일반 마우스의 70 % 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화

요약

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

초록

변성 실리콘 주입 절차는 간 혈관 트리 시각화 하였다. 이 절차는 포털 또는 간정맥으로, 26 G 카테터를 통해 실리콘 화합물의 생체 내 주입으로 구성되었다. 실리콘 주입 한 후, 기관은 외식하고 전 생체 마이크로 CT (μCT) 스캔 준비했다. 실리콘 주입 과정은 기술적으로 어려운 것이다. 성공적인 결과를 달성하는 것은 외과 의사에서 광범위한 미세 수술 경험이 필요합니다. 이 절차의 과제 중 하나는 실리콘 화합물에 대한 적절한 관류 레이트를 결정하는 것을 포함한다. 실리콘 화합물의 혈류 속도는 관심 혈관계의 혈류 역학에 기초하여 정의 될 필요가있다. 부적절한 관류 속도는 혈관 나무의 불완전 관류, 인공 팽창 및 파열로 이어질 수 있습니다.

혈관 시스템의 3 차원 재구성 CT 스캔을 기반으로하고 사용하여 달성되었다이러한 HepaVision으로 전임상 소프트웨어. 재구성 된 혈관 트리의 품질을 직접 실리콘 관류의 품질과 관련되었다. 이러한 총 혈관의 볼륨으로의 혈관 성장을 표시해서 산출 혈관 파라미터, 혈관 재구성에 기초하여 산출 하였다. μCT 검사 후 시편의 후속 조직 학적 작업 업에 허용 된 실리콘과 혈관 트리를 대조. 시편 직렬 단면 조직 학적 분석 및 전체 슬라이드 스캔을 실시하고, 그 후 학적 영상에 기초한 혈관 나무의 3D 재구성을 할 수있다. 이것은 분자 이벤트 탐지 및 혈관 트리에 대하여, 그 분포를위한 필수 조건이다. 이 변성 실리콘 주입 과정을 시각화 또한 다른 장기의 혈관 시스템을 재구성 할 수있다. 이 기술은 광범위하게 다양한 전위 동물 A의 혈관 해부학 및 성장에 관한 연구에 적용되어야차 질환 모델.

서문

간 재생 종종 간 중량 및 부피의 증가를 측정하여 상기 간세포 증식 속도 ^(16)를 평가함으로써 결정된다. 그러나, 간 재생은 실질 재생뿐만 아니라 혈관 재생 ^(6)을 유도한다뿐만 아닙니다. 따라서, 혈관 성장은 더 간 재생의 진행에서의 역할에 대해 조사해야합니다. 간장 혈관 시스템의 시각화는 혈관 재생에 대한 우리의 이해를 발전에 매우 중요합니다. 다수의 간접 방법 간 혈관 재생의 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었다. 전통적으로, 사이토 카인의 검출 (VEGF 혈관 내피 성장 인자) ¹⁴ 길항 (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12)는 ⁴ 혈관 재생을 연구 대들보왔다. 그러나 혈관의 정량 분석​​과 함께 3 차원 모형 중요한 해부학을 추가정보는 간 실질 혈관 재생의 중요한 관계를 더 잘 이해한다.

혈관 나무 대조 필요 간 혈관계를 시각화 생쥐 직접 포털 또는 간 정맥 혈관 트리에 방사선 불 투과성이 실리콘 고무 조영제 주입 하였다. 실리콘 및 기관의 외식 중합 후 간 샘플을 CT 스캐너를 이용 μCT 스캐닝을 실시한다. 스캔은 복셀 이미지 표현 초래 실리콘 주입 ^9를 표본.

품질 관리, 혈관계 먼저 전임상 소프트웨어를 이용하여 3 차원으로 시각화 하였다. 세분화 연조직 강도와 용기의 강도 사이의 임계 값을 설정하여 수행 하였다. 그 결과 혈관 마스크 표면 렌더링을 사용하여 시각되었습니다. 이 소프트웨어는 또한 vascul의 두 개의 매개 변수를 수동으로 측정을 위해 허용아칸소 성장 : 최대 선박 길이와 반경.

전임상 소프트웨어는 다음 3 차원 혈관 나무 재와, 공급 또는 배출 혈관 영역 ^(13)의 후속하는 계산을 위해 사용 하였다. 또한,이 소프트웨어는 자동적으로 또한 전체 가장자리 길이 또는 총 용기 체적으로 알려진 모든 보이는 혈관 구조의 전체 길이와 같은 혈관 성장의 특정 파라미터를 결정했다.

실리콘 관류 절차 나이브 마우스의 70 % 부분을 절제 (PH)를받은 마우스에서 수행 하였다. 간은 상기 시각화 및 정량화 기술을 이용하여 혈관 및 간 실질 재생을 분석 절제술 후 다른 관찰 시점에서 수집 하였다.

(1) 최적의 대조 및 (2)의 잠재적 이점 얻어진 FR 표시를 달성하기 위해 필요한 섬세한 주입 기법을 설명이 영화의 주요 목표는 다음μCT 및 조직 학적 시리얼 섹션을 사용하여 생성 된 시편의 톰 상세한 분석. 영화를 시청 한 후, 판독기는 특정의 혈관계 내로 기술의 유용성 및 적용 성 실리콘 화합물을 주입하는 방법을 더 잘 이해한다.

프로토콜

동물 주제와 관련된 절차 링거 Landesamt 대 Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit 싶게 Tierschutz, 독일에 의해 승인되었습니다. 포털 정맥 시스템이 간 정맥 시스템과 별도로 가시화 되었기 때문에, 별도의 동물은 다른 혈관 나무를 위해 필요했다.

1. 시약 준비

1. 헤파린 생리 식염수 용액
   1. 10 ㎖의 식염수 (5 IU / ㎖)에 0.1 ml의 헤파린을 추가합니다.
2. 실리콘 화합물의 혼합물을
   1. 한 5 ML 튜브에 2 ml의 MV-120을 추가합니다. 40 % 용액 3 ㎖ 결과 MV 희석제를 첨가하여 MV-120 희석.

2. 포털 정맥 시스템 실리콘 주입

1. 개복술
   1. 마취 유도 챔버에 마우스를 넣고, 2 % 이소 플루 란 0.3 L / 분의 산소를 마취시키다.
   2. 2 %는의 연속 흡입으로 테이프를 사용하여 운영 테이블에 마취 마우스를 수정oflurane 0.3 L / 분 산소. 마우스의 발가락 - 핀치 철수 반사를 확인하고 반사가없는 경우 작업을 시작합니다.
   3. 표피층과 근육층위한 전기 coagulator 용 가위를 이용하여 복부에 횡 절개를. 코튼 팁을 사용하여 왼쪽에 장내를 이동하고 식염수를 적신 거즈로 장을 다룹니다.
2. 카테터 삽입
   1. 마이크로 집게를 사용하여 현미경 포털 정맥을 해부하다. 그 분기에 약 1mm 거리에서, 간외 문맥 아래 하나의 6-0 실크 봉합사를 놓고 나중에 사용하기 위해 느슨하게을 묶어.
   2. 5 분 동안 전신 헤파린에 대한 음경 정맥 (남성)을 통해 제조 된 헤파린 생리 식염수 용액 또는 (여성) 하대 정맥 주입한다.
   3. 포털 정맥에 26 게이지 바늘 (26 G) 카테터를 삽입하고 클램프로 고정
3. 헤파린 염수 용액 및 실리콘 화합물 관류
   1. 로드 헤파린 생리 식염수 졸5 ML의 주사기에서의 ution 및 관류 장치의 전원을 켭니다. 공기 방울을 방지하기 위해 헤파린 식염수로 완전히 카테터를 채운다.
   2. 카테터로 확장 튜브를 연결하고 단단히을 수정합니다. / 분 0.4 ML의 관류 속도 헤파린 생리 식염수 관류를 시작합니다.
   3. 더블 카테터를 고정하고 비장 정맥 및 장간막 정맥에서 혈액의 흐름을 차단하기위한 결찰 사전 배치 6-0 실크 봉합사. 마취 관류를 통해 방혈하여 마우스를 Euthanatize.
   4. 습윤을 유지하기 위해 전체 재관류 과정 중에 염수를 사용하여 간을 헹군다.
   5. 뮤직 비디오-120 튜브에 경화제 0.1 ML을 추가합니다. 실리콘 주사기에 헤파린 생리 식염수 주사기를 변경합니다.
   6. 도관 시스템을 미리 기입하고, 문맥 시스템을 채우기 위해 약 1 분 동안 0.2 ㎖ / 분의 재관류 속도 실리콘 관류 시작. 표면의 혈관이 푸른 켤 때 실리콘 관류를 중지합니다.
4. 견본 추출
   1. 원위치 UNT 간 유지위원장 실리콘은 완전히 후 약 15 분 ~ 30 중합된다. 그대로 간을 유지하기 위해주의 간 및 인접 기관을 연결하는 인대를 해부하다. 간을 이식편 및 고정을 위해 포르말린에 넣어.

3. 간 정맥 시스템 실리콘 주입

1. 단계 2.1에서 수행으로 개복술을 수행하고 완벽하게 작동 필드를 노출.
2. 카테터 삽입
   1. 마이크로 집게를 사용하여 현미경 포털 정맥을 해부하다. 그 분기에 약 1mm 거리에서, 간외 문맥 아래 하나의 6-0 실크 봉합사를 놓고 나중에 사용하기 위해 느슨하게을 묶어.
   2. 5 분 동안 전신 헤파린에 대한 음경 정맥 (남성)을 통해 제조 된 헤파린 생리 식염수 용액 또는 (여성) 하대 정맥 주입한다.
   3. 포털 정맥에 바늘 하나 26 G 카테터 (도관 1)를 삽입하고 클램프로 고정합니다. 하대 정맥에 바늘로 다른 26 G 카테터 (도관 2)를 삽입하고 클램프로 고정.
   4. 6-0 합성, 모노 필라멘트, 비 흡수성 폴리 프로필렌 봉합사를 사용 (왼쪽 및 오른쪽 신장 정맥 포함) 하대 정맥과 그 선단의 가지를 결찰.
3. 헤파린 염수 용액 및 실리콘 화합물 관류
   1. 5 ML의 주사기에 헤파린 생리 식염수 솔루션을로드하고 관류 장치의 전원을 켭니다. 공기 방울을 방지하기 위해 헤파린 생리 식염수 용액으로 완전히 카테터 1을 입력합니다. 카테터 1로 확장 튜브를 연결하고 단단히 고정합니다. / 분 0.4 ML의 속도로 헤파린 생리 식염수 관류를 시작합니다.
   2. 더블 카테터를 고정하고 비장 정맥 및 장간막 정맥에서 혈액의 흐름을 차단하기위한 결찰 사전 배치 6-0 실크 봉합사. 마취 관류를 통해 방혈하여 마우스를 Euthanatize.
   3. 습윤을 유지하기 위해 전체 재관류 과정 중에 염수를 사용하여 간을 헹군다. 뮤직 비디오-120 튜브에 경화제 0.1 ML을 추가합니다. 교환 헤파린 생리 식염수 실리콘 주사기와 주사기입니다.
   4. suprahepat에 클램프를 놓습니다IC에서 하대 정맥은 간의 유출을 방해합니다.
   5. (2) 카테터 및보고 객관적으로 간 혈관 볼륨에 도달하기 위해 약 2 분 동안 0.2 ㎖ / min의 관류 속도 실리콘 관류를 시작합니다 확장 튜브를 연결합니다. 표면의 혈관이 푸른 켤 때 실리콘 관류를 중지합니다.
4. 견본 추출
   1. 간 어떤 부상을 방지 간 인대를 해부하다. 간을 이식편 및 고정을 위해 포르말린에 넣어.

4. 마이크로 CT (μCT) 검색

μCT를 사용하여 외식 간 샘플을 검사하려면 다음 단계가 필요합니다.

1. 고정 솔루션에서 간 샘플을 가져 가라. μCT 침대에 간을 놓습니다. μCT에 간 샘플로 μCT 침대를 넣습니다.
2. 스캔을 시작하기 전에 topogram 획득. 작은 간 샘플에 대한 하나의 서브 스캔 및 대형 샘플이 subscans를 사용합니다.
3. 선택81; 고분해능 CT 프로토콜 (예를 들어,의 HQd-6565-390-90). 이 프로토콜은 부 주사 당 90 초 스캔 시간 하나의 완전한 회전 동안 1032 X 1012 픽셀을 가진 돌출부 (720)를 취득한다. μCT 검사를 시작합니다.

5. 조직 학적 직렬 섹션

1. μCT 검사 후 전체 파라핀에 간 표본을 포함. 2,000 2,500 섹션의 일련의 결과가 4μm 부에 파라핀 전체 샘플을 잘라.
2. 적절한 염색 기술로 얼룩 부분은 허혈성 손상의 마커로 확산 마커 및 HMGB1 같은 기-67와 같은 관심의 분자 이벤트를 시각화합니다. 과학적 질문에 관련하여 염색의 순서를 결정합니다.
3. 스테인드 섹션을 디지털화하기 위해 전체 슬라이드 스캐너를 사용합니다.
4. (이미 가능) 혈관 트리 (들)의 3 차원 재구성을 수행하고 혈관 트리 (진행중인 연구)에 대한 분자 이벤트의 3D 분포를 시각화.

결과

품질 기준

실리콘 주입 품질 절차 중에 육안으로 판단 할 수있다. 간 표면에 작은 혈관 푸른 화합물로 점진적으로 입력합니다. 정상 혈관 구조 간 표면에서 관찰하면, 실리콘 고무 사출 품질이 양호 하였다. 관류 량이 불충분하면, 간 표면에 작은 용기는 완전히 충전되지 않았다. 장기의 표면에 요철 푸른 반점으?...

토론

실리콘 주입 및 μCT 검사에 의한 혈관 트리를 대조하는 혈관 신생 진행 ^5,7,8,10을 연구하기 위해 자주 종양 모델 및 신경 질환 모델에서 도입되었습니다. 실리콘 주입 방법의 개선 시각화 및 마우스에서 부분 간 절제술 후 혈관 성장을 정량화하기위한 본 연구에서 이루어졌다.

관류 좋은 품질을 달성하기 위해주의를 기울여야하는 중요한 단계가 있습니다. 우선 전신 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy