En utilisant une technique de plastification pour effectuer la microscopie confocale de la sclérotique humaine

Résumé

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Résumé

La sclérotique est un tissu conjonctif dense qui recouvre et protège l'œil. Il se compose principalement de faisceaux de collagène denses (types I, III, IV, V, VI et VII). En raison de sa autofluorescence, l'opacité et l'épaisseur, il n'a pas été jugé approprié pour la microscopie confocale. Une approche alternative à celle présentée ici, qui utilise sclérotique fixés au formol noyé dans de la paraffine pour l'immunohistochimie, présente des difficultés techniques, surtout lorsque le préchauffage du tissu pour l'extraction de l'antigène. Depuis la sclérotique est relativement pauvre dans les deux cellules et les vaisseaux, l'utilisation d'échantillons de tissus plus grands a été explorée pour aider à prévenir les cellules donnant et de comprendre leur localisation par rapport aux navires et d'autres sites anatomiques. Afin de permettre l'analyse d'échantillons de tissus plus importantes au microscope confocal, une technique de stratification a été réalisée pour créer des couches minces à partir de la sclérotique. Suite à l'analyse des résultats des CD31 vaisseaux sanguins et vaisseaux lymphatiques endothéliale hyalurécepteur ronan 1 (LYVE1) cellules positives, dont l'approbation pour examen scientifique a été obtenu, les avantages et les limites de cette méthode sont discutées.

Introduction

La sclérotique est la couche externe rigide qui recouvre l'œil, qui est composé de tissu conjonctif dense. Elle aide à protéger les structures intraoculaires et de maintenir la pression intraoculaire. Ainsi, la sclérotique est essentiel pour une vision claire. Elle est dépourvue de vaisseaux lymphatiques ^1,2 et forme ainsi une frontière extérieure libre-lymphatique entre elle et l'œil intérieur libre-lymphatique ^3-7. Il fournit également des sites de fixation pour les muscles extraoculaires, partageant ainsi des similitudes anatomiques avec des tendons. Étant donné que la sclérotique est constitué principalement de faisceaux denses de collagène de type I et dispose d'un plus petit nombre de types de collagène III, IV, V, VI, VIII et ^8,9 élastine ^10,11, ce tissu ne sont pas faciles à utiliser pour l' immunohistochimie.

Anatomiquement, la sclérotique peut être séparé en trois couches principales: (1) la épisclère vascularisé superficielle, qui se trouvent au-dessous de la conjonctive et de la capsule de Tenon et vers les côtés et ee arrière de l'œil face à l'orbite; (2) le stroma scléral, la majeure partie de la sclérotique; et (3) l'fusca lamina, qui est une mince couche pigmentée située directement au-dessus du uvée. Notre connaissance de l' anatomie de la sclérotique provient principalement de la première moitié du 20 ^e siècle. A cette époque, les chercheurs ont étudié l'anatomie de la vascularisation principalement en utilisant l'encre de Chine injections ¹² et vasculaires coulée ^13-15. Plus tard, il a été étudié dans des études angiographiques ^16-19.

Depuis ce temps, les techniques anciennes ont été améliorées et de nouveaux ont été développés qui nous ont permis de compléter les connaissances anatomiques précédent. Par exemple, il a été seulement environ une dizaine d' années depuis que nous avons eu de tels marqueurs lymphatiques fiables que l' endothélium vasculaire lymphatique hyaluronane spécifique du récepteur-1 (LYVE1) ²⁰ ou podoplanin ^21. La microscopie confocale offre de nouvelles possibilités pour l'étude des caractéristiques anatomiques des différents tiquest de l'œil. Il permet de multiples tâches à être utilisées pour différencier les marqueurs de cellules ou pour la localisation des cellules par rapport aux vaisseaux sanguins et d'autres structures anatomiques. Il donne un aperçu lorsque l'échantillon est d'une taille plus grande et nous permet de numériser à travers un échantillon lorsque la recherche d'un type de cellule spécifique. Avec la technologie Z-Stack, la microscopie confocale peut être utilisé pour des échantillons jusqu'à 100 à 200 um. La sclérotique diffère d'épaisseur comprise entre 0,3 mm derrière les insertions musculaires et 1 mm au niveau du pôle postérieur ^11. À la fois en raison de son épaisseur et d'opacité, la sclère ne convient pas pour la microscopie confocale en utilisant des méthodes traditionnelles.

Pour remédier à cela, les tissus scléral ont été stratifiées pour permettre leur analyse par microscopie confocale. Cette technologie est utile pour une meilleure compréhension des deux situations physiologiques et pathologiques dans la sclérotique humaine.

Protocole

L'utilisation de tissus humains doit être examiné et approuvé par un comité d'examen institutionnel ou l'équivalent. Le travail décrit ici a été approuvé par le comité d'éthique local et a eu l'approbation de l'examen scientifique. Ce travail a été effectué conformément à la Déclaration d'Helsinki. Les spécimens scléral humains ont été obtenus à partir des yeux des donneurs de globe (post-mortem durée maximale de 24 heures) à la Banque des yeux du Département d'Ophtalmologie, Université de Cologne, en Allemagne.

1. Préparation expérimentale

1. Préparer éthanol à 96% et du tampon phosphate salin (PBS) dans des tubes différents. Préparer les anticorps primaires de la dilution recommandée de PBS contenant 2% de sérum albumine bovine (BSA) et de garder toutes les solutions sur la glace. Préparer 100 pi par échantillon.
2. Nettoyez tous les instruments et utiliser des scalpels tranchants. Après répétées de coupe avec le même scalpel, changer le scalpel.
3. Obtenir 1-2 pince colibri, ciseaux micro dissection droites, un scalpel # 10ou d'un scalpel ophtalmique micro plume, et quatre 26 G aiguilles.
4. Envelopper de papier d'aluminium autour d'une plaque de polystyrène ou utiliser une plaque de liège pour fixer le tissu. Travailler sous un microscope stéréo binoculaire. Travailler stérile sous un flux d'air laminaire si nécessaire.

2. Préparer le Sclera

1. Tenir délicatement le bulbe et effectuer une trépanation perforant sur la partie cornéo, puis tourner le trépan. Faites tourner le trépan soigneusement et uniformément sur la surface pour réaliser une coupe aussi ronde. Utilisez un trépan de taille de 15,5 mm. Couper les pièces jointes restantes avec des ciseaux courbes. Retirez la trépanation cornéo. Cela se traduira par une ampoule antérieurement ouverte.
   1. Mettez la sclérotique sur un coton-tige avec la partie ouverte vers le haut. Retirer la rétine et uvée, en utilisant une pince colibri pour retirer les deux couches (rétine et uvée) de la sclérotique. Ne laissez pas l'uvée pigmentée sur la sclérotique intérieure. Utilisez des ciseaux courbes pour enlever la rétine et uvée de la papille. Retirez le remaining conjonctives, des muscles extra-oculaires et la capsule de Tenon de la sclère superficielle.
2. Retirer l'échantillon scléral dans la taille requise à l'aide de ciseaux de type droite et la pince colibri. Prenez environ 2 cm ² échantillons scléral taille de différents endroits. En raison de la petite taille, maintenez la sclérotique délicatement et découper la taille requise sous forme de carrés en utilisant les ciseaux de type droit. La trépanation cornéo définit la marge antérieure des échantillons scléral.
   1. Évitez répété saisissant avec la pince que la zone où le tissu a été saisi ne convient pas pour les analyses de microscopie confocale. Préparer le nombre d'échantillons requis en fonction du type d'expérience (par exemple par rapport à en avant en arrière, comparer la figure 1) et la quantité d'anticorps utilisée.
3. Mettre les échantillons dans des tubes de 1,5 ml pour une utilisation ultérieure. Fixer les échantillons dans 1,5 ml d'éthanol à 96% pendant 15 min, puis les laver trois fois chacun pendant 5 mindans 1,5 ml de PBS sur l'agitateur. Si vous travaillez avec le tissu congelé, effectuer cette étape avant pression de congélation.
4. Utilisez des tissus frais. Toutefois, si cela est impossible, snap geler la sclérotique dans de l'azote liquide et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Si vous travaillez avec le tissu congelé, décongeler avant utilisation. Éviter la décongélation répétée et cycles de congélation.
5. Maintenir chaque échantillon dans du PBS contenant 1,5 ml de BSA à 5% à température ambiante pendant 2 heures. Cette étape provoque un gonflement de l'échantillon qui est utile pour la stratification et empêche également la liaison non spécifique.
6. Après les échantillons ont gonflé, préparer les carrés scléral pour la lamination. Travailler sous un microscope, par exemple un microscope stéréo binoculaire. Apposer les échantillons sclérales postérieures à la membrane de polystyrène enveloppé dans une feuille d'aluminium ou de la plaque de liège en utilisant les 26 G aiguilles.
7. Plier les bords des aiguilles afin qu'elles ne gênent pas le champ visuel sous le microscope.
8. Laminé la samp scléral pleine épaisseurles.
   1. Tout d'abord, maintenir le bord scléral antérieur en utilisant une pince colibri. Ensuite, couper soigneusement une fine couche de la sclérotique superficielle en utilisant le scalpel # 10, le scalpel ophtalmique micro plume, ou une lame de spatule. Tenir le scalpel horizontalement et couper la couche superficielle aussi finement que possible à partir de la couche sous-jacente.
   2. Disséquer une couche mince scléral de la place scléral. Cette méthode est comparable à des techniques chirurgicales standard pour préparer un rabat pendant trabéculectomie et devraient se traduire par des couches épaisses de 30-80 um (comparer Figure 2).
9. Empêcher le séchage de la sclérotique en ajoutant de petites quantités de PBS au tissu, par exemple 50 ul de PBS à l' aide d' une pipette.
10. Mettez les couches coupées dans 100 pi de PBS dans la plaque de 96 puits et étiqueter tant l'orientation (vers extern et stagiaire) et la couche (superficielle et profonde) , par exemple avec une couleur imperméable à l' eau.
11. Répétez les étapes 2,7-2,9 jusqu'à ce que le tissu est entièrement stratifié.

3. Effectuer immunohistochimie

1. Ajouter 100 ul des anticorps primaires nécessaires à la dilution recommandée. Ici, par exemple un CD d'utilisation 31 (anticorps monoclonal de souris anti-humain) et de l' anticorps LYVE1 (lapin anti-humain), à la fois dans une dilution de 1: 100 dans du PBS (contenant 2% de BSA) et incuber à 4 ° C pendant une nuit. Pour changer de support de la plaque de 96 puits, tenir la pipette à la paroi du puits et enlever le liquide.
2. Le lendemain, lavez les échantillons trois fois chacun pendant 5 min avec 200-300 pi de PBS sur l'agitateur. Ajouter 100 ul d'anticorps secondaires correspondants; ici utiliser chèvre anti souris isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et de chèvre anti-lapin cyanine 3 (Cy3), et incuber les échantillons à température ambiante pendant 1-2 heures. Diluer les anticorps secondaires de 1: 300 dans du PBS contenant du sérum de chèvre à 2%.
3. Rincer à nouveau les échantillons à trois reprises respectivement pendant 5 min dans du PBS 2-300 ul sur l'agitateur.
4. Effectuer coloration noyau, par exemple . 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilution 1: 2000, 100 pl dans chaque puits et incuber 10 min à température ambiante), puis laver à nouveau 2 fois dans 200-300 ul de PBS sur l'agitateur.
5. Transférer les échantillons sur des lames de microscope, incorporez-les dans 1-2 gouttes de milieu de montage fluorescent, ajouter une lamelle, sceller en recouvrant les bords avec un vernis transparent, et conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure ou d'examiner directement les diapositives avec le confocal microscope.
6. Utiliser un microscope confocal (ou équivalent) pour analyser les échantillons. Utilisez le grossissement souhaité, par exemple 10-40X grossissement.
7. Pour vérifier l'épaisseur des échantillons, mesurer avec la microscopie confocale en utilisant Z-Stacks. La quantité de sections sclérales possibles dépend de l'emplacement de la sclérotique, l'épaisseur diffère equatoriale et vers l'arrière (comparer introduction).

Résultats

Dans les expériences représentatives effectuées ici, il y a des avantages démontrables découlant de l'utilisation de cette technique de stratification particulière. La première expérience illustre le réseau diversifié de la épiscléral plexus vaisseau sanguin dans trois images représentatives (figure 3). Les vaisseaux sont positifs pour CD31.

La deuxième expérience montre des cellules immunit...

Discussion

Stratifier la sclérotique humaine est un procédé pour effectuer la microscopie confocale sur ce tissu. Une étape critique dans ce procédé est l'utilisation de l'éthanol au lieu de la formaline pour fixer le tissu. Dans notre expérience, de meilleurs résultats sont obtenus lors de l'utilisation de l'éthanol au lieu de la formaline pour la fixation. scalpels Blunt aggravent la procédure et doivent être évités. De même, l'assèchement de la sclérotique doit être évitée, car elle compl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24x24mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a