bazı durumlarda gerekli olabilir var.

Protokol

Not: Bu protokol, doku hazırlanması, lazer yardımlı mikrodiseksiyon ve transkripsiyon profilleme için RNA çıkarma açıklanır. Her zaman protokol tüm adımları boyunca eldiven kullanın. Eğitim ve kullanılan her kimyasal için güvenlik talimatlarını dikkate alın. Xylol zararlıdır ve eldiven nüfuz edebilir ve bu metanol toksik olması, özellikle unutmayın. kullanılan tüm araçlar için, buna göre kullanıcı kılavuzlarına başvurun.

Züccaciye ve Diğer Ekipman gelen RNAse Faaliyet 1. Kaldırma

1. Kullanımdan önce önce, RNaz içermeyen kalitesini sağlamak için 180 ° C'de ~ 8 saat boyunca pişirme için alüminyum folyo ile bir cam sarın.
2. Herhangi bir metal yüzeyleri tedavi (örn cımbız çifti) yanı sıra çalışma tezgahı ve uygun bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile ısıtma plakası. Daha sonra, dekontaminasyon çözüm kaldırmak için RNAse içermeyen su ile yüzeyleri yıkayın. Daha sonra,% 70 EtOH ile daha yüzeyleri temizlemek.
3. Tüm plas kullantik sarf malzemeleri (örneğin, borular) yepyeni herhangi ön işleme tabi tutulmadan. Varsa, ücretsiz RNAse için sertifikalı plastik sarf malzemelerini kullanın.

2. Doku Fixation

1. çiftçi sabitleyici 10 ml hazırlama (3: 1; hac / hac etanol: asetik asit), buz üzerinde yeni bir 15 ml tüp içinde. (Kullanmadan önce her zaman taze Çiftçi fiksatif hazırlamak). Bir alternatif olarak, non-çapraz bağlama sabitleyici etanol: asetik asit (5: 1; hac / hac) ¹⁸ kullanılabilir.
2. ilgi gelişme aşamasında tomurcukları toplamak için cımbız ince bir çifti kullanın. Hemen buz gibi soğuk fiksatif tomurcukları daldırın. ~ Tespiti için Arabidopsis veya Boechera 20 tomurcukları veya çiçek sabitleştirici 10 ml kullanın Not:. Öncesinde tespitin daha küçük parçalar üretmek için bir jilet ile çiçek incelemek için tavsiye edilir büyük çiçekler ile bitki türlerini kullanırken.
   1. inflor 3 büyük çiçek tomurcukları - olgun gametofitleri elde etmek için, 2 emasculatehasattan önce 2 gün Escence.
3. buz ile bir kurutucu alt doldurun. Ya doğrudan onlar üzerinden düşmeyecek şekilde buz içine koyarak veya uygun bir tutucu kullanarak, örnekleri, örneğin, çiçek içeren tüpler açın ve buz koyun. Vakum vakum serbest bırakmak için önce 15 dakika boyunca sızmak.
   1. 15 dakika boyunca bir kez vakum süzmesi tekrarlayın.
4. buz üzerinde vakum ve mağaza gecede (~ 12 saat) bırakın. Bir kapak veya alüminyum folyo ile buz kovası Kapak ve çözülme buz önlemek için bir 4 ° C oda veya buzdolabında kova saklayın. Not: fiksasyon süresi uzatılması tavsiye edilmez.

3. Doku Gömme, İnce Kesit ve LAM için Slaytlar Montaj

1. Doku gömme.
   1. Saf etanol ve RNAse içermeyen su ile hazırlanmış,% 70 etanol ile fiksatif değiştirin. daha sonra işlenene kadar buz üzerinde örneklerin bırakın. embe başlatNumunelerin dding gün. Hiçbir doku işleme makineleri mevcuttur durumda, başka bir yerde ^9,11 açıklandığı gibi manuel gömme devam ve adım 3.1.11 ile devam edin.
   2. Yavaşça bir cımbız ile doku gömme kasetler örnekleri aktarın. Sıkıca kasetleri kapatın. KRİTİK ADIM: Bu kademe sırasında numunenin da kısmen kurumasını önlemek. cımbız ile numunelerin sıkmaktan kaçının.
      Not: ideal kaset eğimli yüzeyinde yazarak, bir kalem kullanılması gereken kasetleri etiketlemek için.
   3. Tüm malzemeler kasetleri aktarılır ve gömme makinesi yüklenebilir kadar% 70 etanol içinde tomurcuk veya çiçek yüklü gömme kaseti saklayın. Bu amaçla,% 70 etanol ile dolu cam boyama oluk kullanımı.
   4. Makinenin imbikten doku işlemci sepeti çıkarınız ve üst bakan eğimli yüzeyler ile ve aynı yönde sepete gömme kasetleri aktarın. CRIKortikal ADIM: dokuların herhangi kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde bu gerçekleştirin. aynı anda bir çok gömme kasetleri işleme durumunda, önceden örnekleri yükleme% 70 etanol ile dolu uygun bir RNazsız kaba sepeti yerleştirin.
   5. sepet kapağı koymak ve imbik geri sepet koyun. imbik kapatın.
      Not: Doku işlemci otomatik numune kurutur Ksilol için çözücü değiştirir ve erimiş parafin mumu ile sızma yapar. Tipik haliyle, bu gece boyunca yapılır.
   6. Doku işlemci programı başlatın. Tavsiye edilen standart ayarlar infiltrasyonu, ardından 1 saat% 70 EtOH, üç kez 1 saat% 90 EtOH, üç kez 1 saat% 100 EtOH, iki katı 1 saat% 100 Xylol, bir kez 1 saat, oda sıcaklığında 15 dakika% 100 ksiloldür iki kez 1 saat ve 56 ° C'de ¹¹ de 3 saat bir süre için, parafin mumu ile.
      Not: Engelleme istasyonu erimiş balmumu ile hazır olmasını sağlamak için, başlamadan önce birkaç saat makineyi açmak veyayaklaşık başlangıç ​​zamanı seçmek için zamanlayıcı işlevini kullanın.
      Not: durumda doku 56 ° C'de yerine 3 saat arasında 56 ° C'de, hemen ardından olası parafın balmumu uzun inkübasyon süreleri olan işlenemez. Cihazın kullanım kılavuzuna başvurun. "Boş imbik" komutu onaylanana kadar Tipik olarak, dokularla kasetleri otomatik olarak erimiş mum içinde kalır. Doku işlemci başlatırken balmumu erimiş değilse, imbik% 70 etanol ile doldurulur ve başlamak için hazır olana kadar programın beklemede kalır.
   7. imbikten boşaltın ve hemen bir engelleme istasyonunda 56 ° C'de parafin banyosu örnekleri aktarın. sepet kapağını kaldırın ve kapağı ile engelleme istasyonunun parafin banyosu kapsamaktadır.
   8. sepete kasetleri olduğu gibi bloke istasyonu yüzeyinde Kazık kadar taze dengeleme bölümleri 56 ° C'ye kadar ısıtıldı.
      Not: Bir etanol dayanıklı kalıcı marker kullanmak olabilird dengeleme tepsileri alt etiketlemek için. Aseton dayanıklı kalıcı belirteçler tavsiye edilmez.
   9. bloke istasyonu kullanılarak, 56 ° C'de eritilmiş parafin mumu ile önceden ısıtılmış taze plastik dengeleme tepsi doldurun. , Parafin banyosu kapağını kaldırın bir seferde sadece tek bir kaseti pick up ve bir cımbız kullanarak dengeleme tepside 56 ° C'de sıvı parafin balmumu kasetlerden örnekleri aktarın.
      KRİTİK ADIM: hızlı çalışarak kaseti işlerken örnek çevreleyen balmumu herhangi sertleşmesini kaçının.
      1. balmumu sertleşmeden önce bir hazırlık iğne kullanılarak ihtiyaçlarına göre tüm örnekleri yerleştirin. Tipik olarak, çok sayıda çiçek her bir yönde yaklaşık 1 cm aralıklı dengeleme tepsi şeklinde düzenlenmiştir.
      2. Tüm örnekler aktarılır kadar adımı tekrarlayın 3.1.9.
   10. geri doku işlemciye sepet koyun ve uygun bir program (kullanım kılavuzuna bakın) kullanarak imbik temizleyin.
   11. Doku işlemci ve engelleme istasyonu kapatın. Adım 3.1.13 ile devam edin.
   12. durumda, herhangi bir doku infiltrasyonu makinesi ve hiçbir gömme istasyonu mevcuttur, 56 ° C'de parafin eritmek için bir ısıtma fırını kullanımı. bankta, plastik dengeleme tepsiler içinde erimiş balmumu doldurmak balmumu örnekleri aktarmak, ve örnekleri konumlandırmak için hazırlık iğne kullanın.
   13. 4 ° C'de depolamadan önce numune 3 saat - parafin ~ 1, oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Numuneler, daha sonra taze işlenmiş ya da birkaç aya kadar saklanabilir.
2. LAM için ince kesit ve slaytlar hazırlanması.
   1. aşağıdan mum blok aydınlatan bir ışık Masanın üzerinde, çevredeki plastik tepsiler alınan numuneler ile parafin mumu kaldırın. , Doku içeren bir kare mum blok parçalara ayır örn., Bir RNAse ücretsiz jilet kullanarak bir tomurcuk veya çiçek. Bu amaçla, her zaman mum blok üst kısmına doğru örnekleri yönlendirmek (ayrıca bkz Şekil 1).
      1. Aynı anda LAM için kullanılması gereken tüm örneklerin mum blok hazırlayın.
   2. sertleştirilmiş parafin ile dolu kasetleri gömme işlemek için bloklar takın: Bir Etanol lamba kullanılarak uygun bir spatula ucunda küçük bir parça veya parafin mumu damlacık eritmek ve gömülü dokuları ile (destek bloğu düzeltmek için sıcak balmumu kullanın üstte).
      1. bal mumu, 4 ° C'de en az 20 dakika boyunca sertleşmeye izin verin.
   3. Işık masaya bir jilet ile örnek çevreleyen artı balmumu çıkarın. Paralel kenarları (Şekil 1) ile bir kare yüzey tutmak için emin olun.
   4. 42 ° C'ye kadar ısıtma plakası ayarlayın.
   5. Güvenle microtome örnekleri montaj ve 6 hazırlamak - 10 mikron kalınlığında kesitler. mikrotom kullanılarak için üreticinin talimatlarına bakınız. Not: ince kesitler genellikle daha iyi yapısal çözünürlük, highe RNA büyük miktarda verecektir ikenR kalitesi daha kalın bölümleri ile elde edilebilir. Boechera hücreleri gametofitleri olgun için biz varsayılan olarak 7 mikron kullanın. mikrotom bıçak üzerinde örnekleri ile oldukça yavaş hareket eden genellikle daha iyi histoloji ile sonuçlanır.
   6. LAM slaytlar onları yerleştirmeden önce alt kısmında siyah karton plastik bir kutu içine 15 cm - Her zaman yaklaşık 10 bir uzunlukta parafin kurdeleler aktarın.
   7. Eğer mümkünse, bir diseksiyon-kapsamında, örneğin faiz hücreye veya doku tipleri, ovüllerin içeren parafin şeritler parçaları önceden seçmek ve gerisini atın.
3. LAM için slaytlar hazırlanması.
   1. ısıtma plakası üzerinde üstüne düz bir yüzeye sahip - metal çerçeveli slaytlar gerekli miktarda (10 genellikle 5) yerleştirin.
   2. Pipet ~ 1 - sürgünün plastik parça üzerine RNazsız su 2 mi. plastik pencereler span yeterince uzun 5 cm - Bir jilet kullanarak, yaklaşık 4 kısa parçalara parafin kurdeleler kesti. UBir cımbız ve ideal parafin şeritler slaytlar plastik pencereler birbirine paralel yerleştirmek için bir hazırlık iğne se. Dikkatle suyu çıkarmak ve geri slaytlar yerleştirmek için bir ucunda slayt kaldırın.
      1. Seçenek olarak ise, kimyasal bir başlık altında ısıtma plakası yerleştirin. yüzeyinin nemlendirilmesi için yetecek sürgünün plastik kısmına küçük bir metanol hacmi halinde (bu slaytlar hafif dalgalı neden olur). slaytlarda parafin şeritler yerleştirin.
         Not: mümkünse toksisite nedeniyle, metanol kullanımını önlemek. Ancak, bu aşamada metanol kullanımı su monte edilmesi ile elde edilen kalite yetersiz olması durumunda, RNA kalitesini artırmak yapar. elde edilen RNA kalitesi soruşturma altında hücre tipi ve türler ile değişir gibi, yeni bir proje başlangıcında bu alternatifleri test faydalıdır.
   3. ~ 12 saat boyunca 42 ° C'de bir gece boyunca ısıtma plakası üzerinde slaytlar kurutun. ısıtma plakası Kapakslaytlar dokunmaz bir plastik kapak. plastik kapak hava değişimini önlemek olmadığından emin olun. Bu kapak amacı pipet kutuları veya benzeri üzerine yerleştirilebilir için kaldırılması gerekir.
      1. Seçenek olarak ise, iki saat en az ya da doku tamamen kuru görünene kadar kuruma süresini azaltır. koleksiyona dilimleme zaman azaltılması RNA kalitesini artırabilir.
   4. Bir kimyasal Kaputun altında, de-mum slaytlar uygun slayt tutucuları kullanarak ksilolde 10 dakika süreyle 2 kez. Tamamen kuru tutulur metal çerçeve geniş ucunu dokunarak slayt çıkarılmasını sağlamak için sadece değil, her slaytın plastik parçayı batığın emin olun.
   5. slaytlar LAM öncesinde kimyasal başlık altında ~ 10 dakika kurumasını bekleyin.
      Not: hemen işleme değil Slaytlar doku bir kaç saat kadar için yukarı bakacak şekilde 42 ° C'de geri ısıtma plakası üzerine yerleştirilebilir. Bu daha fazla işlem kadar RNA kalitesinden ödün gelen herhangi bir nem önleyecektir.

4. Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM)

Not: LAM için prosedür kullanılan alet ile değişecektir. Bu protokolün bazı detayları belirli bir alet ve elektrostatik kuvvetlerin bir kapak yapma kullanımı örnek toplamak teknolojiye uyarlanmıştır. Buna ek olarak, ayrıntıları bile yazılımın farklı sürümleri arasında değişebilir. ayrıntılı bir açıklama ve enstrüman ve yazılım özel talimatlar için üreticinin talimatlarına ve kullanıcı el kitapları başvurun.

1. LAM (bilgisayar, mikroskop, lazer kontrol kutusu) için cihazlar üzerinde geçin.
2. mikroskop ve lazer direksiyon programını başlatın.
3. kontrol kutusu üzerindeki ilgili düğmeye basarak lazer açın.
4. kapak tutucu içine (diffusor 0,5 ml) bir kap yerleştirin ve enstrüman konumlandırmak.
5. mikroskopi için bir cam slayt ile LAM slayt destekleyin. Emin olun sürgünün düz bir yüzeyeEkli doku cam slayt karşı karşıyadır.
6. altında cam slayt ile enstrüman slayt yerleştirin.
7. 4X Amaç seçin. Programda, "yukarı" pozisyona kapağı taşımak ve slayt tarama yapmaya devam seçin.
8. slayt yoluyla arama ve ilgi yapılarını belirlemek. Bulabilir ve kesme adımı için tam konumuna geri hareket edebilmek için slayt üzerinde konumlarını kaydedin.
9. Uygun hedefi (örneğin 40X veya 60X) seçin.
10. Gerekirse, lazer hızı, odak ve lazer gücünü ayarlamak ve aynı zamanda aracın kullanım kılavuzuna bakarak sahne hareketi kalibre edin. Bir hesap özel ilgi doku için ayarlandıktan sonra, ayarlar yeniden kullanılabilir.
11. ideal doku olmadan zarının bir parçası, programın "lazer atış" düğmesine basarak tek bir atış ile lazer konumunu doğrulayın.
    1. Gerekirse, inci izleyerek lazer pozisyonunu kalibreenstrüman e üreticinin talimatları.
12. basılı sağ fare düğmesini tutarak, monitörde yazılım penceresinin dört bir yanına bariz bir yapıya taşıyarak hedefi kalibrasyonunu doğrulayın. bariz yapısına göre elin pozisyonu dört köşesinden aynı olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yazılım kılavuzuna aşağıdaki amaçları kalibre.
13. 'Aşağı' konumunda kap, hücre tipi veya ilgi dokusu, örneğin, yumurta hücresinin sınırlarını işaretlemek için 'el kalem' aracını kullanın. 'Kes' tuşuna basarak lazer ile ilgi hücre parçalara ayır. Not: Genellikle, ihtiyaçlarını kesit tekrarlanması hücre etrafında sınır tamamen seferde disseke olmasaydı. Bu durumda, otomatik olarak bir standart olarak bölümün iki tekrarlar yapmak için yazılım ayarlanması önerilir.
14. Kapağı kaldırın ve ilgi yapısı ile bir sonraki kaydedilmiş konuma geçmek. Adımı tekrarlayın 4.13Bir slayttan ilgi tüm hücreleri toplanır kadar prosedürün bir sonraki hücre bölümleri incelemek için. Emin kapak yeni bölüm kap boş pozisyona yapışıyor bir şekilde konumlanmasına dikkat edin.
    Not: dokuların büyük parçaları izole edilmesi tavsiye edilir (örneğin, bütün çiçekler ya da parçalarının bölümleri) taze kap tek hücre bölümlerinin izolasyonu sonra her slayt. Bu RNA kalite kontrolü için de kullanılabilir.
15. slayt çıkarın ve adımları 4.4 tekrarlayarak sonraki slayta devam - 4.14 ile 4.9 ve 4.13.
16. tüm slaytlar ilgi hücre tipleri kadar adımı yineleyin 4.15 ve ilgili adımlar izole edilmiştir. Not: ~ 4 daha uzun süre hasat için tavsiye edilmez - Aynı kap 5 saat.
17. Görme numunenin spesifik olmayan kirlilikleri dışlamak için LAM sonra kapağı yüzeyini kontrol edin. olmayan disseke dokular folyo ile korunmaktadır iken, toz nedeniyle elektrostatik yapışma yüzeyine sopa olabilir.
    1. To görsel, kapağı kontrol cihazdan slayt kaldırmak. 'Aşağı' pozisyonunda kapak tutucu yerleştirin ve 4X amacı ile yüzeyi kontrol edin.
    2. toz küçük parçalar görebilir durumda, küçük bir (2 | il) pipet ile kaldırın. Alternatif olarak, geri enstrüman üzerinde slayt monte slayt (hiçbir dokuların) ücretsiz bir parçası kapağını yerleştirin ve tamamen lazer kullanarak kontaminasyonu yok.
18. Yakın kapaklar ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de kuru bölümler dondurma. Gerekirse, numuneler bir kaç haftaya kadar saklanabilir. Ancak, bu aşamada hızlı bir şekilde işlem yapılarak, tavsiye edilir.

5. RNA İzolasyonu ve Kalite Kontrol

Not: RNA'nın küçük miktarlarda uygun herhangi bir yöntem ile izole edilebilir. Bu protokolde RNA küçük miktarlarda tanımlanan bir RNA izolasyon kiti kullanımı tarif edilmektedir. üreticinin talimatlarına uyun.

1. bağlı numune ile tüpleri kullanınkap, ya doğrudan ya da -80 ° C ila çıkarıldıktan sonra.
   1. tüplerin açık ve dikkatli bir şekilde filtre ipuçlarını kullanarak her bir tüp çeperine ekstraksiyon tamponu 11 ul pipetleyin. örnekler arasındaki ipuçları değiştirin.
   2. Kapağı kapatın ve tüpün kapağı aşağı ekstraksiyon tamponu sallayın.
   3. 42 ° C'ye ısıtılmış bir ısıtma fırın içinde aşağı kap tüpleri yerleştirin. imalatçının talimatlarına uygun olarak 30 dakika boyunca inkübe edin.
2. Kolon hazırlanması için üreticinin yönergelerini izleyin ve tüplerin alt kısmında özü toplamak.
   1. tek tek her tüp / cap için 5.1.2 - Birden fazla kap malzeme bir örnek birleştirilebilir gerekiyorsa, adım 5.1.1 ile devam edin.
   2. (Üreticinin talimatlarına bakınız) sonra, tek bir tüp içinde, bir örnek için özleri havuzu ve EtOH eşdeğer miktarda ilave edilmeden önce, bir pipet ile toplanmış özü miktarını ölçün.
   3. Emin olun Et miktarıOH Yükleme işleminden sonra kolon toplanmış özü hacmine eşit önce ilave edildi.
   4. EtOH ile RNA yağış sonrasında, üreticinin talimatlarına aşağıdaki sütunlardan yükleme hızla devam edin. 100 xg santrifüj adımla protokol devam edin.
   5. Her bir toplama tüpünün içeriği kolonundan geçirildi sonra, akış oranı, aşağıdaki üreticinin talimatlarına kaldırmak için 30 saniye için 16,000 x g santrifüj adımı gerçekleştirmek.
   6. üreticinin talimatlarına uygun RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması ile devam ediniz.
   7. sütun elüsyon tamponu Yükleme işleminden sonra kolon, 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin. üreticinin talimatlarına talimatları izleyerek santrifüj tüpleri yüklenmeye devam. Not: elüsyondan önce, 100 xg'de 1 dakika boyunca Ek bir santrifüj işleminin elüsyon verimliliğini artırabilir protokolde belirtilen.
3. Çürük RNA Özüadımlar bu protokolün 5.2.7 5.1 aşağıdaki RNA kalite kontrolü için Rols (büyük doku bölümleri).
4. RNA kalite kontrolü yükü için 1 ul üreticinin talimatlarına aşağıdaki bir RNA Pico Chip kullanarak Bioanalyzer her bir kontrol numunesinin seyreltilmemiş toplam RNA.
   Not: ekstre RNA doğrusal amplifikasyon ve mikrodiziler veya RNA-DİZ ^7,11,13,14 kullanılarak transcriptome analizi için kullanılabilir. İdeal olarak, kalite kontrol tedarikçi bir dizi amplifikasyonu için uygun kitler sağlar en az 7 arasında bir RNA Bütünlük sayısı (RIN), uygun örnekler ^9'da verilmiştir göstermelidir.

Sonuçlar

Numune Hazırlama ve LAM Ardıl Adımlar yapılır

Birbirini takip eden bir dizi adım LAM (Şekil 1) tarafından seçilen hücre tiplerinden transkripsiyonel analiz için RNA'nın hazırlanması gerekmektedir. Bu RNA nüfus hasattan sonra değişmeden kalmasını sağlamak için çiçek ve acil tespitin hasat başlar. Doku, sarılır, bölümlere ayrılır ve slaytlar üzerine monte edili...

Tartışmalar

Protokol Farklı Hücre ve Doku tipleri için uygundur

Transcriptome ile kombine LAM mikroarrayler veya analizleri RNA-Seq gelişimsel ya da fizyolojik süreçleri ^7-11,13,14 düzenleyen gen aktivitesinin spesifik kalıpları içine anlayışlar kazanmak için değerli bir araçtır. Ancak, herhangi bir belirli hücre tipi için bu yöntemin uygunluğu, yapısal konular kritik olarak bağlıdır. Hücre açıkça görülebilir ve LAM için kullanılan kuru bölüm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	1,009,861,000	absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Ambion Nuclease free water	life technologies	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	tissue processor
black cardboard			can be purchased in special paper shops
DNA- and RNAse-free Frame Slides	Micro Dissect GmbH		1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
ethanol lamp
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
filter tips 10 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 1,000 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 20 µl	Axon Lab AG	AL60020	can be replaced by similar tips
filter tips 200 µl	Axon Lab AG	AL60200	can be replaced by similar tips
forceps precision	VWE	232-1221
glass slide holder	Huber & Co.AG	10.0540.01	Färbekästen nach Hellendahl
glass staining trough	Huber & Co.AG	10.0570.01	Färbekasten
Heated Paraffin Embedding Module Leica	Leica	Leica EG 1150 H	blocking station, similar devises are suitable
Heating and Drying Table	Medax	15501	other models and/or suppliers are suitable
ice bucket	VWR ice bucket with lid	10146-184	similar buckets equally suitable
light table	UVP An Analytical Jena Company	TW-26	white light transluminator
microscope slide	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
microtome blade	Thermo Scientific	FEAHS35	S35 microtome blade disposable
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml	life technologies	AM12475
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	for histology
PicoPure RNA Isolation Kit	life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
plastic balancing trays	Semadeni AG	2513
plastic box	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
plastic lid for heating plate			homemade
preparation needle	VWR	631-7159
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
RNAse free microfuge tubes	life technologies	AM12400
RNAse ZAP Decontamination Solution	life technologies	AM9780
Semi-automated Rotary Microtome	Leica	RM2245	similar devices are equally suitable
Tissue Loc Histo Screen Cassettes	Thermo Scientific	C-1000_AQ	similar cassettes of other suppliers are suitable
Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xylol (Isomere) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
process embedding cassettes	Leica	14039440000	Leica Jet Cassette I without lid
Universal Oven	Memmert	UF55	other models and/or suppliers are suitable