באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין

Summary

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Abstract

בלובן העין היא רקמת חיבור צפופה שמכסה ומגן על העין. זה מורכב בעיקר חבילות קולגן צפופות (סוגים אני, III, IV, V, VI, ו- VII). בשל autofluorescence, העמימות, והעובי שלה, זה לא נמצא מתאים מיקרוסקופיה confocal. גישה חלופית לזו שהוצגה כאן, אשר משתמשת בלובן העין קבוע בפורמלין מוטבע פרפין עבור אימונוהיסטוכימיה, יש אתגרים טכניים, במיוחד כאשר החימום המוקדם הרקמה לאחזור אנטיגן. מאז בלובן העין הוא דל יחסית בשני התאים וכלי, שימוש דגימות רקמה גדולות שנחקר כדי לסייע במניעת תאים המשקיפה ולהבין הלוקליזציה שלהם ביחס כלי ואתרי אנטומיים אחרים. כדי לאפשר הניתוח של דגימות רקמה גדולות תחת מיקרוסקופ confocal, טכניקת למינציה בוצעה ליצור שכבות דקיקות מן בלובן העין. בעקבות ניתוח התוצאות של כלי הדם CD31 ו hyalu אנדותל כלי הלימפהרונאן קולטן 1 (LYVE1) תאים חיוביים, לגביה אישור לבדיקה מדעית הושג, את היתרונות והמגבלות של שיטה זו הם דנו.

Introduction

בלובן העין היא השכבה החיצונית הנוקשה המכסה את העין, העשוי רקמת חיבור צפופה. זה עוזר להגן על מבנים תוך-עיני וכדי לשמור על לחץ תוך עיני. לפיכך, בלובן העין חיוני לראייה ברורה. זהו ללא כלי הלימפה ^1,2 ובכך מהווה גבול חיצוני הלימפה ללא הבינה לבין העין הפנימית ללא הלימפה ^3-7. הוא גם מספק אתרים מצורפים עבור שרירי extraocular וחולק דמיון אנטומי עם גידים. מכיוון בלובן העין מורכבת בעיקר צרורות צפופות של סוג אני קולגן יש מספרים קטנים של סוגי קולגן III, IV, V, VI, VIII ^8,9 ואלסטין ^10,11, רקמה זו אינה קלה לשימוש עבור אימונוהיסטוכימיה.

אנטומית, בלובן העין ניתן לחלק לשלוש שכבות עיקריות: (1) episclera vascularized השטחי, נמצאות מתחת הלחמית הקפסולה של שֶׁגֶם ולקראת הצדדים הבחזרה הדואר של העין מול מסלולו; (2) את stroma scleral, החלק העיקרי של בלובן העין; ו (3) את lamina fusca, המהווה שכבה דקה, פיגמנט ממוקם ישירות מעל עִנבִּיָה. הידע אנטומי שלנו על בלובן העין נובע בעיקר מן המחצית הראשונה של המאה ^ה -20. באותו זמן, חוקרים בדקו את האנטומיה של כלי דם בעיקר באמצעות זריקות דיו הודו ¹² וכלי דם ליהוק ^13-15. מאוחר יותר, זה נחקר במחקרים והאנגיוגרפית ^16-19.

מאז אותה תקופה, שיטות ישנות שופרו חדשים פותח אפשרו לנו להשלים את הידע האנטומי קודם. לדוגמה, זה כבר רק יותר מעשור אחד מאז היו לנו סמנים הלימפה אמין כמו-1 קולטן hyaluronan ספציפי האנדותל של כלי הדם הלימפה (LYVE1) ²⁰ או ²¹ podoplanin. מיקרוסקופיה Confocal מציעה אפשרויות חדשות ללימוד התכונות אנטומיות של ti השונהssues של העין. היא מאפשרת כתמים מרובים כדי לשמש להבחנת סמנים של תאים או עבור הלוקליזציה של תאים ביחס כלי דם מבנים אנטומיים אחרים. הוא מספק סקירה כאשר המדגם הוא בגודל גדול יותר ומאפשר לנו לסרוק באמצעות מדגם כאשר בחיפוש אחר סוג תא מסוים. בעזרת טכנולוגיה Z-Stack, מיקרוסקופיה confocal יכול לשמש דגימות עד 100-200 מיקרומטר. בלובן העין שונה בעובי בין 0.3 מ"מ מאחורי הוספות שרירים 1 מ"מ בקוטב האחורי ^11. בשל הוא עובי השקיפות שלה, בלובן העין אינו מתאים מיקרוסקופיה confocal בשיטות מסורתיות.

כדי לתקן את זה, רקמות scleral היו למינציה כדי לאפשר ניתוח שלהם עם מיקרוסקופיה confocal. טכנולוגיה זו שימושית להשגת הבנה טובה יותר של שני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ב בלובן העין האנושית.

Protocol

השימוש ברקמות אדם צריך להיות נבדקת ואושר על ידי עושה ועדות מוסדיות או שווה הערך. העבודה המתוארת כאן אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית והיה אישור לבדיקה מדעית. עבודה זו בוצעה על פי הצהרת הלסינקי. דגימות scleral אדם התקבלו מעיני תורמים הגלובוס (HR המקסימלי שלאחר המוות זמן 24) על עיניים בנק מחלקת עיניים, אוניברסיטת קלן, גרמניה.

1. הכנה ניסויית

1. כן 96% אתנול וזרחתי בופר (PBS) צינורות שונים. הכן את נוגדנים ראשוניים עם הדילול המומלץ של PBS המכיל אלבומין 2% שור (BSA) ולשמור את כל פתרונות על קרח. כן 100 μl לדגימה.
2. יש לנקות את כל המכשירים ולהשתמש אזמלים חדים. אחרי חזר חיתוך עם אותה הסכין, לשנות את האזמל.
3. השג 1-2 מלקחיים COLIBRI, מספריים לנתח מיקרו ישר, אזמל # 10או נוצה מיקרו אזמל עיניים, וארבעה 26 מחטים G.
4. עוטפים בנייר אלומיניום סביב צלחת קלקר או להשתמש צלחת הפקק כדי להדביק את הרקמה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ סטריאו משקף. עבודה סטרילית מתחת זרימת אוויר למינרית במידת הצורך.

2. מכינים את בלובן העין

1. צמד בעדינות את הנורה ולבצע ניקור ניקוב מצד corneoscleral, ולאחר מכן סובב את לִקְדוֹחַ. סובב את לִקְדוֹחַ בזהירות ובאופן שווה על פני השטח כדי לבצע חתך עגול באותה מידה. השתמש לִקְדוֹחַ 15.5 מ"מ בגודל. חותך את המצורפים הנותרים עם מספריים מעוקלים. הסר את הניקור corneoscleral. זה יגרום נורה anteriorly נפתחה.
   1. שים את בלובן העין על מקלון עם החלק הפתוח כלפי מעלה. הסר את הרשתית עִנבִּיָה, באמצעות מלקחיים COLIBRI למשוך את שתי שכבות (הרשתית עִנבִּיָה) מן בלובן העין. אל תשאירו את עִנבִּיָה פיגמנט על בלובן העין הפנימית. השתמש במספריים מעוגלים כדי להסיר את הרשתית עִנבִּיָה מן הגבשושיות. הסר את remלחמית aining, שרירי extraocular, ו של הקפסולה שֶׁגֶם מן בלובן העין שטחית.
2. הסר את מדגם scleral בגודל הנדרש באמצעות מספריים ישרים מסוג ואת מלקחי COLIBRI. קח על 2 ס"מ ² דגימות scleral בגודל ממקומות שונים. בגלל גודלו הקטן, החזק את בלובן העין בעדינות לגזור לגודל המתאים כריבועים באמצעות מספריים ישר-סוג. ניקור corneoscleral מגדיר את השולים הקדמיים של דגימות scleral.
   1. הימנע חזר תופס עם מלקחי כאזור שבו רקמת התפס אינה מתאימה מיקרוסקופיה confocal מנתח. הכן את המספר הנדרש של דגימות בהתאם לסוג הניסוי (למשל קדמי לעומת בדיעבד, להשוות איור 1) ואת כמות הנוגדנים בשימוש.
3. שים דגימות 1.5 מ"ל צינורות לשימוש מאוחר יותר. תקן דגימות 1.5 מ"ל 96% אתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים בכל 5 דקותב 1.5 מ"ל PBS על שייקר. אם עובד עם רקמה קפוא, לבצע שלב זה לפני ההקפאה תוך שניות ספורות.
4. השתמש רקמה טריה. עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, צמד להקפיא את בלובן העין בחנקן נוזלי ולשמור אותו ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. אם עובד עם רקמה קפוא, להפשיר לפני השימוש. הימנע פשרת מעגלים חוזרים ונשנים של הקפאה.
5. שמור מדגם ב PBS המכיל BSA 1.5 מ"ל 5% בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. צעד זה גורם לנפיחות של המדגם כי הוא מועיל עבור למינציה וגם מונע מחייב נוקב.
6. לאחר הדגימות תפחו, להכין את ריבועי scleral ללמינציה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ, למשל מיקרוסקופ סטריאו משקף. הצמד את דגימות scleral האחוריות הממברנה הקלקר עטוף בנייר אלומיניום או צלחת הפקק באמצעות 26 מחטי G.
7. כופפו את הקצוות של מחטים כך שהם לא להפריע את שדה הראייה מתחת למיקרוסקופ.
8. למינציה samp scleral בעובי מלאles.
   1. ראשית, החזק את קצה scleral הקדמי באמצעות מלקחיים COLIBRI. ואז לחתוך בזהירות שכבה דקה של בלובן העין שטחית באמצעות אזמל # 10, הנוצה מיקרו עיניים אזמל, או להב מרית. החזק את האזמל אופקי ולחתוך את השכבה השטחית בצורה רחבה ככל האפשר מן השכבה שמתחת.
   2. לנתח שכבת scleral דקה מכיכר scleral. שיטה זו ניתן להשוות טכניקות ניתוח סטנדרטיות להכין דש במהלך trabeculectomy וצריך לגרום שכבות עבות 30-80 מיקרומטר (השווה איור 2).
9. למנוע התייבשות של בלובן העין על ידי הוספת כמויות קטנות של PBS לרקמה, PBS μl למשל 50 בעזרת פיפטה.
10. שים את השכבות לחתוך לתוך 100 μl של PBS ב 96 את הצלחת היטב ולתייג פי הנטייה (לכיוון חצוני ומתמחה) ואת השכבה (שטחי ועמוק) למשל עם צבע עמיד למים.
11. חזור על שלבי 2.7-2.9 עד רקמת למינציה מלאה.

.3 בצע אימונוהיסטוכימיה

1. הוספת 100 μl של הנוגדנים העיקריים הנדרשים לתוך הדילול המומלץ. הנה, למשל, השימוש CD 31 (אדם אנטי עכבר חד שבטי) נוגדני LYVE1 (אדם ארנב נגד), הוא דילול של 1: 100 ב PBS (המכיל 2% BSA) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לשנות את המדיום בצלחת 96 באר, להחזיק פיפטה אל הקיר של הבאר ולהסיר את הנוזל.
2. למחרת, לשטוף את דגימות שלוש פעמים בכל 5 דקות עם 200-300 PBS μl על שייקר. הוספת 100 μl של נוגדנים משני המתאימים; כאן להשתמש isothiocyanate והעמסת העכבר עז נגד (FITC) וצבעים cyanine ארנב עז נגד 3 (Cy3), דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. לדלל את הנוגדנים משני 1: 300 ב PBS המכיל סרום עיזים 2%.
3. שוטפים את דגימות שוב שלוש פעמים בכל 5 דקות ב 200-300 μl PBS על שייקר.
4. בצע מכתים הגרעין, למשל . 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (דילול 1: 2,000, 100 μl היטב כל דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר), ולאחר מכן לשטוף שוב 2 פעמים ב 200-300 PBS μl על שייקר.
5. העברת דגימות על גבי שקופיות מיקרוסקופ, להטביע אותם 1-2 טיפות של המדיום גובר פלורסנט, להוסיף coverslip, לאטום אותו על ידי כיסוי קצוות עם לכה שקופה, ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר או ישירות לבחון את השקופיות עם confocal מִיקרוֹסקוֹפּ.
6. שימוש במיקרוסקופ confocal (או שווה ערך) כדי לנתח את הדגימות. השתמש ההגדלה הרצויה, הגדלה למשל 10-40X.
7. כדי לאמת את העובי של הדגימות, למדוד עם מיקרוסקופ confocal באמצעות Z- ערימות. כמות חלקי scleral אפשרי תלויה במיקום של בלובן העין, כמו העובי שונה equatorially ו בדיעבד (השווה מבוא).

תוצאות

בניסויי הנציג בצעו כאן, ישנם יתרונות להדגמה נגזרים השימוש בטכניקת למינציה המסוימת הזה. הניסוי הראשון ממחיש את הרשת המגוונת של מקלעת כלי דם episcleral בשלוש תמונות נציג (איור 3). הכלי הן חיובי עבור CD31.

Discussion

למינציה בלובן העין האנושית היא שיטה לביצוע במיקרוסקופ confocal על רקמה זו. שלב קריטי בתהליך זה הוא השימוש באתנול במקום פורמלין עבור הדבקת הרקמה. מניסיוננו, תוצאות טובות יותר מתקבלות כאשר באמצעות אתנול במקום פורמלין עבור קיבעון. אזמלים בלאנט להחמיר את ההליך וכן יש להימנע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24x24mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a