Использование ламинирование Методика Выполните конфокальной микроскопией Человеческой склеры

Резюме

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Аннотация

Склеры является плотной соединительной ткани, которая покрывает и защищает глаза. Она в основном состоит из плотных коллагеновых пучков (типов I, III, IV, V, VI и VII). Благодаря своему автофлуоресцентной, непрозрачности и толщины, не было обнаружено подходит для конфокальной микроскопии. Альтернативный подход к приведенному здесь, который использует фиксированные формалином склеры заключали в парафин для иммуногистохимии, имеет технические проблемы, особенно когда предварительное нагревание ткани для извлечения антигена. Поскольку склеры относительно бедна в обоих клетках и сосудах, использование больших образцов ткани была исследована, чтобы помочь предотвратить клетки с видом и понять их локализацию в отношении судов и других анатомических участков. Для обеспечения анализа больших образцов ткани под конфокальной микроскопии, метод ламинирования была выполнена для создания тонких слоев из склеры. После анализа результатов CD31 кровеносных сосудов и сосудов лимфатической эндотелиальной hyaluРонан рецептора 1 (LYVE1) положительных клеток, для которых было получено разрешение на научной экспертизы, преимущества и недостатки этого метода обсуждаются.

Введение

Склера жесткий внешний слой, который покрывает глаз, который сделан из плотной соединительной ткани. Это помогает защитить внутриглазных структур и для поддержания внутриглазного давления. Таким образом, склеры имеет важное значение для четкого видения. Она лишена лимфатических сосудов ^1,2 и тем самым образует наружную лимфатическую свободной границы между ним и лимфатической свободной внутренней глаза ^3-7. Она также обеспечивает места для прикрепления мышц глазного яблока, тем самым разделяя анатомических сходство с сухожилиями. Поскольку склера в основном состоит из плотных пучков типа I коллагена и имеет меньшее количество коллагена типа III, IV, V, VI, VIII ^8,9 и эластина ^10,11, эта ткань не является простым в использовании для иммуногистохимии.

Анатомически, склера могут быть разделены на три основные слои: (1) поверхностный васкуляризированной эписклеры, найденных под конъюнктиву и Теноновой капсулы и к сторонам и йе задней части глаза, обращенной к орбите; (2) Склеральное стромы, основная часть склеры; и (3) ламина fusca, которая представляет собой тонкий, пигментированный слой, расположенный непосредственно над сосудистой оболочки. Наше анатомическое знание о склеры проистекает главным образом из первой половины 20 - ^го века. В то время, исследователи изучали анатомию сосудистую систему, главным образом , с помощью тушью инъекций ¹² и сосудистая литье ^13-15. Позже он был исследован в ангиографических исследований ^16-19.

С тех пор старые методы были улучшены, а новые были разработаны, которые позволили нам дополнить предыдущую анатомических знаний. Например, это только было около десяти лет , так как у нас были такие надежные маркеры лимфатическую как лимфатический эндотелий сосудов специфические гиалуронана рецептора-1 (LYVE1) ²⁰ или podoplanin ^21. Конфокальной микроскопии предлагает новые возможности для изучения анатомических особенностей различных тиОПРОСЫ глаза. Это позволяет несколько пятен, которые будут использоваться для дифференциации маркеров клеток или для локализации клеток по отношению к кровеносных сосудов и других анатомических структур. Это дает обзор, когда образец имеет больший размер и позволяет сканировать через образец, когда в поисках определенного типа клеток. С Z-Stack технологии, конфокальной микроскопии могут быть использованы для образцов до 100-200 мкм. Склеры отличается толщиной от 0,3 мм позади мышечных вставок и 1 мм на заднем полюсе ^11. Благодаря своей толщине, так и непрозрачности, склеры не подходит для конфокальной микроскопии с использованием традиционных методов.

Чтобы исправить это, склеры ткани ламинируют, чтобы для их анализа с конфокальной микроскопии. Эта технология полезна для получения лучшего понимания как физиологических и патологических ситуаций в человеческом склеры.

протокол

Использование тканей человека должны быть рассмотрены и одобрены институциональным наблюдательным советом или эквивалент. Работа, описанная здесь, была одобрена местным комитетом по этике и получили одобрение на научной экспертизы. Эта работа была выполнена в соответствии с Хельсинской декларацией. Склеры образцы человека были получены от глаз доноров проходных (максимум посмертного время 24 часа в сутки) в Банке Глаз департамента офтальмологии Университета Кельна, Германия.

1. Экспериментальная подготовка

1. Готовят 96% этанола и забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), в различных трубах. Подготовка первичных антител в рекомендуемом разведении ФБС, содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и держать все решения на льду. Подготовьте 100 мкл на образце.
2. Очистите все инструменты и использовать острые скальпели. После повторной резки с тем же скальпелем, изменить скальпель.
3. Получить 1-2 Colibri щипцы, прямые микро рассекает ножницы, скальпель # 10или офтальмологического скальпеля микро перо, и четыре 26 G иглы.
4. Оберните алюминиевой фольги вокруг полистирольной пластины или использовать пробковую пластину для прикрепления ткани. Работа под бинокулярным микроскопом стерео. Работа стерильными под ламинарного потока воздуха при необходимости.

2. Подготовить склеры

1. Придерживая лампу и выполнить перфоратора трепанацию на корнеосклеральный части, а затем вращайте Трепан. Поверните Трепан тщательно и равномерно на поверхность, чтобы выполнить одинаково круглый разрез. Используйте Трепан размером 15,5 мм. Нарезать оставшиеся вложения с изогнутыми ножницами. Удалите корнеосклеральный трепанацию. Это приведет к кпереди открылась колбой.
   1. Поместите склеры на тампоном с открытой частью вверх. Удалить сетчатку и сосудистой оболочки, используя Colibri щипцов, чтобы снять оба слоя (сетчатка и сосудистая оболочка глазного яблока) из склеры. Не оставляйте пигментированной сосудистой оболочки на внутренней склеры. Используйте изогнутые ножницы, чтобы удалить сетчатку и сосудистой оболочки от сосочка. Удалите бэрAining конъюнктивы, мышцы глазного яблока, и капсула теноново от поверхностного склеры.
2. Удалить склеры образец в требуемого размера с помощью ножниц прямого типа и CoLibri щипцов. Возьмите около 2 см ² размера склеры образцы из разных мест. Из-за небольшого размера, удерживая склеры аккуратно и вырезать необходимый размер в виде квадратов, используя ножницы прямого типа. Корнеосклеральный трепанацию определяет переднего края склеры образцов.
   1. Избегайте повторного захвата с пинцетом, как область, где ткань схватился не подходит для анализа конфокальной микроскопии. Подготовьте необходимое количество образцов в зависимости от типа эксперимента (например , кпереди против кзади, сравните рисунок 1) и количество антител , используемых.
3. Поместите образцы в 1,5 мл пробирки для последующего использования. Закрепить образцы в 1,5 мл 96% этанола в течение 15 мин, а затем промывают их три раза каждые 5 минв 1,5 мл PBS на шейкере. При работе с замороженной ткани, выполнить этот шаг перед оснастке замораживания.
4. Используйте чистую ткань. Однако, если это не представляется возможным, оснастки заморозить склеры в жидком азоте и хранить его при температуре -20 ° C для дальнейшего использования. При работе с замороженной ткани, оттепель перед использованием. Избегайте повторного оттаивания и замораживания циклов.
5. Хранить каждую пробу в PBS, содержащем 1,5 мл 5% БСА при комнатной температуре в течение 2 часов. Этот шаг вызывает набухание образца, который полезен для ламинирование, а также предотвращает неспецифическое связывание.
6. После того, как образцы опухли, готовят склеры квадратов для ламинирования. Работа под микроскопом, например , бинокулярный стерео микроскоп. Наклейте задние склеры образцы к полистирольной мембраны, завернутые в алюминиевую фольгу или пробковой пластины с использованием 26 G иглы.
7. Согните края иглы, чтобы они не мешали поля зрения под микроскопом.
8. Ламинат полной толщины склеры SAMPле.
   1. Во-первых, удерживать передний край склеры с помощью Colibri щипцов. После этого тщательно тонкий слой поверхностной склере с использованием # 10 скальпель офтальмологические скальпель микро перо или шпателем лезвие. Удерживая скальпель по горизонтали и вырезать поверхностный слой как можно тоньше из нижележащего слоя.
   2. Рассеките тонкий слой склеры из склеры квадрата. Этот метод сравним со стандартными хирургические методы для подготовки лоскута во время трабекулэктомией и должно привести к толстым слоем 30-80 мкм (сравните рисунок 2).
9. Предотвратить высыхание склеры путем добавления небольших количеств PBS в ткани, например , 50 мкл PBS с помощью пипетки.
10. Положите нарезанные слои в 100 мкл PBS в 96 - луночного планшета и маркируют как ориентацию ( по отношению к Экстерн и стажер) и слой (поверхностный и глубокий) , например , с водонепроницаемым цвета.
11. Повторите шаги 2.7-2.9, пока ткань полностью не ламинированными.

3. Выполните иммуногистохимии

1. Добавьте 100 мкл необходимых первичных антител в рекомендуемом разведении. Здесь, например , использование CD - 31 (мышиное моноклональное анти человека) и LYVE1 антитело (кроличье анти человека), и в разведении 1: 100 в PBS (содержащий 2% БСА) и инкубируют при 4 ° С в течение ночи. Для изменения среды в 96-луночный планшет, удерживая пипетку к стенке скважины и удаления жидкости.
2. На следующий день, мыть образцов по три раза в течение 5 мин с 200-300 мкл PBS на шейкере. Добавьте 100 мкл соответствующих вторичных антител; здесь используют козий анти мыши флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и козьи антитела против кроличьих цианиновые красители 3 (Су3) и инкубировать образцов при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Разведите вторичные антитела 1: 300 в PBS, содержащем 2% сыворотки козьего.
3. Промыть образцы снова трижды, каждый раз в течение 5 мин в 200-300 мкл PBS на шейкере.
4. Выполните ядра окрашивания, например , . 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (разведение 1: 2000, 100 мкл в каждую лунку и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре), затем промывают еще раз 2 раза в 200-300 мкл PBS на шейкере.
5. Передача образцов на предметные стекла микроскопа, встраивать их в 1-2 капли флуоресцентного монтажной среды, добавьте покровное, запечатать его, покрывая края прозрачным лаком, и хранят при температуре 4 ° С для последующего использования или непосредственно исследовать слайдам с помощью конфокальной микроскоп.
6. С помощью конфокальной микроскопии (или эквивалент) для анализа образцов. Используйте желаемое увеличение, например , 10-40X увеличения.
7. Чтобы проверить толщину образцов измеряют с помощью конфокальной микроскопии с использованием Z-стеки. Количество возможных склеры секций зависит от расположения склеру, а толщина экваториально и кзади (сравните введение) отличается.

Результаты

В представительных экспериментах, проведенных здесь, существуют доказательства выгоды, получаемые от использования данного конкретного способа ламинирования. Первый эксперимент иллюстрирует разнообразную сеть Эписклеральные сплетение кровеносных сосудов в трех ...

Обсуждение

Ламинирование человеческий склеры способ выполнения конфокальной микроскопии на этой ткани. Важным шагом в этом процессе является использование этанола вместо формалина для прикрепления ткани. По нашему опыту, лучшие результаты получаются при использовании этанола вместо формалин?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24x24mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a