ויזואליזציה של התחדשות כלי דם Parenchymal לאחר 70% חלקיות כריתה בעכברים נורמליים

Summary

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

Abstract

הליך הזרקת סיליקון שונה שמש להדמיה של עץ כלי הדם בכבד. הליך זה כלל הזרקה ב- vivo של מתחם סיליקון, באמצעות קטטר 26 G, לתוך הפורטל או הווריד כבד. לאחר הזרקת סיליקון, האיברים היו explanted והכינו לסריקה לשעבר vivo מיקרו-CT (μCT). ההליך הזרקת סיליקון הוא מאתגר מבחינה טכנית. השיג תוצאה מוצלחת דורש ניסיון microsurgical נרחב של המנתח. אחד האתגרים של הליך זה כרוך בקביעת שיעור זלוף ההולם במתחם סיליקון. שיעור זלוף עבור מתחם סיליקון צריך להיות מוגדר על בסיס המודינמי של מערכת כלי הדם של עניין. שיעור זלוף לא ראוי יכול להוביל זלוף שלם, התרחבות מלאכותית פקיעת עצים וסקולרית.

שחזור 3D של מערכת כלי הדם התבסס על בדיקות CT ו הושג באמצעותתוכנת פרה-קלינית כגון HepaVision. איכות עץ כלי הדם המשוחזר הייתה קשורה ישירות לאיכות זלוף סיליקון. בהמשך מחושבים פרמטרים וסקולרית מעידים על צמיחה של כלי דם, כגון נפח כלי דם הכולל, חושבו על בסיס השחזורים וסקולרית. הניגודיות את העץ וסקולרית עם סיליקון מותר לעבודה-אפ היסטולוגית עוקב של הדגימה לאחר סריקת μCT. הדגימה יכולה להיות נתונה חתך סדרתי, ניתוח היסטולוגית וסריקה השקופית כולה, ולאחר מכן כדי שחזור 3D של העצים וסקולרית המבוססת על תמונות היסטולוגית. זהו התנאים ההכרחיים לצורך זיהוי של אירועים מולקולריים והפצתי ביחס עץ כלי הדם. הליך להזרקת סיליקון שונה זה יכול לשמש גם כדי לחזות לשחזר את מערכות כלי הדם של איברים אחרים. טכניקה זו יש פוטנציאל להיות מיושם באופן נרחב כדי מחקרים לגבי האנטומיה של כלי הדם וצמיחה בתוך בעלי חיים שוניםמודלים המחלה nd.

Introduction

התחדשות כבדה לעתים קרובות נקבעת על ידי מדידת העלייה במשקל כבד נפח על ידי בחינה של קצב התפשטות hepatocyte ^16. עם זאת, התחדשות כבדה אינה רק גרימת התחדשות parenchymal אבל גם ⁶ התחדשות כלי דם. לכן, צמיחה של כלי דם צריכה להיחקר נוסף באשר לתפקידה בהתקדמות של התחדשות כבדה. ויזואליזציה של מערכת כלי דם בכבד היא קריטית לקידום הבנתנו התחדשות כלי דם. רבים בשיטות עקיפות פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התחדשות כלי הדם בכבד. באופן מסורתי, זיהוי של ציטוקינים (פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם, VEGF) ^14, כמוקינים ואת הקולטנים שלהם (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) ⁴ היו עמוד התווך ללימוד התחדשות כלי הדם. עם זאת, מודל 3D יחד עם ניתוח כמותי של כלי הדם יוסיף אנטומיים קריטימידע כדי להשיג הבנה טובה יותר של מערכת היחסים החשובים בין parenchymal הכבד והתחדשות כלי דם.

כדי להמחיש את מערכת כלי דם בכבד, מחייב מנוגדי העצים וסקולרית, עכברים הזריקו חומר ניגוד גומי סיליקון radiopaque ישירות לתוך הפורטל או עץ כלי דם מוריד בכבד. לאחר פילמור של סיליקון explantation של האיבר, הדגימות הכבדות היו נתוני סריקת μCT באמצעות סורק CT. הסריקות הביאו ייצוגי תמונת voxel של הזרקת סיליקון דגימות ^9.

עבור בקרת איכות, מערכת כלי הדם הייתה מדמיין הראשון 3D באמצעות תוכנת פרה-קלינית. פילוח בוצע על ידי קביעת סף בין עוצמת רקמות הרכה לבין עוצמת הכלי. מסכת הכלי וכתוצאה מכך הייתה דמיינה באמצעות טיוח משטח. התוכנה אפשרה גם זיהוי ידני של שני פרמטרים של vasculצמיחת ar: Vessel אורך מקסימאלי ורדיוס.

תוכנת פרה-מכן שמשה שחזור 3D של עצים וסקולרית והחישוב הבא של השטחים וסקולרית באספקה ​​או ניקוז ^13. בנוסף, תוכנה זו באופן אוטומטי נקבעה פרמטרים מסוימים של צמיחה של כלי דם, כגון האורך הכולל של כל המבנים וסקולרית הגלויים הידוע גם בשם אורך הקצה המוחלט או נפח כלי כולל.

הליך סיליקון זלוף בוצע בעכברים נאיביים בעכברים שעברו 70% כריתה חלקית (PH). כבד נאספו בנקודות שונות מדידה לאחר כריתה לניתוח ההתחדשות כבדה של כלי דם ואת parenchymal בטכניקה להדמיה וכימות הנ"ל.

המטרות העיקריות של הסרט הזה הן: (1) להדגים את טכניקת ההזרקה העדינה נדרשה להשיג מנוגדים אופטימליים (2) הצגת תרומה האפשרית כתוצאת frאום ניתוח מפורט של הדגימה וכתוצאה מכך באמצעות μCT וחתכים סדרתי היסטולוגית. לאחר הצפייה בסרט זה, הקורא צריך להיות בעל הבנה טובה יותר של כיצד להזריק תרכובת סיליקון לתוך מערכת כלי דם ספציפית של תועלת תחולתה של הטכניקה.

Protocol

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz ה"אבטיילונג" Tiergesundheit und Tierschutz, גרמניה. מכיוון וריד השער היה דמיין בנפרד ממערכת ורידי הכבד, חיות נפרדות דרושי העצים וסקולרית השונים.

1. ריאגנטים כן

1. פתרון הפרין-מלוחה
   1. להוסיף 0.1 מ"ל הפרין לתוך מלוחים 10 מ"ל (5 IU / ml).
2. תערובת תרכובת סיליקון
   1. הוסף 2 מ"ל MV-120 בצינור אחד 5 מ"ל. לדלל MV-120 על ידי הוספת diluent 3 מ"ל MV וכתוצאה מכך פתרון 40%.

2. הזרקת סיליקון מערכת פורטל הוורידים

1. פיום
   1. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה לטשטש את זה עם 2% isoflurane ו 0.3 L / min חמצן.
   2. תקן את העכבר מורדם על שולחן הניתוחים באמצעות קלטת עם שאיפה מתמדת של 2% הםoflurane וחמצן 0.3 ליטר / דקה. בדוק את רפלקס נסיגה הבוהן קמצוץ של העכבר ולהתחיל במבצע אם רפלקס נעדר.
   3. ביצוע חתך רוחבי על הבטן באמצעות מספריים עבור שכבת העור וכן coagulator חשמלי עבור שכבת השריר. הזז את המעיים אל הצד השמאלי באמצעות טיפי כותנה ולכסות את המעיים עם גזה מלוחה ספוג.
2. החדרת צנתר
   1. לנתח וריד השער תחת מיקרוסקופ באמצעות מיקרו-מלקחיים. מניחים תפר משי אחד 6-0 מתחת וריד שער extrahepatic, מרחק כ 1 מ"מ עד הסתעפות שלה ולקשור אותו באופן רופף לשימוש מאוחר יותר.
   2. להזריק פתרון הפרין-מלוח מוכן באמצעות וריד פין (זכר) או וריד נבוב נח (נקבה) עבור heparinization המערכתית במשך 5 דקות.
   3. הכנס את מד 26 (26 G) קטטר עם מחט לווריד פורטל ולתקן אותה עם מלחציים
3. הפרין-מלוח פתרון זלוף סיליקון תרכובת
   1. סול הפרין-מלוח טעןution ב מזרק 5 מ"ל ולהדליק המכשיר זלוף. מלאו את הקטטר מלא עם פתרון הפרין-מלח כדי למנוע בועות אוויר.
   2. חבר צינור רחבת הקטטר ולתקן אותם בחוזקה. התחל זלוף מלוחים הפרין עם שיעור זלוף של 0.4 מ"ל / דקה.
   3. תפר משי מראש להציב ולקשור 6-0 בכפול לתקן את הקטטר וחסימת זרימת הדם מן הווריד הטחול וריד mesenteric. Euthanatize את העכבר על ידי exsanguination דרך זלוף בהרדמה.
   4. יש לשטוף את הכבד באמצעות מי מלח במהלך ההליך זלוף כולו כדי לשמור אותו לח.
   5. להוסיף 0.1 מ"ל סוכן ריפוי לתוך הצינור MV-120. שנת מזרק מלוח הפרין כדי מזרק סיליקון.
   6. התחל זלוף סיליקון עם שיעור זלוף של 0.2 מ"ל / דקה במשך כ 1 דקות כדי ולמלא מראש את מערכת קטטר וכדי למלא את מערכת וריד השער. עצור זלוף סיליקון כאשר הכלי על המשטח להכחיל.
4. דְגִימָה
   1. שמור את הכבד in-situ until הסיליקון הוא polymerized מלא לאחר כ 15 עד 30 דקות. לנתח רצועות חיבור כבד ואיברים סמוכים בזהירות כדי לשמור כבד פגע. Explant הכבד והכניס אותו לתוך פורמלין עבור קיבעון.

3. הזרקת סיליקון מערכת הוורידים כבדיה

1. בצע laparotomy כפי שבוצעה בשלב 2.1 ולחשוף שדה הניתוח באופן מלא.
2. החדרת צנתר
   1. לנתח וריד השער תחת מיקרוסקופ באמצעות מיקרו-מלקחיים. מניחים תפר משי אחד 6-0 מתחת וריד שער extrahepatic, מרחק כ 1 מ"מ עד הסתעפות שלה ולקשור אותו באופן רופף לשימוש מאוחר יותר.
   2. להזריק פתרון הפרין-מלוח מוכן באמצעות וריד פין (זכר) או וריד נבוב נח (נקבה) עבור heparinization המערכתית במשך 5 דקות.
   3. הכנס אחד 26 G קטטר (צנתר 1) עם מחט לווריד פורטל ולתקן אותה עם מהדק. הכנס 26 אחר קטטר G (קטטר 2) עם מחט לתוך וריד נבוב נח ולתקן אותה עם מלחציים.
   4. ולקשור את ענפי וריד נבוב נח (כוללים ורידי כליות שמאל וימין) ואת הקצה הדיסטלי שלה באמצעות 6-0 סינטטי, monofilament, תפר פוליפרופילן nonabsorbable.
3. הפרין-מלוח פתרון זלוף סיליקון תרכובת
   1. טען תמיסת מלח-הפרין מזרק 5 מ"ל ולהדליק המכשיר זלוף. מלאו קטטר 1 לחלוטין עם פתרון הפרין-מלח כדי למנוע בועות אוויר. חבר צינור רחב קטטר 1 ולתקן אותה בחוזקה. התחל זלוף מלוחים הפרין בשיעור של 0.4 מ"ל / דקה.
   2. תפר משי מראש להציב ולקשור 6-0 בכפול לתקן את הקטטר וחסימת זרימת הדם מן הווריד הטחול וריד mesenteric. Euthanatize את העכבר על ידי exsanguination דרך זלוף בהרדמה.
   3. יש לשטוף את הכבד באמצעות מי מלח במהלך ההליך זלוף כולו כדי לשמור אותו לח. להוסיף 0.1 מ"ל סוכן ריפוי לתוך הצינור MV-120. שער הפרין מלוח מזרק עם מזרק סיליקון.
   4. מניחים מהדק על suprahepatic נחות וריד נבוב להכשיל את היצוא של הכבד.
   5. חבור את הצינור הרחב קטטר 2 ולהתחיל זלוף סיליקון עם שיעור זלוף של 0.2 מיליליטר / דקה במשך כ 2 דקות כדי להגיע נפח כלי דם בכבד אובייקטיבי כפי שדווח. עצור זלוף סיליקון כאשר הכלי על המשטח להכחיל.
4. דְגִימָה
   1. לנתח רצועות כבדות להימנע מכל פגיעה בכבד. Explant הכבד והכניס אותו לתוך פורמלין עבור קיבעון.

סריקה 4. Micro-CT (μCT)

כדי לסרוק המדגם הכבד explanted באמצעות μCT, השלבים הבאים נדרשים.

1. קח המדגם הכבד מתוך פתרון הקיבעון. מניחים את הכבד על המיטה μCT. שים את המיטה μCT עם המדגם הכבד לתוך μCT.
2. רוכשת topogram לפני תחילת הסריקה. השתמש subscan אחד למדגם הכבד הקטן והשני subscans עבור מדגמים גדולים.
3. בחר81; פרוטוקול CT עם רזולוציה גבוהה (למשל, HQD-6565-390-90). פרוטוקול זה רוכש 720 תחזיות עם 1,032 x 1,012 פיקסלים במהלך סיבוב מלא אחד עם זמן הסריקה של 90 שניות לכל סריקת משנה. התחל את הסריקה μCT.

5. סעיפים סידורי היסטולוגית

1. הטמע את הדגימה הכבדה פרפין בכללותו לאחר סריקת μCT. חותכים מדגם פרפין כולו למקטעים 4μm, והתוצאה היא סדרה של 2,000 עד 2,500 חלקים.
2. סעיפי כתם עם טכניקה מכתימה מתאימה לדמיין אירועים מולקולריים של עניין כגון Ki-67 כסמן התפשטות HMGB1 כסמן של ניזק איסכמי. לקבוע רצף של מכתים בגין לשאלה מדעית.
3. השתמש בסורק שקופיות שלם digitalize בסעיפים המוכתמים.
4. בצע עץ 3D-מחדש של כלי דם (ים) (כבר ריאלי) ולדמיין-הפצת 3D של אירועים מולקולריים בגין לעץ וסקולרית (מחקר בתהליך).

תוצאות

קריטריוני איכות

איכות הזרקת סיליקון אפשר לשפוט בעין בלתי מזוינת במהלך ההליך. הכלי הקטן על פני שטח כבדים למלא בהדרגה עם התרכובת הכחולה. אם מבנה כלי הדם הנורמלי נצפה על פני השטח הכבדים, ?...

Discussion

הניגודיות את עץ כלי הדם על ידי הזרקת סיליקון וסריקה μCT כבר הציג מודלים הגידול ומודלים מחלה נוירולוגית לעתים קרובות כדי ללמוד את התקדמות angiogenic ^5,7,8,10. שיפורים במתודולוגיה של הזרקת סיליקון נעשו במחקר הנוכחי המאפשרים הדמיה לכימות צמיחה של כלי דם לאחר כריתה חלקית ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy