assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

Résumé

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Résumé

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Introduction

Dans les études de transcription effectuées au niveau des tissus, les transcriptomes de types de cellules hautement spécialisées, mais rares sont souvent masqués par les cellules environnantes plus abondantes. Un exemple de ces types de cellules hautement spécialisées sont les cellules de la lignée de reproduction féminin (germinale) dans les plantes. La lignée germinale femelle est spécifié dans les ovules en développement, les précurseurs de graines à l' intérieur du gynécée du ^1,2 fleur. La cellule mégaspore mère (MMC) est la première cellule de la lignée germinale femelle. Il subit la méiose pour former une tétrade de mégaspores réduits. En règle générale, une seule de ces mégaspores survit et se divise en mitose sans cytokinèse, soit dans un syncytium. Ces mitoses sont suivis par cellularisation pour former le gamétophyte mature, qui se compose généralement de quatre types de cellules: trois antipodes, deux cellules synergide, l'œuf et la cellule centrale. Les cellules d'oeufs et centrales sont les gamètes femelles qui se fécondés par deux spermatozoïdes pendant doufertilisation ble pour donner naissance à l'embryon et de l' albumen du ^1,2 de graines de développement. Dans le sexuel système modèle Arabidopsis thaliana, seulement ~ 50 graines se développent par fleur tandis qu'environ 50 - 80 graines se développent par fleur dans le genre étroitement apparenté Boechera. Ainsi, la lignée germinale femelle se compose de seulement quelques types de cellules hautement spécialisées, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les processus de développement, tels que la spécification et la différenciation cellulaire.

En outre, un aperçu des processus de régulation des gènes régissant la reproduction des plantes peuvent être de valeur appliquée. Chez les plantes, à la fois la reproduction sexuée et asexuée par graines (apomixie) peut se produire. Bien que la reproduction sexuelle génère la diversité génétique dans une population, apomixie conduit à la formation de la progéniture clonale qui est génétiquement identique à la plante mère. Par conséquent, l'apomixie a un grand potentiel pour des applications dans l'agriculture et la production de semences, comme les génotypes maternels même complexes peuventêtre maintenu inchangé pendant plusieurs générations ^3,4,5. Parce que apomixie ne se produit pas naturellement dans toutes les principales espèces cultivées, l'ingénierie de l' apomixie dans les cultures est d' une grande ^3,4,5 d'intérêt. Cependant, cet objectif à long terme est difficile à réaliser parce que la base génétique et moléculaire sous - jacente de l' apomixie on ne comprend pas suffisamment détaillée ^6.

Pour obtenir un aperçu de la base de la transcription qui régissent la reproduction apomictique, une cellule de type spécifique de transcription profilage à l' aide microdissection assistée par laser (LAM) et le séquençage de prochaine génération (NGS) représente une approche très puissante ^7,8. LAM a d'abord été mis en place pour les animaux et la recherche biomédicale. Au cours des dernières années LAM a également été appliquée à la biologie végétale ^6,9,10. Contrairement à d' autres méthodes permettant de profilage de types de cellules et de tissus, LAM ne nécessite pas la génération des lignes de marquage ^6,9,10. Par conséquent, il peut être applimenti à une cellule ou d'un tissu de type sans connaissance moléculaire préalable. Un autre avantage de LAM est qu'il peut être appliqué à tout type de cellule aussi longtemps que la cellule peut être reconnu dans les sections sèches en fonction de la position et / ou les caractéristiques structurelles. LAM présente l'avantage supplémentaire que les tissus fixes sont utilisés, ce qui empêche toute modification du profil de transcription lors du traitement.

Le tissu d'intérêt, par exemple, le tissu floral, est fixé dans un fixateur non réticulant avant l'enrobage dans la paraffine. Incorporation dans la cire de paraffine peut être fait manuellement, en suivant les protocoles établis ^9,11. Cependant, l'utilisation d'un processeur de tissu automatisé pour la déshydratation et l'infiltration avec la cire se traduit généralement par une reproductibilité élevée en termes de conservation de la qualité de l'ARN et la morphologie du tissu. La stratégie alternative d'incorporation des tissus en résine a également été utilisé avec succès pour des analyses spécifiques de type cellulaire par LAM ^8. Cependant, l'utilisation d'un automprocesseur de tissus ATED pour l'enrobage dans de la cire est très efficace du temps, car de nombreux échantillons peuvent être traités à la fois exigeant un minimum de temps sur les mains. Bien qu'elle soit généralement pas de perte significative de qualité de l'ARN a lieu lors de la fixation et l'intégration, la préparation de sections minces avec le microtome et, en particulier, leur montage sur les frameslides utilisés pour LAM restent une étape essentielle pour la préservation de la qualité de l'ARN. Cela a déjà été noté et l'utilisation d'un système de transfert de bande a été décrite pour aboutir à une meilleure qualité de l' ARN à cette étape ^12. Toutefois, cela ajoute une étape de temps supplémentaire lors de la préparation des diapositives et nécessite également un équipement spécial. Le protocole optimisé décrit ci - dessous produit reproductible ARN qui est d' une qualité suffisante pour le profilage transcriptionnel avec GeneChips et Next Generation Sequencing (NGS) approches ^7,11,13,14. En outre, avec le microscope à microdissection laser utilisé, avec une pureté élevée des types de cellules isolées est routinely produit ^7,11,13,14.

Le genre Boechera est un excellent modèle pour étudier les principales étapes de la reproduction apomictique. Dans Boechera, une variété de différentes accessions sexuelles et apomictiques ont été identifiés et peut être utilisé pour des analyses comparatives ^15,16,17. Dans une comparaison des transcriptomes type de cellules spécifiques de cellules de la lignée germinale femelle d'Arabidopsis sexuelle et apomictique Boechera, nous avons identifié les gènes et les voies qui sont exprimés différemment, identifiant ainsi les nouveaux aspects des processus réglementaires régissant apomixie ^7. En outre, cette étude a vérifié l'aptitude des cellules LAM pour la transcription spécifique du type d'analyses de types de cellules petites et rares. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour l'analyse des différents types de cellules dans une variété d'espèces végétales, mais l'espèce et des modifications spécifiques de tissus au protocole peut être nécessaire dans certains cas.

Protocole

Remarque: Ce protocole décrit la préparation des tissus, laser assistée par microdissection, et l'extraction de l'ARN pour le profilage transcriptionnel. Utilisez toujours des gants dans toutes les étapes du protocole. Étudier et examiner les consignes de sécurité pour chaque produit chimique utilisé. En particulier, gardez à l'esprit que Xylol est nuisible et peut pénétrer des gants et que le méthanol est toxique. Pour tous les instruments utilisés, s'il vous plaît se référer à des manuels d'utilisation en conséquence.

1. Suppression de RNAse Activité de verrerie et d'autres équipement

1. Avant utilisation, envelopper toute la verrerie dans une feuille d'aluminium avant la cuisson pendant environ 8 heures à 180 ° C pour assurer la qualité RNAse libre.
2. Traiter toutes les surfaces métalliques (par exemple, une paire de pinces), ainsi que le banc de travail et la plaque chauffante avec une solution de décontamination RNAse appropriée. Ensuite, laver les surfaces avec de l'eau sans RNAse pour éliminer la solution de décontamination. Par la suite, nettoyez les surfaces plus loin avec 70% EtOH.
3. Utilisez tous les plasconsommables tic (par exemple, tubes) flambant neuf sans aucun prétraitement. Si possible, utilisez des consommables en plastique qui sont certifiés pour être RNase.

2. La fixation tissulaire

1. Préparer 10 ml de fixateur de fermier (3: 1; v / v d'éthanol: acide acétique) dans un nouveau tube de 15 ml sur la glace. (Toujours préparer le fixateur de fermier frais avant utilisation). En variante, l'éthanol non réticulant fixatif: acide acétique (5: 1, v / v) peut être utilisé ^18.
2. Utilisez une belle paire de pinces pour recueillir des bourgeons au stade de développement d'intérêt. plonger immédiatement bourgeons dans le fixateur glacée. Utilisez 10 ml de fixateur pour la fixation de ~ 20 bourgeons ou des fleurs de Arabidopsis ou Boechera Note:. Lors de l' utilisation des espèces végétales avec de plus grandes fleurs , il est recommandé de disséquer les fleurs avec une lame de rasoir pour générer de plus petits morceaux avant la fixation.
   1. Afin d'obtenir gamétophytes matures, émasculer les 2 - 3 grands boutons de fleurs de la inflorescence 2 jours avant la récolte.
3. Remplissez le fond d'un dessiccateur avec de la glace. Ouvrez les tubes contenant les échantillons, par exemple, des fleurs, et les placer sur la glace, que ce soit en les mettant directement dans la glace d'une manière qu'ils ne peuvent pas tomber ou en utilisant un support approprié. Infiltre sous vide pendant 15 minutes avant la libération du vide.
   1. Répéter l'infiltration sous vide, une fois pendant 15 min.
4. Relâchez le vide et le magasin pendant une nuit (~ 12 h) sur la glace. Couvrir le seau à glace avec un couvercle ou une feuille d'aluminium et de stocker le seau dans une chambre ou C réfrigérateur 4 ° pour empêcher la glace de la décongélation. Remarque: Prolonger la durée de fixation est pas recommandé.

3. Enrobage des tissus, Thin Sectionnement et Montage sur Diapositives pour LAM

1. plongement des tissus.
   1. Remplacez le fixateur à 70% d'éthanol préparé avec de l'éthanol pur et RNAse eau libre. Laissez les échantillons sur la glace jusqu'à ce que le traitement ultérieur. Démarrez embedding des échantillons du même jour. Dans le cas où aucune machine de tissu de traitement est disponible, passez à l' intégration manuelle comme décrit par ailleurs ^9,11 et passez à l' étape 3.1.11.
   2. transférer délicatement les échantillons à cassettes de tissus intégrant avec une paire de pinces. Bien fermer les cassettes. ÉTAPE CRITIQUE: Éviter le séchage même partielle de l'échantillon au cours de cette étape. Ne pas tordre des échantillons avec la pince à épiler.
      Remarque: Pour étiqueter les cassettes d'un crayon doit être utilisé, idéalement en écrivant sur la surface inclinée de la cassette.
   3. Rangez la cassette enrobage chargé des bourgeons ou des fleurs dans 70% d'éthanol jusqu'à ce que tout le matériel est transféré à cassettes et la machine enrobage peut être chargé. A cet effet, utiliser une cuve de coloration de verre rempli de 70% d'éthanol.
   4. Retirer le panier de traitement de tissu provenant de la cornue de la machine et transférer les cassettes d'encastrement dans le panier avec les surfaces inclinées faisant face à la partie supérieure et dans la même direction. CRISTEP TICAL: Effectuez cette rapidement pour éviter tout dessèchement des tissus. Si le traitement de nombreuses cassettes d'enrobage à la fois, placez le panier dans un récipient sans RNAse approprié rempli de 70% d'éthanol avant le chargement des échantillons.
   5. Mettez le couvercle sur le panier et mettre le panier de nouveau dans la cornue. Fermez la cornue.
      Remarque: Le processeur de tissus déshydrate automatiquement les échantillons, change le solvant Xylol, et fait l'infiltration avec de la cire de paraffine fondue. Typiquement, cela se fait pendant une nuit.
   6. Démarrer le programme du processeur de tissus. réglages standards recommandés sont 1 h 70% EtOH, trois fois 1 h 90% EtOH, trois fois 1 h 100% EtOH, deux fois 1 h 100% Xylol, une fois 1 h 15 min 100% Xylol à la température ambiante, suivie par infiltration avec de la cire de paraffine à deux reprises pendant 1 heure et une heure pendant 3 heures à 56 ° C ^11.
      Remarque: Pour veiller à ce que la station de blocage est prêt avec la cire fondue, allumer la machine plusieurs heures avant le début ouutiliser la fonction de minuterie pour sélectionner l'heure de départ approximative.
      Remarque: Dans le cas où le tissu ne peut pas être traitée immédiatement après, de plus longues durées d'incubation dans la cire de paraffine à 56 ° C sont possibles au lieu de 3 heures à 56 ° C. Reportez-vous au manuel d'utilisation de l'instrument. En règle générale, les cassettes avec les tissus restent automatiquement dans la cire fondue jusqu'à ce que la commande "vide de l'autoclave" est approuvé. Si la cire est pas fondu lors du démarrage du processeur de tissus, la cuve est remplie de 70% d'éthanol et le programme reste en attente jusqu'à ce prêt à démarrer.
   7. Vider la cuve et les transférer immédiatement les échantillons dans un bain de paraffine à 56 ° C dans un poste de blocage. Retirez le couvercle du panier et couvrir le bain de la station de blocage avec son couvercle de paraffine.
   8. Pieu de nombreux plateaux d'équilibrage frais sur la surface de la station de blocage est chauffé à 56 ° C, comme il y a des cassettes dans le panier.
      Note: Un marqueur permanent éthanol résistant peut être utiliséd pour étiqueter le fond des plateaux d'équilibrage. marqueurs permanents Acétone résistant ne sont pas recommandés.
   9. Utilisation de la station de blocage, remplir un nouveau plateau en plastique d'équilibrage préchauffé avec de la cire de paraffine fondue à 56 ° C. Soulevez le couvercle du bain de paraffine, ramasser une cassette seulement à un moment et transférer les échantillons des cassettes à la cire de paraffine liquide à 56 ° C dans le bac d'équilibrage en utilisant une paire de pinces.
      ÉTAPE CRITIQUE: Éviter tout durcissement de la cire entourant l'échantillon lors de la manipulation de la cassette en travaillant rapidement.
      1. Placez tous les échantillons en fonction des besoins à l'aide d'une aiguille de préparation avant le durcissement de la cire. Habituellement, plusieurs fleurs sont disposées dans un plateau d'équilibrage espacés individuellement environ 1 cm dans chaque direction.
      2. Répétez l'étape 3.1.9 jusqu'à ce que tous les échantillons sont transférés.
   10. Placez le panier vers le processeur de tissus et nettoyer la cornue en utilisant un programme approprié (voir le mode d'emploi).
   11. Eteignez processeur de tissus et de la station de blocage. Passez à l'étape 3.1.13.
   12. Dans le cas où aucune machine d'infiltration des tissus et aucune station d'enrobage est disponible, utiliser un four de chauffage pour faire fondre la cire de paraffine à 56 ° C. Sur le banc, remplir la cire fondue dans des plateaux d'équilibrage en plastique, transférer les échantillons à la cire, et d'utiliser des aiguilles de préparation pour positionner les échantillons.
   13. Laissez la cire de paraffine pour durcir à température ambiante pendant environ 1 à 3 heures avant de stocker les échantillons à 4 ° C. Les échantillons peuvent ensuite être traités ou fraîchement stockés jusqu'à plusieurs mois.
2. Préparation des sections minces et lames pour LAM.
   1. Sur une table lumineuse éclairant le bloc de cire d'en bas, enlever la cire de paraffine avec les échantillons provenant des plateaux en plastique environnants. Disséquer un bloc de cire carré contenant le tissu, par exemple., Un bourgeon ou d'une fleur, en utilisant une lame de rasoir RNAse gratuit. Dans ce but, orienter toujours les échantillons vers le haut du bloc de cire (voir aussi Figure 1).
      1. Préparer des blocs de cire de tous les échantillons qui doivent être utilisés pour LAM à la fois.
   2. Monter les blocs pour traiter l'intégration des cassettes remplies de cire de paraffine durcie: faire fondre un petit morceau ou gouttelette de cire de paraffine sur la pointe d'une spatule appropriée à l'aide d'une lampe à l'éthanol et utiliser la cire chaude pour fixer le bloc sur le support (avec les tissus intégrés en haut).
      1. Laissez la cire durcir pendant au moins 20 min à 4 ° C.
   3. Retirer la cire excédentaire entourant l'échantillon avec une lame de rasoir sur la table lumineuse. Assurez - vous de garder une surface carrée avec des bords parallèles (voir la figure 1).
   4. Placer la plaque de chauffage à 42 ° C.
   5. En toute sécurité monter les échantillons au microtome et préparer 6 - 10 um sections épaisses. Reportez-vous aux instructions du fabricant pour l'utilisation du microtome. Note: Bien que des sections plus minces donnent souvent une meilleure résolution structurelle, plus grande quantité d'ARN de highela qualité de r peut être obtenu avec des sections plus épaisses. Pour les cellules de Boechera matures gamétophytes nous utilisons 7 um comme valeur par défaut. Déplacement plutôt lentement avec les échantillons sur le couteau microtome se traduit souvent par une meilleure histologie.
   6. Toujours transférer les rubans de paraffine à une longueur d'environ 10 à 15 cm dans une boîte en plastique avec un carton noir au fond avant de les positionner dans les diapositives de la MAMA.
   7. Si possible, pré-sélectionner les parties des bandes de paraffine contenant les types de cellules ou de tissus d'intérêt, par exemple, les ovules, en vertu d' une dissection étendue et jeter le reste.
3. Préparation des lames pour LAM.
   1. Placer la quantité nécessaire de diapositives encadrées de métal (typiquement 5 à 10) avec la surface plane sur le dessus de la plaque chauffante.
   2. Pipet ~ 1 - 2 ml de RNAse eau libre sur la partie en plastique de la glissière. En utilisant une lame de rasoir, couper les rubans de paraffine en petits morceaux d'environ 4 - 5 cm suffisamment longue pour couvrir les fenêtres en matière plastique. USE paire de pinces et une aiguille de préparation pour placer idéalement les bandes de paraffine parallèles les unes aux autres sur les fenêtres en matière plastique des lamelles. Soulevez délicatement la lame à une extrémité pour éliminer l'eau et placer les diapositives en arrière.
      1. Sinon, placez la plaque chauffante sous une hotte chimique. Appliquer un petit volume de méthanol à la partie plastique de la glissière juste suffisante pour mouiller la surface (ce qui peut provoquer une légère ondulation des lames). Placez les bandes de paraffine sur les lames.
         Remarque: Pour des raisons de toxicité, éviter l'utilisation de méthanol si possible. Cependant, l'utilisation de méthanol à cette étape n'améliorer la qualité de l'ARN dans le cas où la qualité obtenue par le montage de l'eau est insuffisante. Il est intéressant de tester ces alternatives au début d'un nouveau projet, comme la qualité de l'ARN obtenu varie selon le type et les espèces cellule sous enquête.
   3. Sécher les lames durant la nuit sur la plaque chauffante à 42 ° C pendant environ 12 heures. Couvrir la plaque chauffante avecun couvercle en plastique qui ne touche pas les diapositives. Assurez-vous que le couvercle en plastique ne fait pas obstacle à l'échange d'air. Dans ce but, le couvercle peut être placé sur des boîtes de pipette ou similaire à soulever.
      1. Vous pouvez également réduire le temps de séchage à un minimum de deux heures ou jusqu'à ce que le tissu semble totalement sec. La réduction du temps de tranchage de collecte peut améliorer la qualité de l'ARN.
   4. Sous une hotte chimique, de la cire les diapositives 2 fois pendant 10 min en Xylol utilisant des supports de lames appropriées. Assurez-vous de plonger entièrement la partie en plastique de chaque diapositive seulement, mais pour permettre le retrait de la lame en touchant l'extrémité la plus large du cadre métallique qui est maintenu au sec.
   5. Laisser les lames sécher pendant environ 10 min sous le capot chimique avant LAM.
      Note: Les lames ne sont pas immédiatement traitées peuvent être placés en arrière sur la plaque chauffante à 42 ° C avec le tissu vers le haut jusqu'à quelques heures. Cela permettra d'éviter toute humidité de compromettre la qualité de l'ARN jusqu'au traitement.

4. microdissection assistée par laser (LAM)

Remarque: La procédure de LAM variera en fonction de l'instrument utilisé. Certains détails de ce protocole sont adaptés à un instrument spécifique et la technologie de la collecte des échantillons sur une utilisation bouchon de fabrication de forces électrostatiques. De plus, les détails peuvent varier même entre les différentes versions du logiciel. S'il vous plaît se référer aux instructions du fabricant et des manuels d'utilisation pour une description détaillée et des instructions spécifiques sur l'instrument et du logiciel.

1. Allumez les appareils pour LAM (ordinateur, microscope, boîtier de commande de laser).
2. Démarrez le programme de pilotage du microscope et laser.
3. Allumez le laser en appuyant sur la touche correspondante sur le boîtier de commande.
4. Placer un bouchon (0,5 ml, sans diffuseur) dans le porte-bouchon et le positionner dans l'instrument.
5. Soutenir la lame de LAM avec une lame de verre pour la microscopie. Veiller à ce que la surface plane de la lame avec latissu attaché fait face à la lame de verre.
6. Placer la lame dans l'instrument avec la lame de verre en dessous.
7. Sélectionnez l'objectif 4X. Dans le programme, sélectionnez pour déplacer le bouchon à la position «haut» et procédera à une analyse de la diapositive.
8. Recherchez dans la diapositive et identifier les structures d'intérêt. Pinpoint et enregistrer leurs positions sur la diapositive pour être en mesure de revenir à la position exacte pour l'étape de coupe.
9. Sélectionnez l'objectif approprié (par exemple 40X ou 60X).
10. Si nécessaire, ajuster la vitesse du laser, mise au point, et la puissance du laser, et étalonner aussi le mouvement de la scène en se référant au manuel d'utilisation de l'instrument. Une fois qu'un compte est mis en place pour le tissu d'intérêt spécifique, les paramètres peuvent être réutilisés.
11. Vérifiez la position du laser par un seul coup en appuyant sur le bouton "tir laser" du programme, idéalement dans une partie de la membrane sans tissu.
    1. Si nécessaire, calibrer la position du laser en suivant ièmeles instructions du fabricant de e pour l'instrument.
12. Vérifier l'étalonnage de l'objectif en déplaçant une structure évidente à tous les quatre coins de la fenêtre du logiciel sur le moniteur, en maintenant le bouton droit de la souris enfoncé. Vérifier que la position de la main par rapport à la structure évidente est la même dans les quatre coins. Sinon calibrer les objectifs suivants le manuel du logiciel.
13. Avec le bouchon dans la position «bas», utilisez l'outil «main-plume» pour marquer les frontières du type de cellule ou de tissu d'intérêt, par exemple, la cellule œuf. Disséquer la cellule d'intérêt avec le laser en appuyant sur «couper». Note: Souvent, sectionnant doit être répété si la frontière autour de la cellule n'a pas été entièrement disséqué à la fois. Dans ce cas, il est recommandé de configurer le logiciel pour faire automatiquement deux répétitions de la section en tant que norme.
14. Soulevez le couvercle et passer à la position enregistrée suivante avec la structure d'intérêt. Répétez l'étape 4.13de la procédure de disséquer les sections cellulaires suivantes jusqu'à ce que toutes les cellules d'intérêt à partir d'une diapositive sont collectées. Assurez-vous que le bouchon est placé de manière à ce que la nouvelle section tient à une position vide sur le bouchon.
    Note: Il est recommandé d'isoler les gros morceaux de tissus (par exemple, des sections de fleurs entières ou des parties de celui - ci) de chaque diapositive après l'isolement de sections de cellules isolées sur un chapeau frais. Ceux-ci peuvent être utilisés pour le contrôle de la qualité de l'ARN.
15. Retirer la lame et continuer avec la diapositive suivante en répétant les étapes 04.04 à 04.09 et 4.13 à 4.14.
16. Répétez l'étape 4.15 et étapes connexes jusqu'à ce que les types d'intérêt de toutes les diapositives de cellules ont été isolées. Note: Il est recommandé de ne pas récolter plus longtemps que ~ 4-5 h sur le même cap.
17. Inspecter visuellement la surface du capuchon après LAM pour exclure les contaminations non spécifiques de l'échantillon. Alors que les tissus non-disséqués sont protégés avec la feuille, de la poussière peut adhérer à la surface due à l'adhérence électrostatique.
    1. To inspecter visuellement le bouchon, retirer la lame de l'instrument. Placez le support de bouchon dans la position «bas» et inspecter la surface avec l'objectif 4X.
    2. En cas de petits morceaux de poussière sont visibles, retirez-les avec une petite (2 pi) pointe de la pipette. Vous pouvez également monter la glissière sur l'instrument, placer le bouchon sur une partie libre de la glissière (aucun tissus), et détruire complètement la contamination en utilisant le laser.
18. Fermer casquettes et geler les sections sèches à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Si nécessaire, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines. Cependant, procéder rapidement à cette étape est recommandée.

5. Isolement de l'ARN et de contrôle de la qualité

Remarque: L'ARN peut être isolé par tout procédé approprié pour de petites quantités d'ARN. Dans ce protocole, l'utilisation d'un kit d'isolement d'ARN spécifié pour de petites quantités d'ARN est décrite. Suivez les instructions du fabricant.

1. Utilisez les tubes avec l'échantillon attaché àle bouchon soit directement, soit après le retrait de -80 ° C.
   1. Ouvrez les tubes et pipeter avec soin 11 pi de tampon d'extraction à la paroi de chaque tube à l'aide des conseils de filtre. Changer conseils entre les échantillons.
   2. Fermer le couvercle et secouer le tampon d'extraction vers le bouchon du tube.
   3. Placer les tubes avec le bouchon vers le bas dans un four de chauffage préchauffé à 42 ° C. Incuber pendant 30 min en suivant les instructions du fabricant.
2. Suivre les instructions du fabricant pour la préparation de la colonne et en recueillant l'extrait au fond des tubes.
   1. Si le matériau de plus d'un bouchon doit être combiné en un seul échantillon, suivez les étapes 5.1.1 - 5.1.2 individuellement pour chaque tube / bouchon.
   2. Ensuite, mettre en commun les extraits d'un échantillon dans un tube et de mesurer la quantité d'extrait commun avec une pipette avant l'addition d'une quantité équivalente de EtOH (voir les instructions du fabricant).
   3. Veiller à ce que la quantité de EtOH ajouté, avant le chargement de la colonne est égal au volume de l'extrait mis en commun.
   4. Après la précipitation de l'ARN avec de l'EtOH, de procéder rapidement au chargement des colonnes en suivant les instructions du fabricant. Poursuivre le protocole avec l'étape de centrifugation à 100 xg.
   5. Après que le contenu de chaque tube de collecte ont été passés à travers la colonne, effectuer une étape de centrifugation 16.000 xg pendant 30 secondes pour éliminer les instructions du fabricant accréditives suivant.
   6. Continuer avec l'extraction de l'ARN et la purification en suivant les instructions du fabricant.
   7. Après le chargement du tampon d'élution de la colonne permet la colonne à incuber pendant 1 min. Continuer à charger les tubes dans la centrifugeuse en suivant les instructions dans les instructions du fabricant. Note: Une étape de centrifugation supplémentaire pendant 1 min à 100 xg avant l'élution comme indiqué dans le protocole peut augmenter l'efficacité de l'élution.
3. Extraire l'ARN à partir de la suiteRols (sections de tissus plus grandes) pour le contrôle de la qualité de l'ARN en suivant les étapes 5.1 à 5.2.7 de ce protocole.
4. Pour l'ARN qualité charge de commande 1 pl d'ARN total non dilué de chaque échantillon de contrôle sur le Bioanalyseur en utilisant un ARN Pico Chip suivant les instructions du fabricant.
   Remarque: L'ARN extrait peut être utilisé pour une amplification linéaire et l' analyse du transcriptome en utilisant des microréseaux ou de l' ARN-Seq ^7,11,13,14. Idéalement, le contrôle de la qualité doit indiquer un numéro d' intégrité de l' ARN (RIN) d'au moins 7. Un certain nombre de fournisseurs de fournir des kits appropriés pour l' amplification, des exemples appropriés sont donnés dans ^9.

Résultats

Préparation d' échantillons et LAM sont effectuées dans les étapes consécutives

Un certain nombre d'étapes successives sont nécessaires pour préparer l' ARN pour une analyse de la transcription à partir de types de cellules sélectionnées par le LAM (figure 1). Ceci commence par la récolte des fleurs et une fixation immédiate pour assur...

Discussion

Le protocole est adapté à différents types de cellules et de tissus

LAM combinée avec transcriptome analyse par microarrays ou ARN-Seq est un outil précieux pour mieux comprendre les modèles spécifiques de l' activité des gènes régulant les processus de développement ou physiologiques ^7-11,13,14. Cependant, la pertinence de cette méthode pour tout type de cellule donné dépend de façon critique sur les questions structurelles. La...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	1,009,861,000	absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Ambion Nuclease free water	life technologies	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	tissue processor
black cardboard			can be purchased in special paper shops
DNA- and RNAse-free Frame Slides	Micro Dissect GmbH		1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
ethanol lamp
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
filter tips 10 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 1,000 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 20 µl	Axon Lab AG	AL60020	can be replaced by similar tips
filter tips 200 µl	Axon Lab AG	AL60200	can be replaced by similar tips
forceps precision	VWE	232-1221
glass slide holder	Huber & Co.AG	10.0540.01	Färbekästen nach Hellendahl
glass staining trough	Huber & Co.AG	10.0570.01	Färbekasten
Heated Paraffin Embedding Module Leica	Leica	Leica EG 1150 H	blocking station, similar devises are suitable
Heating and Drying Table	Medax	15501	other models and/or suppliers are suitable
ice bucket	VWR ice bucket with lid	10146-184	similar buckets equally suitable
light table	UVP An Analytical Jena Company	TW-26	white light transluminator
microscope slide	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
microtome blade	Thermo Scientific	FEAHS35	S35 microtome blade disposable
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml	life technologies	AM12475
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	for histology
PicoPure RNA Isolation Kit	life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
plastic balancing trays	Semadeni AG	2513
plastic box	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
plastic lid for heating plate			homemade
preparation needle	VWR	631-7159
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
RNAse free microfuge tubes	life technologies	AM12400
RNAse ZAP Decontamination Solution	life technologies	AM9780
Semi-automated Rotary Microtome	Leica	RM2245	similar devices are equally suitable
Tissue Loc Histo Screen Cassettes	Thermo Scientific	C-1000_AQ	similar cassettes of other suppliers are suitable
Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xylol (Isomere) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
process embedding cassettes	Leica	14039440000	Leica Jet Cassette I without lid
Universal Oven	Memmert	UF55	other models and/or suppliers are suitable