assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

Resumo

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Resumo

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Introdução

Em estudos de transcrição feito ao nível dos tecidos, os transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, mas raros são muitas vezes mascarados pelas células vizinhas mais abundantes. Um exemplo para tais tipos de células altamente especializadas são as células da linhagem reprodutor feminino (linha germinal) em plantas. A linha germinal feminina é especificada dentro de óvulos em desenvolvimento, os precursores de sementes no interior do gineceu do ^1,2 flor. O saco embrionário (MMC), é a primeira célula da linha germinativa feminina. Ele sofre meiose para formar uma tétrade de megásporos reduzidos. Tipicamente, apenas uma destas megásporos sobrevive e divide mitoticamente sem citocinese, ou seja, em um sincício. Estes são seguidos por mitoses celularização para formar o gametófito madura, que, tipicamente, consiste em quatro tipos de células: três antípodas, duas células synergid, o ovo, e a célula central. Os óvulos e centrais são os gametas femininos que são fecundados por dois espermatozóides durante doufertilização vel para dar origem ao embrião e do endosperma da semente em desenvolvimento ^1,2. No sistema modelo de Arabidopsis thaliana sexual, apenas ~ 50 sementes se desenvolvem por flor, enquanto cerca de 50-80 sementes se desenvolvem por flor no género intimamente relacionado Boechera. Assim, a linha germinativa feminina consiste de apenas alguns tipos de células altamente especializadas, tornando-a um excelente modelo para estudar processos de desenvolvimento, tais como a especificação e diferenciação celular.

Além disso, insights sobre os processos de regulação de genes que regulam a reprodução de plantas pode ser de valor aplicada. Nas plantas, tanto a reprodução sexuada e assexuada através de sementes (apomixia) pode ocorrer. Enquanto a reprodução sexual gera diversidade genética numa população, apomixia, conduz à formação de prole clonal que é geneticamente idênticas à planta mãe. Portanto, apomixia tem um grande potencial para aplicações na agricultura e produção de sementes, como genótipos maternos mesmo complexo podeser mantido inalterado ao longo de várias gerações ^3,4,5. Porque apomixia não ocorrem naturalmente em qualquer um dos principais espécies cultivadas, a engenharia de apomixia em culturas é de grande interesse ^3,4,5. No entanto, este objectivo a longo prazo é difícil de conseguir porque a base genética e molecular subjacente de apomixia não é entendida em detalhe suficiente ^6.

Para obter insights sobre a base de transcrição que regulam a reprodução apomítica, de tipo específico de células de perfil transcricional usando microdissection assistida por laser (LAM) e ao lado sequenciamento geração (NGS) representa uma abordagem muito poderosa ^7,8. LAM foi estabelecido pela primeira vez em animais e investigação biomédica. Nos últimos anos LAM também tem sido aplicada a biologia da planta ^6,9,10. Em contraste com outros métodos que permitem a criação de perfil de tipos de células e tecidos individuais, LAM não requer a geração de linhas marcadoras ^6,9,10. Portanto, ele pode ser appmentiu para qualquer tipo de célula ou tecido sem o conhecimento molecular antes. Outra vantagem da LAM é que ele pode ser aplicado a qualquer tipo de célula, desde que a célula pode ser reconhecido nas secções a seco com base na posição e / ou características estruturais. LAM tem a vantagem adicional de que os tecidos fixos são usados, o que impede que as alterações do perfil da transcrição durante o processamento.

O tecido de interesse, por exemplo, tecido floral, é fixado num fixador não reticulado antes da inclusão em parafina. Incorporação em cera de parafina pode ser feito manualmente, seguindo protocolos estabelecidos ^9,11. No entanto, a utilização de um processador automatizado de tecidos para a desidratação e infiltração com a cera resulta geralmente em maior reprodutibilidade em termos da conservação da qualidade do ARN e morfologia do tecido. A estratégia alternativa de incorporação de tecidos em resina também foi usada com sucesso para análises específicas do tipo de células por LAM ^8. No entanto, a utilização de um automprocessador de tecidos ated para a incorporação em cera é muito tempo eficiente, como muitas amostras podem ser processadas ao mesmo tempo que exige um mínimo de mãos no tempo. Enquanto tipicamente sem perda significativa de qualidade de ARN ocorre durante a fixação e a incorporação, a preparação de secções finas com o micrótomo e, em particular, a montagem nas frameslides utilizados para LAM continua a ser um passo crítico para a conservação da qualidade do ARN. Isto tem sido observado anteriormente e a utilização de um sistema de transferência de fita foi descrita para resultar em melhor qualidade de ARN nesta etapa ^12. No entanto, esta acrescenta um passo adicional demorada durante a preparação das lâminas e também requer equipamento especial. O protocolo otimizado descrito abaixo reproducibly produz RNA que é de qualidade suficiente para o perfil transcricional com GeneCHIPs e Next Generation Sequencing (NGS) se aproxima ^7,11,13,14. Além disso, com o microscópio microdissecação laser utilizado, um elevado grau de pureza dos tipos de células isoladas é derrotainely produzida ^7,11,13,14.

O gênero Boechera é um excelente sistema modelo para estudar as principais etapas de reprodução apomítica. Em Boechera, uma variedade de diferentes acessos sexuais e apomíticas foram identificados e podem ser usados ​​para comparar as ^15,16,17. Numa comparação de transcriptomes específicos do tipo de célula de células da linha germinativa feminina de Arabidopsis sexual e apomítico Boechera, foram identificados genes e vias que são expressos diferencialmente, identificando assim novos aspectos dos processos de regulação que regula apomixis ^7. Além disso, este estudo verificou a adequação de LAM para transcrição específicos do tipo de célula análises de tipos de células pequenas e raras. Já têm utilizado este protocolo para a análise de diferentes tipos de células numa variedade de espécies de plantas, mas de espécies de modificações e específicos de tecidos para o protocolo pode ser necessária em certos casos.

Protocolo

Nota: Este protocolo descreve a preparação do tecido, laser assistida microdissection e extração de RNA para o perfil transcricional. Sempre use luvas ao longo de todas as etapas do protocolo. Estudar e considerar as instruções de segurança para cada produto químico utilizado. Em particular, tenha em mente que xilol é prejudicial e pode penetrar luvas e que o metanol é tóxico. Para todos os instrumentos utilizados, consulte os manuais do usuário em conformidade.

1. Remoção de RNAse Atividade de material de vidro e outros equipamentos

1. Antes de usar, envolver qualquer material de vidro em folha de alumínio antes da cozedura para ~ 8 h a 180 ° C para assegurar a qualidade de ARNase livre.
2. Tratar quaisquer superfícies metálicas (por exemplo, um par de pinças), bem como a bancada de trabalho e a placa de aquecimento com uma solução de descontaminação de RNAse apropriada. Em seguida, lavar as superfícies com água isenta de ARNase para remover a solução de descontaminação. Subsequentemente, limpar as superfícies mais com 70% de EtOH.
3. Use todos os plasconsumíveis tic (por exemplo, tubos) novinho em folha, sem qualquer pré-tratamento. Se possível, use consumíveis de plástico que são certificadas a RNase livre.

Fixação 2. Tissue

1. Preparar 10 ml de fixador de Farmer (3: 1; v / v de etanol: ácido acético) em um tubo de 15 ml fresco em gelo. (Sempre preparar fixador do fazendeiro fresco antes da utilização). Como uma alternativa, o etanol não reticulado fixador: ácido acético (5: 1; v / v) pode ser usado ^18.
2. Use um belo par de pinças para recolher gemas na fase de desenvolvimento de interesse. Imediatamente submergir botões no fixador gelada. Utilizar 10 ml de fixador para a fixação de ~ 20 botões ou flores de Arabidopsis ou Boechera Nota:. Ao utilizar espécies de plantas com flores maiores, recomenda-se dissecar as flores com uma lâmina de barbear para gerar pequenos pedaços antes da fixação.
   1. A fim de obter gametophytes maduros, castrar as 2 - 3 maiores botões florais da INFLORescence 2 dias antes da colheita.
3. Encher o fundo de um exsicador com gelo. Abra os tubos contendo as amostras, por exemplo, flores, e colocá-los em gelo, quer colocando-os directamente para o gelo em uma maneira que não pode cair ou por utilização de um suporte apropriado. Infiltrar vácuo durante 15 min antes da libertação do vácuo.
   1. Repetir a infiltração por vácuo uma vez durante 15 min.
4. Libertar o vácuo e armazenamento durante a noite (~ 12 horas) em gelo. Cobrir o balde de gelo com uma folha de cobertura ou de alumínio e armazenar o balde numa sala C 4 ° ou refrigerador, a fim de evitar que o gelo do descongelamento. Nota: O prolongamento do tempo de fixação não é recomendado.

3. Tissue Embedding, Fino Seccionamento e montagem em lâminas para LAM

1. embutindo tecido.
   1. Trocar o fixador para 70% de etanol preparado com etanol puro e RNAse água livre. Deixe as amostras em gelo até posterior processamento. Comece embedding das amostras no mesmo dia. No caso de nenhuma máquina de processamento de tecido está disponível, avance para a incorporação manual como descrito em outros lugares ^9,11 e continuar com o passo 3.1.11.
   2. Suavemente transferir as amostras de tecido para a incorporação de cassetes com um par de pinças. Firmemente fechar as cassetes. Passo crítico: Evitar a secagem mesmo parcial da amostra durante esta etapa. Evite apertar de amostras com a pinça.
      Nota: Para identificar as cassetes um lápis deve ser usado, de preferência por escrito sobre a superfície inclinada da cassete.
   3. Armazenar a cassete incorporação carregado com os botões ou flores em etanol a 70% até todo o material é transferido para a máquina de cassetes e incorporação pode ser carregado. Para esta finalidade, utilizar uma tina de vidro para coloração encheu-se com 70% de etanol.
   4. Remover o cesto do processador de tecidos a partir da retorta da máquina e transferir as cassetes de incorporação para o carrinho com as superfícies inclinadas de frente para o topo e na mesma direcção. CRIPASSO TICAL: Realizar isso rapidamente para evitar qualquer secagem dos tecidos. Se o processamento de muitas cassetes de embebimento de uma só vez, colocar o cesto num recipiente de RNAse apropriada livre preenchido com 70% de etanol antes de carregar as amostras.
   5. Coloque a tampa sobre o carrinho e colocar o cesto de volta na retorta. Feche a réplica.
      Nota: O processador de tecidos desidrata automaticamente as amostras, muda o solvente para xilol, e faz a infiltração com cera de parafina fundida. Tipicamente, isto é feito durante a noite.
   6. Inicie o programa do processador de tecidos. configurações padrão recomendado é de 1 h 70% de EtOH, três vezes 1 h 90% de EtOH, três vezes 1 h EtOH a 100%, duas vezes 1 hr 100% xilol, um tempo de 1 h 15 min 100% xilol à temperatura ambiente, seguido de infiltração cera de parafina com duas vezes durante 1 h e uma vez durante 3 horas a 56 ° C ^11.
      Nota: Para garantir que a estação de bloqueio está pronto com a cera derretida, ligar a máquina várias horas antes do início ouutilizar a função de temporizador para selecionar o tempo de partida aproximada.
      Nota: No caso de o tecido não pode ser processada imediatamente a seguir, os tempos de incubação mais longos em cera de parafina, a 56 ° C são possível, em vez da 3 h a 56 ° C. Consulte o manual do usuário do instrumento. Normalmente, as cassetes com tecidos permanecerá automaticamente em cera derretida até que o comando "réplica vazia" é aprovado. Se a cera não é fundida quando se inicia o processador de tecidos, a retorta é preenchida com 70% de etanol e o programa continua em espera até que esteja pronto para iniciar.
   7. Esvaziar a retorta e transferir imediatamente as amostras para um banho de cera de parafina a 56 ° C em uma estação de bloqueio. Remover a tampa do cesto e cobrir o banho de parafina da estação de bloqueio com a sua tampa.
   8. Pile como muitas bandejas de equilibragem frescas sobre a superfície da estação de bloqueio aquecida a 56 ° C, tal como existem em cassetes do cesto.
      Nota: Um marcador permanente etanol-resistente pode ser usadod para rotular o fundo dos tabuleiros de equilibragem. marcadores permanentes acetona-resistente não são recomendados.
   9. Usando a estação de bloqueio, encher um tabuleiro de balanceamento de plástico fresco pré-aquecido, com cera de parafina fundida a 56 ° C. Levantar a tampa do banho de parafina, pegar um cassete única de cada vez e transferir as amostras a partir das cassetes para a cera de parafina líquida a 56 ° C no tabuleiro de equilíbrio usando um par de pinças.
      Passo crítico: Evitar qualquer endurecimento da cera que circunda a amostra ao manusear a cassete trabalhando rapidamente.
      1. Posicionar todas as amostras de acordo com as necessidades, utilizando uma agulha de preparação antes do endurecimento da cera. Tipicamente, várias flores estão dispostos em uma bandeja balanceamento espaçadas individualmente cerca de 1 cm em cada direcção.
      2. Repita o passo 3.1.9 até que todas as amostras são transferidas.
   10. Coloque o cesto de volta para o processador de tecidos e limpar a réplica usando um programa adequado (consulte o manual do usuário).
   11. Desligue processador de tecidos e da estação de bloqueio. Continue com o passo 3.1.13.
   12. No caso de nenhuma máquina de infiltração do tecido e nenhuma estação de incorporação está disponível, usar um forno de aquecimento para derreter a cera de parafina a 56 ° C. Na bancada, preencher a cera derretida em tabuleiros de plástico de equilibragem, transferir as amostras à cera, e utilizar agulhas de preparação para posicionar as amostras.
   13. Permitir que a cera de parafina a endurecer à temperatura ambiente durante ~ 1-3 horas antes de armazenar as amostras a 4 ° C. As amostras podem ser posteriormente processadas de fresco ou armazenados durante vários meses.
2. Preparação de lâminas delgadas e slides para LAM.
   1. Numa mesa de luz que ilumina o bloco de cera de baixo, remover a cera de parafina com as amostras dos tabuleiros de plástico adjacentes. Dissecar um bloco de cera quadrado contendo o tecido, por exemplo., Um broto ou flor, usando uma lâmina de barbear livre RNAse. Para este objectivo, sempre orientar as amostras para a parte superior do bloco de cera (também ver Figura 1).
      1. Prepare blocos de cera de todas as amostras que devem ser usados ​​para LAM de cada vez.
   2. Monte os blocos para processar a incorporação de cassetes cheias de cera de parafina endurecida: derreter um pequeno pedaço ou uma gota de cera de parafina na ponta de uma espátula apropriada usando uma lâmpada de etanol e utilizar a cera quente para fixar o bloco com o apoio (com os tecidos incorporados em cima).
      1. Permitir que a cera endurecer durante pelo menos 20 min a 4 ° C.
   3. Remover cera excedente que circunda a amostra com uma lâmina de barbear sobre a mesa de luz. Certifique-se manter uma superfície quadrada com bordas paralelas (ver Figura 1).
   4. Definir a placa de aquecimento a 42 ° C.
   5. Com segurança montar as amostras para o micrótomo e preparar 6 - 10 mm de espessura. Consulte as instruções do fabricante para o uso do micrótomo. Nota: Enquanto cortes mais finos, muitas vezes, dar uma melhor resolução estrutural, maior quantidade de RNA de higheQualidade I podem ser obtidos com as secções mais espessas. Para as células de Boechera amadurecer gametophytes usamos 7 mm como padrão. Movendo muito lentamente com as amostras mais a faca microtome muitas vezes resulta em uma melhor histologia.
   6. Sempre transferir as fitas de parafina com um comprimento de aproximadamente 10 - 15 cm no interior de uma caixa de plástico com um cartão preto na parte inferior antes de posicionar-los em lâminas de LAM.
   7. Se possível, pré-seleccionar as partes das tiras de parafina contendo os cell- ou tecido tipos de interesse, por exemplo, óvulos, sob uma dissecação-âmbito e descartar o resto.
3. Preparação das lâminas para LAM.
   1. Coloque a quantidade necessária de lâminas com armação metálica (tipicamente 5 - 10) com a superfície plana na parte superior sobre a placa de aquecimento.
   2. Pipeta ~ 1 - 2 ml de RNAse água livre sobre a parte plástica do slide. Usando uma lâmina de barbear, cortar as fitas de parafina em pequenos pedaços de cerca de 4-5 cm de comprimento suficiente para abranger as janelas de plástico. vocêsi, um par de pinças e uma agulha de preparação para posicionar as tiras de parafina paralelos um ao outro nas janelas de plástico das lâminas. Cuidadosamente levantar a corrediça numa das extremidades para remover a água e colocar as lâminas para trás.
      1. Alternativamente, coloque a placa de aquecimento sob uma coifa química. Aplicar um pequeno volume de metanol para a parte de plástico da corrediça apenas suficiente para molhar a superfície (isto pode causar uma ligeira ondulação das lâminas). Coloque as tiras de parafina nos slides.
         Nota: Por razões de toxicidade, evitar o uso de metanol, se possível. No entanto, a utilização de metanol a esta etapa faz melhorar a qualidade de ARN no caso de a qualidade do obtido com a montagem sobre a água não é suficiente. Vale a pena testar essas alternativas no início de um novo projeto, como a qualidade RNA conseguido varia de acordo com tipo de célula e espécies sob investigação.
   3. Secam-se as lâminas durante a noite na placa de aquecimento a 42 ° C durante ~ 12 horas. Cobrir a placa de aquecimento comuma tampa de plástico que não toca os slides. Certifique-se de que a tampa de plástico não impede a troca de ar. Para este objectivo, a tampa pode ser colocada em caixas de pipetas ou semelhante a ser levantada.
      1. Alternativamente, reduzir o tempo de secagem para um mínimo de duas horas ou até o tecido parece totalmente seco. A redução do tempo de cortar a coleção pode melhorar a qualidade do RNA.
   4. Dentro de uma câmara químicos, de-cera as lâminas 2 vezes durante 10 min em xilol utilizando suportes de lâmina adequadas. Certifique-se a submergir completamente a peça de plástico de cada lâmina única, mas para permitir a remoção da lâmina por tocar a extremidade mais larga da estrutura de metal que é mantida seca.
   5. Permitir que os slides para secar durante ~ 10 min sob o capô química antes da LAM.
      Nota: As lâminas não processadas imediatamente pode ser colocada de volta na placa de aquecimento a 42 ° C com o tecido virada para cima, até algumas horas. Isso irá evitar qualquer umidade de comprometer a qualidade do RNA até novo processamento.

4. Microdissecção assistida por laser (LAM)

Nota: O procedimento para a LAM irá variar com o instrumento utilizado. Certos detalhes deste protocolo são adaptados a um instrumento específico e a tecnologia de coleta das amostras em um boné fazendo uso de forças eletrostáticas. Além disso, os detalhes podem variar ainda entre diferentes versões de software. Por favor, consulte as instruções do fabricante e manuais de usuário para uma descrição detalhada e instruções específicas sobre instrumento e software.

1. Ligue os dispositivos para a LAM (computador, microscópio, caixa de controle de laser).
2. Inicie o programa de dirigir o microscópio e laser.
3. Ligar o laser, premindo o botão correspondente na caixa de controlo.
4. Coloque uma tampa (0,5 ml, sem difusor) no suporte do tampão e posicioná-lo no instrumento.
5. Apoiar o slide LAM com uma lâmina de vidro para microscopia. Certifique-se de que a superfície plana da lâmina com otecido ligado enfrenta a lâmina de vidro.
6. Coloque o slide no instrumento com a lâmina de vidro por baixo.
7. Seleccione a 4X Objetivo. No programa, selecione para mover a tampa para a posição "up" e continuar a fazer um scan do slide.
8. Pesquisar o slide e identificar as estruturas de interesse. Identificar e salvar as suas posições sobre o slide para ser capaz de se mover de volta para a posição exata para a etapa de corte.
9. Selecione o objetivo apropriado (por exemplo 40X ou 60X).
10. Se necessário, ajustar a velocidade a laser, foco e potência do laser, e também calibrar o movimento palco, referindo-se ao manual do usuário do instrumento. Uma vez que uma conta está configurada para o tecido específico de interesse, as configurações podem ser reutilizados.
11. Verificar a posição do laser por um único tiro, premindo o botão de "tiro de laser" do programa, de preferência em uma parte da membrana sem tecido.
    1. Se necessário, calibre a posição do laser, seguindo thinstruções e do fabricante para o instrumento.
12. Verifique a calibração do objectivo movendo uma estrutura óbvia para todos os quatro cantos da janela do software no monitor, mantendo o botão direito do mouse pressionado. Verificar que a posição da mão, com respeito à estrutura óbvia é a mesma em todos os quatro cantos. Caso contrário calibrar os seguintes objectivos o manual do software.
13. Com a tampa na posição "para baixo", use a ferramenta 'mão-pen' para marcar as fronteiras do tipo de célula ou tecido de interesse, por exemplo, a célula-ovo. Dissecar a célula de interesse com o laser pressionando 'cortar'. Nota: Muitas vezes, o corte precisa ser repetido se a borda em torno da célula não foi totalmente dissecada ao mesmo tempo. Neste caso, recomenda-se configurar o software para fazer automaticamente duas repetições da secção como um padrão.
14. Levante a tampa e passar para a próxima posição guardada com a estrutura de interesse. Repita o passo 4.13do procedimento para dissecar as seções celulares próximos até que todas as células de interesse de um slide são coletados. Certifique-se que a tampa está posicionado de uma forma que a nova seção adere a uma posição vazia na tampa.
    Nota: Recomenda-se para isolar pedaços maiores de tecidos (por exemplo, secções de flores inteiras ou partes dele) de cada slide após o isolamento das seções de células individuais em um tampão fresco. Estes podem ser utilizados para controlo de qualidade de ARN.
15. Remover o slide e continuar com o próximo slide, repetindo os passos 4,4-4,9 e 4,13-4,14.
16. Repita o passo 4.15 e passos relacionados até que os tipos de células de interesse de todos os slides foram isolados. Nota: Não é recomendado para a colheita durante mais de ~ 4-5 horas no mesmo tampão.
17. inspecionar visualmente a superfície da tampa após a LAM para excluir contaminações inespecíficos da amostra. Enquanto os tecidos não dissecados são protegidos com a folha, poeira podem aderir à superfície devido à adesão eletrostática.
    1. To inspecionar visualmente a tampa, remova a lâmina do instrumento. Coloque o suporte de tampa na posição "para baixo" e inspecionar a superfície com o objetivo 4X.
    2. No caso de pequenos pedaços de poeira são visíveis, removê-los com uma pequena (2 ul) da ponteira. Alternativamente, montar o slide de volta no aparelho, colocar a tampa na parte livre do slide (não tecidos), e destruir completamente a contaminação utilizando o laser.
18. Fechar as tampas e congelar as secções a seco a -80 ° C até à sua utilização. Se necessário, as amostras podem ser armazenadas durante até várias semanas. No entanto, prosseguir rapidamente neste passo é recomendada.

5. Isolamento RNA e Controle de Qualidade

Nota: o ARN pode ser isolado através de qualquer método adequado para pequenas quantidades de ARN. Neste protocolo é descrito o uso de um kit de isolamento de ARN especificado para pequenas quantidades de ARN. Siga as instruções do fabricante.

1. Use os tubos com a amostra ligada aa tampa, directamente ou após remoção a partir de -80 ° C.
   1. Abrir os tubos e pipetar cuidadosamente 11 ul de tampão de extracção para a parede de cada tubo, utilizando pontas de filtro. Alterar dicas entre as amostras.
   2. Fechar a tampa e agitar o tampão de extracção para baixo para a tampa do tubo.
   3. Colocar os tubos com a tampa para baixo num forno de aquecimento pré-aquecido a 42 ° C. Incubar durante 30 min, seguindo as instruções do fabricante.
2. Seguir as instruções do fabricante para a preparação da coluna e recolher o extracto no fundo dos tubos.
   1. Se o material de mais de uma tampa precisa ser combinados em uma amostra, prossiga com os passos 5.1.1 - 5.1.2 individualmente para cada tubo / cap.
   2. Em seguida, reunir os extractos para uma amostra em um tubo e medir a quantidade de extracto reunido com uma pipeta antes da adição de uma quantidade equivalente de EtOH (ver as instruções do fabricante).
   3. Certifique-se de que a quantidade de EtOH adicionado antes de carregar a coluna é igual ao volume do extracto reunido.
   4. Após precipitação com EtOH ARN, avançar rapidamente para a carga das colunas seguintes instruções do fabricante. Continuar o protocolo com o passo de centrifugação a 100 xg.
   5. Depois de o conteúdo de cada tubo de recolha ter sido passado através da coluna, executar um passo de centrifugação de 16.000 xg durante 30 segundos para remover instruções de fluxo seguinte do fabricante.
   6. Continue com a extração de RNA e purificação seguindo as instruções do fabricante.
   7. Após o carregamento do tampão de eluição à coluna permitir que a coluna a incubar durante 1 min. Continuar a carregar os tubos no centrifugador seguindo as instruções contidas nas instruções do fabricante. Nota: Um passo adicional de centrifugação durante 1 min a 100 x g antes da eluição tal como indicado no protocolo pode aumentar a eficiência de eluição.
3. Extracto de RNA da CONTROLS (seções de tecido maiores) para o controle de qualidade RNA seguintes passos 5.1 a 5.2.7 do presente protocolo.
4. Para o controlo de qualidade de ARN de carga 1 ul de RNA total não diluído de cada amostra de controlo sobre o Bioanalyzer usando um Pico Chip de RNA, seguindo as instruções do fabricante.
   Nota: O ARN extraído pode ser utilizado para a amplificação linear e análise de transcriptoma utilizando microarrays ou ^{ARN-7,11,13,14} Seq. Idealmente, o controlo de qualidade deve indicar um ARN Integridade Número (NIR) de, pelo menos, 7. Um certo número de fornecedores fornecem kits adequados para a amplificação, os exemplos adequados são dadas em ^9.

Resultados

Preparação de Amostras e LAM são feitas em etapas consecutivas

Um número de passos consecutivos são necessários para preparar ARN para a análise da transcrição a partir de tipos de células seleccionadas pela LAM (Figura 1). Isto começa com a colheita das flores e a fixação imediata para assegurar que a população de RNA permanece inalterado após a colheita. O tecido é incorpora...

Discussão

O protocolo é adequado para celulares diferentes e tipos de tecidos

LAM combinado com transcriptoma analisa por microarrays ou RNA-Seq é uma ferramenta valiosa para obter insights sobre os padrões específicos de atividade dos genes que regulam os processos de desenvolvimento ou fisiológicos ^7-11,13,14. No entanto, a adequação deste método para qualquer dado tipo de célula está criticamente dependente de problemas estruturais. A célula deve ser clarament...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	1,009,861,000	absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Ambion Nuclease free water	life technologies	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	tissue processor
black cardboard			can be purchased in special paper shops
DNA- and RNAse-free Frame Slides	Micro Dissect GmbH		1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
ethanol lamp
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
filter tips 10 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 1,000 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 20 µl	Axon Lab AG	AL60020	can be replaced by similar tips
filter tips 200 µl	Axon Lab AG	AL60200	can be replaced by similar tips
forceps precision	VWE	232-1221
glass slide holder	Huber & Co.AG	10.0540.01	Färbekästen nach Hellendahl
glass staining trough	Huber & Co.AG	10.0570.01	Färbekasten
Heated Paraffin Embedding Module Leica	Leica	Leica EG 1150 H	blocking station, similar devises are suitable
Heating and Drying Table	Medax	15501	other models and/or suppliers are suitable
ice bucket	VWR ice bucket with lid	10146-184	similar buckets equally suitable
light table	UVP An Analytical Jena Company	TW-26	white light transluminator
microscope slide	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
microtome blade	Thermo Scientific	FEAHS35	S35 microtome blade disposable
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml	life technologies	AM12475
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	for histology
PicoPure RNA Isolation Kit	life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
plastic balancing trays	Semadeni AG	2513
plastic box	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
plastic lid for heating plate			homemade
preparation needle	VWR	631-7159
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
RNAse free microfuge tubes	life technologies	AM12400
RNAse ZAP Decontamination Solution	life technologies	AM9780
Semi-automated Rotary Microtome	Leica	RM2245	similar devices are equally suitable
Tissue Loc Histo Screen Cassettes	Thermo Scientific	C-1000_AQ	similar cassettes of other suppliers are suitable
Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xylol (Isomere) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
process embedding cassettes	Leica	14039440000	Leica Jet Cassette I without lid
Universal Oven	Memmert	UF55	other models and/or suppliers are suitable