التصور الأوعية الدموية ومتني التجديد بعد استئصال الكبد الجزئي 70٪ في الفئران العادية

Summary

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

Abstract

تم استخدام الإجراء حقن السيليكون تعديل لرؤية الشجرة الوعائية الكبدية. هذا الإجراء يتكون من حقن في الجسم الحي من مجمع سيليكون، عبر 26 G القسطرة، في المدخل أو الوريد الكبدي. بعد حقن السيليكون، وexplanted الأجهزة وأعد ل-CT الدقيقة (μCT) مسح السابقين فيفو. الإجراء حقن السيليكون يمثل تحديا تقنيا. تحقيق نتيجة ناجحة يتطلب خبرة المجهرية واسعة من الجراح. واحدة من التحديات التي تواجه هذا الإجراء ينطوي على تحديد سعر نضح الكافي لمركب السيليكون. معدل نضح لمركب السيليكون يحتاج إلى تعريف يستند إلى الدورة الدموية للنظام الأوعية الدموية في المصالح. معدل نضح غير لائق يمكن أن يؤدي إلى نضح غير مكتمل، تمدد الاصطناعي وتمزق الأشجار الأوعية الدموية.

واستند إعادة الإعمار 3D للنظام الأوعية الدموية في الأشعة المقطعية وتحقيقه باستخدامبرنامج ما قبل السريرية مثل HepaVision. نوعية الشجرة الوعائية التي أعيد بناؤها له علاقة مباشرة بنوعية نضح السيليكون. حسبت المعلمات الأوعية الدموية حسابها لاحقا إرشادية للنمو الأوعية الدموية، مثل إجمالي حجم الأوعية الدموية، استنادا إلى إعادة ترميم الأوعية الدموية. المتناقضة الشجرة الوعائية مع سيليكون يسمح لاحق النسيجي متابعة العمل من العينة بعد μCT المسح. العينة يمكن أن تخضع لباجتزاء المسلسل، والتحليل النسيجي وكله مسح الشرائح، وبعد ذلك لإعادة الإعمار 3D من الأشجار الأوعية الدموية على أساس الصور النسيجية. هذا هو الشرط الأساسي للكشف عن الأحداث الجزيئية وتوزيعها فيما يتعلق الشجرة الوعائية. ويمكن أيضا أن هذا الإجراء حقن السيليكون تعديل استخدامها لتصور وإعادة بناء أنظمة الأوعية الدموية من الأجهزة الأخرى. هذه التقنية لديها القدرة على أن تطبق على نطاق واسع في الدراسات المتعلقة تشريح الأوعية الدموية والنمو في مختلف حيوانالثاني نماذج المرض.

Introduction

وغالبا ما يحدد الكبد تجديد عن طريق قياس زيادة الوزن الكبد والحجم، من خلال تقييم معدل انتشار الكبدية ^16. ومع ذلك، وتجديد الكبد تحملها ليس فقط تجديد متني ولكن أيضا تجديد الأوعية الدموية ^6. ولذلك، ينبغي مواصلة التحقيق في نمو الأوعية الدموية فيما يتعلق بدورها في تطور تجديد الكبد. تصور من الأوعية الدموية الكبدية أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لتجديد الأوعية الدموية. وقد وضعت وسائل غير مباشرة عديدة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد الأوعية الدموية الكبدية. تقليديا، والكشف عن السيتوكينات (عامل النمو البطاني الوعائي، VEGF) ^14، كانت كيموكينات ومستقبلاتها (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) ⁴ الدعامة الأساسية لدراسة تجديد الأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن نموذج 3D جنبا إلى جنب مع التحليل الكمي من الأوعية الدموية إضافة التشريحية الحرجةالمعلومات للحصول على فهم أفضل للعلاقة هامة بين متني كبدي وتجديد الأوعية الدموية.

لتصور الأوعية الدموية الكبدية، الأمر الذي يتطلب المتناقضة الأشجار الأوعية الدموية، تم حقن الفئران مع وكيل النقيض من مطاط السيليكون ظليل للأشعة مباشرة إلى البوابة أو الكبد شجرة الأوعية الدموية الوريدية. بعد البلمرة من السيليكون وexplantation من الجهاز، تعرض عينات الكبد لμCT المسح الضوئي باستخدام ماسح التصوير المقطعي. وأسفرت عمليات المسح في تمثيل صورة فوكسل من السيليكون حقن عينات ^9.

لمراقبة الجودة، وتصور نظام الأوعية الدموية لأول مرة في 3D باستخدام برنامج ما قبل السريرية. تم تنفيذ التقسيم من خلال تحديد عتبة بين كثافة الأنسجة اللينة وكثافة السفينة. وقد تصور قناع سفينة الناتجة باستخدام جعل السطح. يسمح البرنامج أيضا لتحديد اليدوي للمعلمتين من vasculنمو AR: طول السفينة القصوى ونصف قطرها.

ثم استخدام برنامج ما قبل السريرية لإعادة الإعمار 3D من الأشجار الأوعية الدموية وحساب لاحق من توريد أو تجفيف الأراضي الوعائية ^13. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البرنامج تحدد تلقائيا المعلمات معينة من نمو الأوعية الدموية، مثل الطول الإجمالي لجميع الهياكل الأوعية الدموية مرئية المعروف أيضا باسم مجموع طول حافة أو إجمالي حجم السفينة.

تم تنفيذ الإجراء سيليكون نضح في الفئران ساذجة وفي الفئران التي خضعت 70٪ استئصال الكبد الجزئي (PH). تم جمع كبد في مختلف نقاط وقت الملاحظة بعد الاستئصال الجزئي لتحليل الأوعية الدموية ومتني تجديد الكبد باستخدام التصور وتقدير التقنية المذكورة آنفا.

الأهداف الرئيسية لهذا الفيلم هي: (1) إظهار الحساسة حقن التقنية اللازمة لتحقيق المتناقضة الأمثل و(2) عرض محتمل الاب الفوائد الناتجة عن ذلكام تحليلا مفصلا للعينة الناتجة باستخدام μCT وأقسام مسلسل النسيجية. بعد مشاهدة هذا الفيلم، يجب أن يكون القارئ على فهم أفضل لكيفية حقن مركب السيليكون في نظام الأوعية الدموية محددة وللفائدة وتطبيق هذه التقنية.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات التي كتبها THÜRINGER Landesamt FÜR Verbraucherschutz أبتيلونغ Tiergesundheit اوند Tierschutz، ألمانيا. لأنه تصور الجهاز الوريدي البابي بشكل منفصل عن الجهاز الوريدي الكبدي، هناك حاجة الحيوانات منفصلة للأشجار الأوعية الدموية المختلفة.

1. الكواشف إعداد

1. حل الهيبارين المالحة
   1. إضافة 0.1 مل الهيبارين إلى 10 مل المالحة (5 وحدة دولية / مل).
2. سيليكون خليط مركب
   1. إضافة 2 مل MV-120 في واحد أنبوب 5 مل. تمييع MV-120 وذلك بإضافة 3 مل MV مخفف مما أدى إلى حل 40٪.

2. البوابة ريدي نظام سيليكون حقن

1. البطن
   1. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير وتخدير مع 2٪ الأيزوفلورين و 0.3 لتر / دقيقة الأكسجين.
   2. إصلاح الماوس مخدرة على طاولة العمليات باستخدام الشريط مع استنشاق المتواصل من 2٪ هيoflurane و 0.3 لتر / دقيقة الأكسجين. تحقق من أخمص القدمين قرصة الانسحاب المنعكس من الفأرة والبدء في عملية إذا كان رد الفعل غائب.
   3. جعل شق عرضي على البطن باستخدام مقص لطبقة الجلد ومخثار الكهربائية للطبقة العضلات. خروج الأمعاء إلى الجانب الأيسر باستخدام نصائح القطن، وتغطي الأمعاء بمحلول ملحي غارقة الشاش.
2. القسطرة الإدراج
   1. تشريح الوريد البابي تحت المجهر باستخدام ملقط-الصغيرة. مكان واحد 6-0 خياطة الحرير تحت الوريد البابي خارج الكبد، في حوالي مسافة 1 ملم إلى التشعب وادراك التعادل فضفاضة لاستخدامها لاحقا.
   2. حقن استعداد حل الهيبارين المالحة عبر القضيب الوريد (الذكور) أو الوريد الأجوف السفلي (أنثى) لتنقص النظامية لمدة 5 دقائق.
   3. إدراج عيار 26 (26 G) القسطرة مع إبرة في الوريد البابي واصلاحها مع المشبك
3. من الهيبارين المالحة حل ومجمع سيليكون نضح
   1. الحمل الهيبارين المالحة سولution في 5 مل حقنة وتشغيل جهاز نضح. ملء القسطرة تماما مع الحل الهيبارين المالحة لتجنب فقاعات الهواء.
   2. وربط أنبوب تمديد لالقسطرة ومعالجتها بإحكام. بدء نضح من الهيبارين المالحة مع معدل نضح من 0.4 مل / دقيقة.
   3. Ligate وضعت قبل خياطة 6-0 الحرير لتحديد ضعف القسطرة ومنع تدفق الدم من الوريد الطحال والوريد المساريقي. Euthanatize الماوس عن طريق استنزاف عن طريق نضح تحت التخدير.
   4. شطف الكبد باستخدام المياه المالحة أثناء إجراء نضح كله من أجل إبقائها رطبة.
   5. إضافة 0.1 مل كيل علاج في أنبوب MV-120. تغيير حقنة الهيبارين المالحة إلى حقنة سيليكون.
   6. بدء نضح سيليكون مع معدل نضح من 0.2 مل / دقيقة لحوالي 1 دقيقة لتعبئتها بشكل مسبق نظام القسطرة وملء النظام الوريد البابي. وقف نضح سيليكون عندما السفن على سطح بدوره الزرقاء.
4. أخذ العينات
   1. حفاظ على الكبد في الموقع الاتحاد الوطني للعمالايل بلمرة سيليكون تماما بعد حوالي 15 إلى 30 دقيقة. تشريح الأربطة التي تربط الكبد والأعضاء المجاورة بعناية للحفاظ على الكبد سليمة. يزدرع الكبد ووضعها في الفورمالين لتثبيت.

3. الوريدي الكبدي نظام سيليكون حقن

1. أداء البطن كما يؤديها في الخطوة 2.1 و فضح مجال المنطوق تماما.
2. القسطرة الإدراج
   1. تشريح الوريد البابي تحت المجهر باستخدام ملقط-الصغيرة. مكان واحد 6-0 خياطة الحرير تحت الوريد البابي خارج الكبد، في حوالي مسافة 1 ملم إلى التشعب وادراك التعادل فضفاضة لاستخدامها لاحقا.
   2. حقن استعداد حل الهيبارين المالحة عبر القضيب الوريد (الذكور) أو الوريد الأجوف السفلي (أنثى) لتنقص النظامية لمدة 5 دقائق.
   3. إدراج واحد 26 G القسطرة (قسطرة 1) مع إبرة في الوريد البابي واصلاحها مع المشبك. إدراج G القسطرة آخر 26 (قسطرة 2) مع إبرة في الوريد الأجوف السفلي واصلاحها مع المشبك.
   4. Ligate فروع الأجوف السفلي الوريد (بما في ذلك الأوردة الكلوية اليمنى واليسرى) ونهايته البعيدة باستخدام 6-0 الاصطناعية، وحيدة، غير ممتص البولي بروبلين خياطة.
3. من الهيبارين المالحة حل ومجمع سيليكون نضح
   1. تحميل حل الهيبارين المالحة في 5 مل حقنة وتشغيل جهاز نضح. ملء القسطرة 1 تماما مع حل الهيبارين المالحة لتجنب فقاعات الهواء. وربط أنبوب تمديد قسطرة 1 واصلاحها بإحكام. بدء نضح من الهيبارين المالحة بمعدل 0.4 مل / دقيقة.
   2. Ligate وضعت قبل خياطة 6-0 الحرير لتحديد ضعف القسطرة ومنع تدفق الدم من الوريد الطحال والوريد المساريقي. Euthanatize الماوس عن طريق استنزاف عن طريق نضح تحت التخدير.
   3. شطف الكبد باستخدام المياه المالحة أثناء إجراء نضح كله من أجل إبقائها رطبة. إضافة 0.1 مل كيل علاج في أنبوب MV-120. صرف الهيبارين مالحة المحاقن مع حقنة سيليكون.
   4. وضع المشبك على suprahepatجيم الوريد الأجوف لعرقلة تدفق الكبد.
   5. قم بتوصيل أنبوب تمديد لقثطار 2 والبدء نضح سيليكون مع معدل نضح من 0.2 مل / دقيقة لحوالي 2 دقيقة للوصول إلى حجم الأوعية الدموية الكبدية موضوعي كما ذكرت. وقف نضح سيليكون عندما السفن على سطح بدوره الزرقاء.
4. أخذ العينات
   1. تشريح الأربطة الكبدية تجنب أي ضرر للكبد. يزدرع الكبد ووضعها في الفورمالين لتثبيت.

4. مايكرو-CT (μCT) الضوئي

لفحص عينة الكبد explanted باستخدام μCT، وهناك حاجة إلى خطوات التالية.

1. أخذ عينة الكبد من الحل التثبيت. وضع الكبد على السرير μCT. وضع السرير μCT مع عينة الكبد في μCT.
2. الحصول topogram قبل بدء عملية الفحص. استخدام subscan واحد للعينة الكبد الصغيرة واثنين subscans لعينات كبيرة.
3. اختر81، بروتوكول CT مع دقة عالية (على سبيل المثال، HQD-6565-390-90). هذا البروتوكول يكتسب 720 التوقعات مع 1032 س 1012 بكسل أثناء دوران واحد كامل مع الوقت المسح من 90 ثانية في شبه المسح الضوئي. بدء المسح الضوئي μCT.

5. أقسام المسلسل النسيجية

1. تضمين عينة الكبد في البارافين ككل بعد μCT المسح. قطع عينة البارافين كلها إلى أقسام 4μm، مما أدى إلى سلسلة من 2000 إلى 2500 أقسام.
2. أقسام وصمة عار مع تقنية تلطيخ المناسبة لتصور الأحداث الجزيئية ذات الأهمية مثل كي-67 كعلامة انتشار وHMGB1 كعلامة من الضرر الدماغية. تحديد تسلسل تلطيخ فيما يتعلق مسألة علمية.
3. استخدام الماسح الضوئي الشرائح كله إلى ترقيم المقاطع الملون.
4. أداء 3D-إعادة بناء شجرة الأوعية الدموية (ق) (مجدية بالفعل) وتصور 3D-توزيع الأحداث الجزيئية فيما يتعلق الشجرة الوعائية (البحوث في التقدم).

النتائج

معايير الجودة

نوعية حقن السيليكون يمكن الحكم بالعين المجردة أثناء العملية. سفن صغيرة على سطح الكبد تملأ تدريجيا مع مجمع الأزرق. إذا لوحظ بنية الأوعية الدموية طبيعية على سطح الكبد، ون?...

Discussion

المتناقضة الشجرة الوعائية عن طريق الحقن سيليكون وμCT المسح تم تقديمها في نماذج ورم ونماذج الأمراض العصبية في كثير من الأحيان لدراسة تطور عائية ^5،7،8،10. تم إجراء تحسينات في منهجية حقن السيليكون في هذه الدراسة لتصور وقياس نمو الأوعية الدموية بعد استئصال الكبد الج?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy