باستخدام تقنية الترقق لتنفيذ متحد البؤر المجهري للالصلبة الإنسان

Summary

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Abstract

الصلبة هي النسيج الضام الكثيفة التي تغطي وتحمي العين. وتتكون أساسا من حزم الكولاجين كثيفة (أنواع الأول والثالث والرابع، والخامس، والسادس، والسابع). نظرا لتألق ذاتي، الغموض، وسمك، لم يتم العثور يجعلها مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر. نهج بديل لتلك المعروضة هنا، والذي يستخدم الصلبة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لالمناعية، يواجه تحديات التقنية، وخصوصا عندما التسخين الأنسجة لاسترجاع مستضد. منذ الصلبة هي فقيرة نسبيا في كل من الخلايا والأوعية، واستكشاف واستخدام عينات الأنسجة أكبر للمساعدة على منع الخلايا تطل وفهم توطين بهم فيما يتعلق بالسفن ومواقع تشريحية أخرى. للسماح لتحليل عينات الأنسجة أكبر تحت المجهر متحد البؤر، تم تنفيذ أسلوب الترقق لخلق طبقات رقيقة من الصلبة. وبعد تحليل نتائج الأوعية الدموية CD31 والأوعية اللمفاوية البطانية hyaluرونان مستقبلات 1 (LYVE1) خلايا الإيجابية، التي تم الحصول على الموافقة للفحص العلمي، وتناقش مزايا وقيود من هذا الأسلوب.

Introduction

الصلبة هي الطبقة الخارجية الصلبة التي تغطي العين، وهو مصنوع من النسيج الضام الكثيفة. فهو يساعد على حماية الهياكل داخل العين والمحافظة على ضغط العين. وهكذا، فإن الصلبة أمر ضروري لرؤية واضحة. وهي خالية من الأوعية اللمفاوية ^1،2 وبالتالي يشكل الحدود الخارجي خالية من اللمفاوية بينه وبين خالية من اللمفاوية العين الداخلية ^3-7. كما يوفر مواقع المرفقات للعضلات العين، وبالتالي تقاسم التشابه التشريحية مع الأوتار. لأن الصلبة يتكون أساسا من حزم كثيفة من النوع الأول الكولاجين ولديه عدد أقل من أنواع الكولاجين الثالث، والرابع، والخامس، والسادس، والثامن ^8،9 والإيلاستين ^10،11، هذا النسيج ليست سهلة الاستخدام لالمناعية.

تشريحيا، الصلبة يمكن تقسيمها إلى ثلاث طبقات رئيسية: (1) ظاهر الصلبة أوعية دموية سطحية، وجدت تحت الملتحمة وكبسولة لسان ونحو الجانبين والعشرينالبريد مؤخرة العين التي تواجه المدار؛ (2) سدى الصلبة، والجزء الرئيسي من الصلبة. و (3) الغبساء الصفيحة، وهي طبقة رقيقة المصطبغة تقع مباشرة فوق العنبية. معرفتنا التشريحية حول الصلبة تنبع أساسا من النصف الأول من القرن ^التاسع 20. في ذلك الوقت، ودرس الباحثون تشريح الأوعية الدموية بشكل رئيسي باستخدام الهند حقن الحبر ¹² والأوعية الدموية الصب ^13-15. وفي وقت لاحق، وقد بحثت في دراسات التصوير الوعائي ^16-19.

منذ ذلك الوقت، وقد تحسنت تقنيات قديمة، وقد تم تطوير تلك الجديدة التي سمحت لنا لتكملة المعرفة التشريحية السابقة. على سبيل المثال، فقد كان فقط حوالي عقد من الزمان منذ أن كان لهذه علامات اللمفاوية موثوق بها اللمفاوية بطانة الأوعية الدموية محدد حمض الهيالورونيك مستقبلات 1 (LYVE1) ²⁰ أو podoplanin ^21. يقدم المجهر متحد البؤر إمكانيات جديدة لدراسة الخصائص التشريحية لمنظمة الشفافية الدولية المختلفةssues من العين. انها تسمح للبقع متعددة لاستخدامها للتمييز علامات من الخلايا أو لتوطين الخلايا في ما يتعلق الأوعية الدموية والهياكل التشريحية الأخرى. ويقدم لمحة عامة عندما تكون العينة ذات حجم أكبر وتتيح لنا من خلال مسح عينة عندما بحثا عن نوع خلية معينة. مع تكنولوجيا Z-ستاك، الفحص المجهري متحد البؤر يمكن استخدامها لعينات تصل إلى 100-200 ميكرون. تختلف الصلبة في سمك بين 0.3 ملم وراء الإدراج العضلات و 1 مم في القطب الخلفي ^11. على حد سواء بسبب سماكة، والغموض، والصلبة ليست مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر باستخدام الطرق التقليدية.

لتصحيح هذا، كانت مغلفة الأنسجة الصلبة للسماح للتحليل مع المجهر متحد البؤر. هذه التقنية مفيدة لاكتساب فهم أفضل الحالات الفسيولوجية والمرضية في كل من الصلبة الإنسان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يجب إعادة النظر في استخدام الأنسجة البشرية والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية أو ما يعادلها. وتمت الموافقة على العمل الموصوف هنا من قبل لجنة الأخلاق المحلية وحصل على موافقة للفحص العلمي. تم تنفيذ هذا العمل وفقا لإعلان هلسنكي. تم الحصول على عينات الصلبة الإنسان عن أعين الجهات المانحة العالم (الحد الأقصى بعد الوفاة الوقت 24 ساعة) في بنك العيون من قسم طب العيون في جامعة كولونيا، ألمانيا.

1. إعداد التجريبية

1. إعداد 96٪ من الإيثانول والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنابيب مختلفة. إعداد الأجسام المضادة الأولية في التخفيف الموصى بها من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) والحفاظ على كل الحلول على الجليد. إعداد 100 ميكرولتر لكل عينة.
2. تنظيف جميع الأدوات واستخدام المشارط الحادة. بعد تكرار قطع مع نفس مشرط، تغيير مشرط.
3. الحصول على 1-2 ملقط COLIBRI، على التوالي مقص تشريح الصغيرة، و# 10 مشرطأو مشرط العيون ريشة صغيرة، وأربعة 26 الإبر G.
4. لف رقائق الألومنيوم حول لوحة البوليسترين أو استخدام لوحة الفلين لتركيب الأنسجة. العمل تحت المجهر ستيريو مجهر. العمل العقيمة تحت تدفق الهواء الصفحي إذا لزم الأمر.

2. إعداد الصلبة

1. عقد بلطف لمبة وإجراء نقب تثقيب من جانب القرنية والصلبة، ثم تدوير ينقب. تدوير ينقب بعناية وبشكل متساو على سطح لإجراء قطع مستديرة على حد سواء. استخدام ينقب الحجم 15.5 ملم. قطع إرفاق ملفات المتبقية مع مقص منحني. إزالة نقب القرنية والصلبة. وسيؤدي هذا لمبة فتح الأمامية.
   1. وضع الصلبة على مسحة مع الجزء المفتوح صعودا. إزالة شبكية العين والعنبية، وذلك باستخدام ملقط COLIBRI لسحب قبالة كل من طبقات (شبكية العين والعنبية) من الصلبة. لا تترك العنبية المصطبغة على الصلبة الداخلية. استخدام مقص منحنية لإزالة شبكية العين والعنبية من حليمة. إزالة عينيaining الملتحمة، عضلات العين، وكبسولة لسان من الصلبة سطحية.
2. إزالة العينة الصلبة في الحجم المطلوب باستخدام نوع مستقيم مقص وملقط COLIBRI. يستغرق حوالي 2 سم ² العينات الصلبة الحجم من مواقع مختلفة. ونظرا لصغر حجمها، وعقد الصلبة بلطف وقطع الحجم المطلوب كما الساحات باستخدام مقص من النوع الثابت. يحدد نقب القرنية والصلبة على الحافة الأمامية من العينات الصلبة.
   1. تجنب تكرار الاستيلاء مع ملقط كمنطقة حيث النسيج وانتزع ليست مناسبة لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر. إعداد العدد المطلوب من العينات تبعا لنوع التجربة (على سبيل المثال الأمامية مقابل الخلف، مقارنة الشكل 1) وكمية من الأجسام المضادة المستخدمة.
3. وضع العينات في أنابيب 1.5 مل لاستخدامها لاحقا. إصلاح عينات في 1.5 مل 96٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل لهم ثلاث مرات كل لمدة 5 دقائقفي 1.5 مل برنامج تلفزيوني على شاكر. إذا كان يعمل مع الأنسجة المجمدة، تنفيذ هذه الخطوة قبل المفاجئة التجميد.
4. استخدام أنسجة جديدة. ومع ذلك، إذا لم يكن ذلك ممكنا، والمفاجئة تجميد الصلبة في النيتروجين السائل والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. إذا كان يعمل مع الأنسجة المجمدة، ذوبان الجليد قبل الاستخدام. تجنب الذوبان المتكررة ودورات التجمد.
5. الحفاظ على كل عينة في برنامج تلفزيوني تحتوي على 1.5 مل 5٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. هذه الخطوة يؤدي الى تورم في العينة التي هي مفيدة للالترقق، ويمنع أيضا ملزم غير محددة.
6. بعد عينات تضخمت، وإعداد الساحات الصلبة لالتصفيح. العمل تحت المجهر، على سبيل المثال المجهر ستيريو مجهر. يلصق العينات الصلبة الخلفي لغشاء البوليسترين ملفوفة في رقائق الألومنيوم أو لوحة الفلين باستخدام 26 الإبر G.
7. ثني الحواف من الإبر حتى لا تتداخل مع المجال البصري تحت المجهر.
8. صفح عصيدة الصلبة كامل سماكةليه.
   1. أولا، عقد حافة الصلبة الأمامية باستخدام ملقط COLIBRI. ثم قطع بعناية طبقة رقيقة من الصلبة السطحية باستخدام مشرط رقم 10، ريشة صغيرة مشرط العيون، أو شفرة الملعقة. عقد مشرط أفقيا وقطع الطبقة السطحية كما رقيقة ممكن من الطبقة الأساسية.
   2. تشريح طبقة الصلبة رقيقة من الساحة الصلبة. هذه الطريقة هي مماثلة لتقنيات جراحية القياسية لإعداد رفرف خلال trabeculectomy ويجب أن تؤدي إلى طبقات سميكة 30-80 ميكرومتر (قارن الشكل 2).
9. منع جفاف الصلبة عن طريق إضافة كميات صغيرة من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة، وعلى سبيل المثال 50 ميكرولتر PBS باستخدام ماصة.
10. وضع طبقات مقطعة إلى 100 ​​ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 96 لوحة جيدا وتسمية كل من التوجه (نحو خارجي والمتدرب) وطبقة (سطحية وعميقة) على سبيل المثال مع لون ماء.
11. كرر الخطوات من 2،7-2،9 حتى يتم مغلفة النسيج بالكامل.

3. تنفيذ المناعية

1. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة في التخفيف الموصى بها. هنا، على سبيل المثال استخدام CD 31 (الماوس وحيدة النسيلة المضادة البشرية) وLYVE1 الأجسام المضادة (أرنب المضادة البشرية)، وكلاهما في التخفيف من 1: 100 في برنامج تلفزيوني (التي تحتوي على 2٪ BSA) واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل. لتغيير المتوسطة في 96 لوحة جيدا، عقد ماصة لجدار البئر وإزالة السوائل.
2. في اليوم التالي، وغسل العينات ثلاث مرات كل لمدة 5 دقائق مع 200-300 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني على شاكر. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المقابلة؛ هنا استخدام الماعز المضادة الماوس فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) والماعز المضادة أرنب cyanine الأصباغ 3 (و Cy3)، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1: 300 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ مصل الماعز.
3. شطف العينات مرة أخرى ثلاث مرات كل لمدة 5 دقائق في 200-300 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني على شاكر.
4. أداء تلطيخ نواة، على سبيل المثال . 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) (تخفيف 1: 2000، 100 ميكرولتر في كل بئر واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة)، ثم يغسل مرة أخرى 2 مرات في 200-300 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني على شاكر.
5. نقل العينات على شرائح المجهر، تضمينها في 1-2 قطرات من تصاعد المتوسط ​​الفلورسنت، إضافة ساترة، وختم ذلك من خلال تغطية حواف مع الورنيش الشفاف، وتخزينها في 4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا أو فحص مباشرة الشرائح مع متحد البؤر مجهر.
6. استخدام المجهر متحد البؤر (أو ما يعادلها) لتحليل العينات. استخدام التكبير المطلوب، على سبيل المثال 10-40X التكبير.
7. للتحقق من سمك العينات، قياس مع المجهر متحد البؤر باستخدام Z-الأكوام. كمية أقسام الصلبة الممكنة يعتمد على مكان وجود الصلبة، ويختلف سمك استوائيا والخلف (قارن المقدمة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في تجارب تمثيلية يؤديها هنا، وهناك فوائد ثابتة مستمدة من استخدام هذه التقنية الترقق معينة. وتوضح التجربة الأولى للشبكة متنوعة من الضفيرة الأوعية الدموية فوق الصلبة في ثلاث صور الممثلة (الشكل 3). الأوعية إيجابية لCD31.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تغليف الصلبة الإنسان هو وسيلة لأداء متحد البؤر المجهر على هذا النسيج. خطوة حاسمة في هذه العملية هو استخدام الإيثانول بدلا من الفورمالين للصق الأنسجة. في تجربتنا، ويتم الحصول على نتائج أفضل عند استخدام الإيثانول بدلا من الفورمالين لتثبيت. المشارط حادة تفاقم الإجراء ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26 G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5 mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a