Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen

Zusammenfassung

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

Zusammenfassung

Eine modifizierte Silikoninjektionsverfahren wurde zur Sichtbarmachung des Leber-Gefäßbaum verwendet. Dieses Verfahren bestand aus in-vivo - Injektion der Siliconverbindung, über eine 26 G - Katheter, in das Portal oder Lebervene. Nach Silikon Injektion wurden Organe explantiert und für die Ex-vivo - Mikro-CT (μCT) Scannen vorbereitet. Die Silikon-Injektionsverfahren ist technisch anspruchsvoll. ein erfolgreiches Ergebnis zu erreichen, erfordert umfangreiche mikro Erfahrung des Chirurgen. Eine der Herausforderungen dieses Verfahren beinhaltet die Bestimmung der angemessenen Perfusionsgeschwindigkeit für die Siliconverbindung. Die Perfusionsgeschwindigkeit für die Silicon-Verbindung muss auf der Basis der hämodynamischen des Gefäßsystems von Interesse definiert werden. Unangemessen Perfusionsrate kann zu einer unvollständigen Perfusion, künstliche Dilatation und Ruptur von Gefäßbäumen führen.

Die 3D-Rekonstruktion des Gefäßsystems wurde auf CT-Scans basieren und wurde erreicht unter Verwendung vonpräklinische Software wie HepaVision. Die Qualität des rekonstruierten Gefäßbaum wurde direkt auf die Qualität des Silicon-Perfusions verwandt. Anschließend berechnet Gefäßparameter indikativ für Gefäßwachstum, wie Gesamtgefäßvolumen, wurden basierend auf den vaskulären Rekonstruktion berechnet. Kontras den Gefäßbaum mit Silikon für die anschließende histologische Aufarbeitung der Probe nach μCT Scannen erlaubt. Die Probe kann auf Serienschnitt, histologische Analyse und ganze Dia Scan unterzogen werden, und danach auf 3D-Rekonstruktion der Gefäßbäume basierend auf histologischen Bildern. Dies ist die Voraussetzung für die Erkennung von molekularen Ereignissen und deren Verteilung in Bezug auf den Gefäßbaum. Dieses modifizierte Silikoninjektionsverfahren können auch die Gefäßsysteme anderer Organe zu visualisieren und zu rekonstruieren, verwendet werden. Diese Technik hat das Potenzial, umfassend Studien angewendet werden Gefäßanatomie über und Wachstum in verschiedenen Tier and Krankheitsmodelle.

Einleitung

Leberregeneration wird durch Messen der Zunahme des Lebergewichts und Volumens und durch die Bewertung der Hepatozyten Proliferationsrate ¹⁶ häufig bestimmt. Allerdings ist die Regeneration der Leber nicht nur Parenchymregeneration induziert , sondern auch Gefäßregeneration ^6. Daher sollte Gefäßwachstum weiter in Bezug auf ihre Rolle bei der Progression der Leberregeneration untersucht werden. Visualisierung des Lebergefäßsystems ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis der vaskulären Regeneration voranzutreiben. Zahlreiche indirekte Methoden wurden die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Lebergefäßregeneration zu studieren entwickelt. Traditionell Nachweis von Zytokinen (vascular endothelial growth factor, VEGF) ^14, Chemokine und deren Rezeptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) ⁴ haben die tragende Säule gewesen vaskuläre Regeneration für das Studium. Jedoch zusammen ein 3D-Modell mit quantitativen Analyse des Gefäßsystems würde hinzufügen kritischen anatomischenInformationen ein besseres Verständnis für die wichtige Beziehung zwischen Leberparenchyms und Gefäßregeneration zu gewinnen.

Um die hepatische Gefäßsystem sichtbar zu machen, die die vaskuläre Bäume erfordert kontras wurden Mäuse mit einem strahlenundurchlässigen Silikonkautschuk Kontrastmittel direkt in das Portal oder hepatische venöse Gefäßbaum injiziert. Nach der Polymerisation des Silikon und Explantation des Organs, wurden die Leberproben zu μCT Abtastung unterworfen, um ein CT-Scanner. Die Scans ergaben in Voxel-Bilddarstellungen des silikonInjektionsProben ^9.

Für die Qualitätskontrolle wurde das Gefäßsystem zunächst in 3D mit präklinischen Software visualisiert. Die Segmentierung erfolgt durch Setzen einer Schwelle zwischen dem weichen Gewebe Intensität und der Gefäß Intensität durchgeführt. Die sich ergebende Gefäß Maske wurde unter Verwendung von Oberflächendarstellung visualisiert. Die Software auch für die manuelle Bestimmung von zwei Parametern von vascul erlaubtar Wachstum: maximale Schiffslänge und Radius.

Eine präklinische Software wurde dann zur 3D - Rekonstruktion von Gefäßbäumen und die anschließende Berechnung der Lieferung oder Trockenlegung Gefäßterritorien ¹³ verwendet. Darüber hinaus bestimmt dieses Software automatisch bestimmte Parameter der Gefäßwachstum, wie beispielsweise die Gesamtlänge aller sichtbaren Gefäßstrukturen auch als die Gesamtkantenlänge oder Gesamtbehältervolumen bekannt.

Die Silikon-Perfusions-Verfahren wurde in naiven Mäusen und in Mäusen durchgeführt, die 70% partielle Hepatektomie (PH) unterzog. Die Lebern wurden zur Analyse von Gefäß- und parenchymalen Leberregeneration bei unterschiedlichen Beobachtungszeitpunkten nach der Resektion gesammelt, um die oben genannten Visualisierung und Quantifizierung Technik.

Die Hauptziele dieses Films sind: (1) erforderlich, um die empfindlichen Spritztechnik zeigen eine optimale Kontrastierung zu erreichen, und (2) zeigen den möglichen Nutzen daraus resultierende from eine detaillierte Analyse der erhaltenen Probe μCT und histologischen Schnittserien mit. Nachdem sie diesen Film sehen, sollte der Leser ein besseres Verständnis dafür, wie Silicon-Verbindung in einem bestimmten Gefäßsystem und von der Nützlichkeit und Anwendbarkeit der Technik zu injizieren.

Protokoll

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Bundesrepublik Deutschland. Da die Pfortader-System wurde getrennt von der Leber-venösen System sichtbar gemacht, getrennte Tiere wurden für die verschiedenen Gefäßbäumen benötigt.

1. Reagenzien Vorbereitung

1. Heparin-Kochsalzlösung
   1. 0,1 ml Heparin in 10 ml Kochsalzlösung (5 IU / ml).
2. Silikon-Verbindungsmischung
   1. 2 ml MV-120 in ein 5-ml-Tube. Verdünnte MV-120 durch Zugabe von 3 ml MV Verdünnungsmittel, was zu einer 40% igen Lösung.

2. Pfortader-System-Silikon-Einspritzung

1. Laparotomie
   1. Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie Induktionskammer und betäuben sie mit 2% Isofluran und 0,3 l / min Sauerstoff.
   2. Befestigen Sie den narkotisierten Maus auf dem Operationstisch mit kontinuierlicher Inhalation mit Klebeband von 2%oflurane und 0,3 l / min Sauerstoff. Überprüfen Sie die Zehen Prise Rückzug Reflex der Maus und starten Sie den Betrieb, wenn der Reflex fehlt.
   3. Machen Sie einen Quereinschnitt auf den Bauch einer Schere für die Hautschicht und einer elektrischen Koagulator für die Muskelschicht verwendet wird. Bewegen Sie heraus den Darm auf die linke Seite mit Baumwollspitzen und decken den Darm mit Kochsalzlösung getränkten Gaze.
2. Einführkatheter
   1. Präparieren Pfortader unter dem Mikroskop mit Mikro-Pinzette. Legen Sie eine 6-0 Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader, in etwa 1 mm Abstand zu seiner Gabelung und binden Sie es locker für die spätere Verwendung.
   2. Spritzen Sie bereit Heparin-Kochsalzlösung über Penis-Vene (männlich) oder untere Hohlvene (weiblich) für die systemische Heparinisierung für 5 min.
   3. Legen Sie die 26-Gauge (26 G) Katheter mit Nadel in Pfortader und fixieren Sie es mit einer Klammer
3. Heparin-Kochsalzlösung und Silikon-Verbindung Perfusion
   1. Laden Heparin-Kochsalzlösung Solution in 5-ml-Spritze und schalten Sie die Perfusion Gerät. Füllen Sie den Katheter vollständig mit Heparin-Kochsalzlösung Luftblasen zu vermeiden.
   2. Schließen Sie das Verlängerungsrohr mit dem Katheter und befestigen Sie sie fest. Starten Sie Heparin-Kochsalzlösung Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,4 ml / min.
   3. Ligat vorplatzierte 6-0 Seidennaht für die doppelte Katheter Fixierung und den Blutfluss aus Milzvene und mesenterica blockieren. Euthanatize die Maus durch Ausbluten über die Perfusion unter Narkose.
   4. Spülen Sie die Leber während der gesamten Perfusion, um es feucht zu halten mit Kochsalzlösung.
   5. 0,1 ml Mittel in die MV-120 Rohr aushärtet. Ändern Sie Heparin-Kochsalzspritze Silikonspritze.
   6. Starten Sie Silikon-Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,2 ml / min für ca. 1 min das Kathetersystem zu prefill und die Pfortader-System zu füllen. Stoppen Sie Silikon-Perfusion, wenn die Gefäße auf der Oberfläche blau.
4. Sampling
   1. Halten Sie die Leber in situ until das Silikon wird nach ca. 15 bis 30 min vollständig polymerisiert. Präparieren Bänder Leber und benachbarte Organe sorgfältig Verbindungs ​​Leber intakt zu halten. Explantat die Leber und steckte es in Formalin-Fixierung.

3. Lebervenensystem Silikon-Einspritzung

1. Führen Sie Laparotomie als vollständig in Schritt 2.1 und setzen Operationsfeld durchgeführt.
2. Einführkatheter
   1. Präparieren Pfortader unter dem Mikroskop mit Mikro-Pinzette. Legen Sie eine 6-0 Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader, in etwa 1 mm Abstand zu seiner Gabelung und binden Sie es locker für die spätere Verwendung.
   2. Spritzen Sie bereit Heparin-Kochsalzlösung über Penis-Vene (männlich) oder untere Hohlvene (weiblich) für die systemische Heparinisierung für 5 min.
   3. Legen Sie eine 26 G-Katheter (Katheter 1) mit Nadel in Pfortader und befestigen Sie ihn mit einer Klemme. Legen Sie eine andere 26 G-Katheter (Katheter 2) mit der Nadel in der unteren Hohlvene und fixieren Sie es mit einer Klammer.
   4. Ligieren die Zweige der unteren Hohlvene (einschließlich linke und rechte Nierenvenen) und seinem distalen Ende mit 6-0 synthetischen, Monofilament, nicht-resorbierbaren Polypropylen Naht.
3. Heparin-Kochsalzlösung und Silikon-Verbindung Perfusion
   1. Laden Heparin-Kochsalzlösung in 5-ml-Spritze und schalten Sie die Perfusion Gerät. Füllen Katheter 1 vollständig mit Heparin-Kochsalzlösung, um Luftblasen zu vermeiden. Schließen Sie das Verlängerungsrohr zu Katheter 1 und befestigen Sie es fest. Beginnen Heparin-Kochsalzlösung Perfusion mit einer Rate von 0,4 ml / min.
   2. Ligat vorplatzierte 6-0 Seidennaht für die doppelte Katheter Fixierung und den Blutfluss aus Milzvene und mesenterica blockieren. Euthanatize die Maus durch Ausbluten über die Perfusion unter Narkose.
   3. Spülen Sie die Leber während der gesamten Perfusion, um es feucht zu halten mit Kochsalzlösung. 0,1 ml Mittel in die MV-120 Rohr aushärtet. Exchange-Heparin-Kochsalzlösung Spritze mit Silikonspritze.
   4. Legen Sie eine Klemme an der suprahepatic inferior vena cava den Abfluss von der Leber zu behindern.
   5. Schließen Sie das Verlängerungsrohr 2 mit dem Katheter und Silikon-Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,2 ml / min für ca. 2 min eine objektive Lebergefäßvolumen zu erreichen, wie berichtet, beginnen. Stoppen Sie Silikon-Perfusion, wenn die Gefäße auf der Oberfläche blau.
4. Sampling
   1. Präparieren Leber Bänder eine Schädigung der Leber zu vermeiden. Explantat die Leber und steckte es in Formalin-Fixierung.

4. Micro-CT (μCT) Scan

Zum Scannen werden die explantiert Leberprobe mit μCT, die folgenden Schritte erforderlich.

1. Nehmen Sie die Leberprobe aus der Fixierungslösung. Legen Sie die Leber auf die μCT Bett. Setzen Sie die μCT Bett mit der Leberprobe in die μCT.
2. Erwerben Sie Topogramm vor dem Scan zu starten. Verwenden Sie eine Nebenabtastrichtung für die kleine Leberprobe und zwei Teilscan für große Proben.
3. Wählen Sie ein81; CT - Protokoll mit einer hohen Auflösung (zB HQD-6565-390-90). Dieses Protokoll erwirbt 720 Projektionen mit 1.032 x 1.012 Pixeln bei einer vollen Umdrehung mit der Scanzeit von 90 Sekunden pro Unterabtastung. Starten Sie den μCT-Scan.

5. Histologische Serienschnitte

1. Einbetten der Leberprobe in Paraffin als Ganzes nach μCT Scannen. Schneiden gesamte Paraffinprobe in 4 um Abschnitte, was zu einer Reihe von 2000 bis 2500 Abschnitten.
2. Stain Abschnitte mit entsprechenden Färbetechnik molekularen Ereignisse von Interesse zu visualisieren, wie Ki-67 als Proliferationsmarker und HMGB1 als Marker für ischämische Schädigung. Bestimmen Sie Reihenfolge der Färbung in Bezug auf wissenschaftliche Frage.
3. Verwenden Sie eine ganze Dia-Scanner die gefärbten Schnitten zu digitalisieren.
4. Führen Sie 3D-Rekonstruktion des Gefäßbaumes (n) (bereits machbar) und visualisieren 3D-Verteilung der molekularen Ereignisse in Bezug auf Gefäßbaum (Forschung im Gange).

Ergebnisse

Qualitätskriterien

Die Qualität der Silikoninjektion kann mit dem bloßen Auge während des Verfahrens beurteilt werden. Die kleinen Schiffe, die auf Leberoberfläche füllen nach und nach mit der blauen Verbindung. Wenn der normale vaskuläre Struktur auf der Leberoberfläche beobachtet wurde, wurde die Siliconkautschukinjektionsqualität gut. Wenn der Perfusionsvolumen unzureichend war, wurden die kleinen ...

Diskussion

Kontras den Gefäßbaum durch Silikon - Injektion und μCT - Scanning wurde ^5,7,8,10 die angiogene Progression häufig zu studieren in Tumormodellen und neurologische Krankheitsmodelle eingeführt. Verbesserungen in der Methodik der Silikoninjektion wurden in der vorliegenden Studie zur Visualisierung und Quantifizierung von vaskulären Wachstums nach partieller Hepatektomie in Mäusen hergestellt.

Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte Aufmerksamkeit benötigen gute Perfusion...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy