الجمع بين نقرا الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس

Summary

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Abstract

الكشف عن التعبير الجيني في أنواع مختلفة من خلايا الدماغ على سبيل المثال، الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، قليلة التغصن، السلائف دبقية قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن أن تعوق عدم وجود الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية محددة لالمناعية. نحن هنا تصف بروتوكول للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة في قسم المخ نفسه باستخدام مضان مزدوجة في الموقع التهجين مع تحقيقين جينات محددة تليها المناعية مع الأجسام المضادة من نوعية عالية الموجهة ضد البروتين المشفرة بواسطة الجينات الثالث. ويعتقد أن يتم التعبير عنها قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة ولكن ليس في الخلايا النجمية والخلايا العصبية - وAspartoacyclase (ASPA) الجينات، والطفرات التي يمكن أن تؤدي إلى مرض المادة البيضاء البشري النادر - مرض كانافان. ومع ذلك، لم يتم بعد تأسيس نمط التعبير الدقيق للASPA في الدماغ. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لتحديد ما ASPA يتم التعبير في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن ناضجة لالثانية يمكن تطبيقه بصفة عامة إلى مجموعة واسعة من الدراسات نمط التعبير الجيني.

Introduction

تتكون الخلايا الدبقية، وهي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، قليلة التغصن (الخلايا myelinating من CNS)، قليلة التغصن السلائف (مكتب خدمات المشاريع، التي تعرف أيضا باسم "خلايا NG2")، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. هناك اهتمام متزايد في وظائف الخلايا الدبقية وأدوارهم المحتملة في الأمراض العصبية ^1. على سبيل المثال، مرض كانافان (CD) هو اضطراب وراثي الاعصاب تبدأ في مرحلة الطفولة مع حثل المادة البيضاء الإسفنجي والفقدان التدريجي للخلايا العصبية في وقت مبكر، مما يؤدي إلى الموت عادة قبل 10 سنة من العمر ^2،3. طفرات في الجين Aspartoacyclase (ASPA) التي تؤدي إلى انخفاض شديد في النشاط ASPA ⁴ في مؤتمر نزع السلاح تم تحديدها. ASPA هو انزيم تحفيز deacetylation من N-acetylaspartate (NAA)، وهو جزيء تتركز بشكل كبير في الدماغ، وتوليد خلات واسبارتاتي ^5-7. تظهر العديد من المرضى CD مستويات أعلى من ناه بسبب عدم وجود ASPA ميلانالناقلية. بعض الدراسات أن يخمن خلات المستمدة ناه-يمكن أن تكون مصدرا رئيسيا من الأحماض الدهنية / الدهون في الدماغ أثناء التطور ومؤتمر نزع السلاح قد تنجم عن انخفاض تركيب المايلين خلال تطوير الناجمة عن فشل ناه إلى تقسيمها ^3،5،6.

ASPA وجدت في الغالب في الكلى والكبد والمادة البيضاء في الدماغ، ونظرا للدور الهام من الإقليمين في مؤتمر نزع السلاح، وقد درس التعبير الخلوية من هذا الانزيم في الدماغ عن طريق عدة مختبرات. من خلال النظر في النشاط الأنزيمي ASPA في الدماغ، وجدت دراسات سابقة أن الزيادة في النشاط ASPA أثناء نمو المخ يوازي مدار الساعة من تكون الميالين ^8-10. على المستوى الخلوي، المقايسات للنشاط الأنزيمي وكذلك الموقع التهجين (ISH) والمناعية (IHC) في التحليلات تشير إلى أن ASPA يعبر عنها بشكل رئيسي في الخلايا قليلة التغصن في الدماغ ولكن ليس في الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية ^11-16. وقد وجدت بعض الدراسات أن ASPA ربما أيضايمكن التعبير عنها في الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي ^12،14. بيانات حتى الآن على التعبير ASPA في مكتب خدمات المشاريع محدودة. وفقا لدراسة حديثة حيث تم تحليل ترنسكربيتوم من أنواع مختلفة من الخلايا في قشرة الدماغ الماوس بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، مكتب خدمات المشاريع، قليلة التغصن التي شكلت حديثا، myelinating قليلة التغصن، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية، وpericytes التي كتبها RNA التسلسل ^17، وأعرب عن ASPA حصرا في الخلايا قليلة التغصن ، ولا سيما في myelinating قليلة التغصن (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). وعلى الرغم من هذه الدراسات على نمط التعبير ASPA في الدماغ، لا يزال هناك عدد من الشكوك.

تقنيات مختلفة يمكن استخدامها لدراسة أنماط التعبير الجيني. IHC هو طريقة تستخدم عادة للكشف عن المنتجات وظيفية (أي البروتين) من التعبير الجيني في أقسام الأنسجة. وعلى الرغم من فائدتها كبيرة، وهذا الأسلوب له قيود تطبيقه وخصوصية ور تخضعس توافر ونوعية الأجسام المضادة اللازمة. وعلى سبيل المقارنة، ISH لديها ميزة كونها قادرة على الكشف عن التعبير عن أي الجينات على مستوى مرنا. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون تحديا تقنيا لاستخدام عدة تحقيقات في نفس الوقت من أجل توطين التعبير الجيني لأنواع معينة من الخلايا. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول الجمع مزدوج RNA مضان في الموقع التهجين مع immunolabelling مضان من البروتين. وقد استخدمنا هذه مجموعة من التقنيات لدراسة نمط التعبير عن الإقليمين في مخ الفأر. وتسمح هذه الطريقة دراسة دقيقة في التعبير الجيني باستخدام متحد البؤر المجهري.

Protocol

أخلاقيات الإعلان:
الماوس تربية والتعامل معها هي وفقا للوائح المملكة المتحدة وزارة الداخلية والمبادئ التوجيهية لجنة الأخلاقيات كلية لندن الجامعية، والامتثال لقانون 1986 من المملكة المتحدة واللوائح التعديل لعام 2012 الحيوانات (الإجراءات العلمية).

ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول مع اثيل pyrocarbonate (DEPC) - المياه المعالجة لتدمير أي ريبونوكلياز المتبقية. لتلقي العلاج DEPC، إضافة DEPC (1 مل لكل لتر)، يهز بقوة حتى اختفت جميع الكريات DEPC ثم الأوتوكلاف إلى تدهور DEPC.

1. RNA التحقيق التجميعي

1. تنبيه: عند التعامل مع الفورماميد، وارتداء معدات الوقاية الشخصية (PPE) واستخدام خزانة السلامة. إعداد العازلة التهجين: الماء منزوع الأيونات مع 50٪ (ت / ت) منزوع الأيونات الفورماميد، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، المعالجة DEPC 5 ملي ناه ₂ ص ₄ و 5 ملي نا ₂ هبو _4، 0.01 ملغ / الحمض الريبي النووي النقال الخميرة مل، 1 × soluti دينهارت لعلى، و 10٪ ث / ت ديكستران كبريتات.
2. اختيار استنساخ الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل كدنا] من الجين من الفائدة في البلازميد مع المروجين بوليميريز الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، استخدم نسخة pCMV-SPORT6، IRAVp968C0654D (بنك الجينات accessionBC024934)، مع T7 وSP6 RNA المروجين البلمرة لالإقليمين (الشكل التكميلي 1).
3. إعداد البلازميد خطي كقالب.
   1. تنمو استنساخ الحمض النووي، واستخراج البلازميد مع نطاق صغير عدة تنقية البلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والتسلسل مع T7 والاشعال عالمية SP6.
   2. هضم 1020 ميكروغرام DNA البلازميد مع انزيم التقييد الذي يمر في نهاية 5 'من حبلا معنى كدنا]. على سبيل المثال، استخدم 100 وحدة سال أنا لهضم البلازميد pCMV-SPORT6- الإقليمين. احتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 ^{درجة مئوية.}
   3. تشغيل قسامة صغيرة على هلام الاغاروز للتأكد من أن البلازميد هو خطي تماما.
4. تنقيةالبلازميد خطي باستخدام الفينول الكلوروفورم.
   1. إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم، وحجم واحد من 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) - الفينول معايرتها وحجم واحد من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (IAA) (24: 1).
   2. أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة في RT (20 - 25 درجة مئوية، RT) واستخراج المرحلة المائية العليا.
   3. إضافة مجلد واحد من كلوروفورم / IAA، الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة، واستخراج المرحلة المائية العليا.
   4. كرر الخطوة 1.4.3.
   5. إضافة 2 مجلدات من الايثانول وترك في -20 ^درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو O / N.
   6. أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف.
   7. غسل بيليه مع الايثانول البارد 70٪ وإعادة تعليق في تقريبي 1 ميكروغرام [كدنا في 2.5 ميكرولتر في TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA 7.5 درجة الحموضة).
5. تجميع تحقيقات اثنين، واحد المسمى مع Digoxigenin (DIG) والآخر مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC).
   1. حدد البلمرة RNA المناسب لجعل مكافحة حد ذاتهاالتحقيق NSE (مكمل لهدف مرنا). على سبيل المثال، استخدام T7 RNA البلمرة لجعل ASPA التحقيق.
   2. إعداد في المختبر رد فعل النسخ: إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي خطي، 4.0 ميكرولتر 5 العازلة النسخ س، 6.0 ميكرولتر من 100 ملي DTT، 2.0 ميكرولتر من 10X DIG أو FITC RNA وضع العلامات مزيج يحتوي على dNTPs، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، و20 - 40 وحدات البلمرة RNA. جعل الحجم النهائي يصل إلى 20 ميكرولتر مع المياه المعالجة DEPC.
   3. احتضان عند 37 ^درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
6. ميكرولتر Run1 من رد فعل النسخ على هلام الاغاروز 1.0٪ للتحقق من أن رد الفعل عملت. يجب أن تظهر هلام القالب الخطي والفرقة مشرق لجنة التحقيق.
7. جعل حجم ما يصل الى 100 ميكرولتر مع العازلة التهجين وتخزين 10 مكل في -80 درجة مئوية.

2. الإرواء، التثبيت ومجموعة الأنسجة

1. تنبيه: عند التعامل مع بارافورمالدهيد (PFA)، على حد سواء الصلبة ومائي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام خزانة السلامة. يعد حل الفورمالديهايد عن طريق إذابة 4٪ (ث / ت) PFA في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل باستخدام الحرارة (55 درجة مئوية). تصفية حل الفورمالديهايد مع ورق الترشيح.
2. تحضير محلول السكروز عن طريق إذابة 20٪ (ث / ت) السكروز في الماء المقطر وإضافة 0.1٪ (ت / ت) الحل DEPC. ترك O / N في RT مع غطاء فضفاض ثم الأوتوكلاف.
3. الميؤوس تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتون (50 ملغ / كلغ). تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميها، وغياب المنعكس انسحاب يشير التخدير العميق.
4. وبمجرد أن الفأر هو تحت التخدير العميق، وجعل شق تحت القفص الصدري وقطع طريق القفص الصدري على كلا الجانبين، ورفعه لفضح القلب.
5. ادخال ابرة 25-G إلى البطين الأيسر للقلب. إجراء شق صغير في الأذين الأيمن من القلب.
6. يروي هذا الحيوان مع 20 مل PBS ثم حل الفورمالديهايد 40 مل. لP30 وكبار السنالفئران، استخدام معدل نضح من 12 مل / دقيقة ولكن للحيوانات الشابة استخدام معدل أقل (7-10 مل / دقيقة).
7. تشريح الدماغ.
   1. قطع رأس الفأر مع مقص جراحي عن طريق جعل الخلفي قطع من الأذنين. جعل شق خط الوسط الذيلية في الجلد والعمل rostrally لإزالة الجلد من الجمجمة.
   2. بدءا من الجزء الذيلية، وقطع من خلال الجزء العلوي من الجمجمة على طول خط الوسط وبين العينين مع مقص القزحية. إزالة الجدارية واللوحات العظام الأمامية عن طريق إمالة جانب واحد من لوحة العظام في كل مرة والعض تشغيله مع ملاقط.
   3. إمالة بلطف الدماغ أعلى من الجزء الأمامي مع ملاقط وقطع الأعصاب البصرية وغيرها من أعصاب في الجمجمة. رفع بلطف الدماغ من الجمجمة.
8. وضع الدماغ في الماوس الاكليلية مصفوفة الدماغ. شريحة الدماغ إلى 3 حوالي 4 قطع ملم بشفرة الحلاقة ريشة.
9. نقل الشرائح في 4٪ حل PFA واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
10. نقل الدماغشرائح لDEPC المعالجة 20٪ محلول السكروز واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية
11. وضع كل شريحة الدماغ إلى cryomould الجافة، تحيط مع أفضل درجة حرارة القطع (أكتوبر) المتوسطة وتجميد الثلج الجاف. تخزين في -80 درجة مئوية.

3. Cryosectioning

1. قطع 15 ميكرومتر أقسام الأنسجة المجمدة في ناظم البرد وجمع المقاطع على الشرائح المجهر. إذا لزم الأمر، والرطب الأقسام مع المعالجة DEPC برنامج تلفزيوني وتسحقهم مع الفرشاة الجميلة.
2. ترك الشرائح لتجف لمدة حوالي 1 ساعة للتأكد من أن الأنسجة تلتزم الشريحة.

4. التهجين

1. إعداد 65 ° C غسل العازلة: 150 مم كلوريد الصوديوم، و 15 ملي نا ₃ C ₃ H ₅ O (COO) ₃ (= 1X المالحة الصوديوم سترات)، 50٪ (ت / ت) الفورماميد و 0.1٪ (ت / ت) Tween- 20.
2. إعداد MABT عازلة: 100 ملم حمض الماليك، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ (ت / ت) توين-20، ودرجة الحموضة 7.5.
3. تمييع تحقيقات اثنين (DIG-وصفت وFITC-ابيلد) 1/1000 في المخزن التهجين قبل تحسنت إلى 65 درجة مئوية، وتخلط جيدا.
4. تطبيق 300 ميكرولتر من خليط التهجين على كل شريحة، coverslipwith (C 200 ^س) coverslips فرن خبز واحتضان O / N عند 65 درجة مئوية في غرفة ترطيب.
5. نقل الشرائح في جرة Coplin تحتوي على غسل العازلة قبل تحسنت. تغسل الشرائح لمدة 30 دقيقة مرتين في 65 درجة مئوية مع غسل العازلة.
6. تغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات مع MABT في RT.

5. التصور FITC التحقيق

1. إعداد عازلة تمنع ISH: MABT مع 2٪ عرقلة كاشف و 10٪ الحرارة المعطل مصل الأغنام.
2. اختياري: استخدام قلم مسعور لرسم الدوائر حول أقسام الأنسجة على الشريحة للحد من حجم الحلول الأجسام المضادة المطلوبة.
3. احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة على RT مع ISH حظر عازلة في غرفة ترطيب.
4. احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية مع البيروكسيديز الفجل (POD) - المترافقةد مكافحة FITC الأجسام المضادة المخفف 1/500 (ت / ت) عازلة في ISH الحجب.
5. ضع الشرائح في وعاء Coplin تحتوي على برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ (ت / ت) توين-20 (PBST). يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في PBST واستبدالها مع PBST جديد في كل مرة.
6. مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد tyramide الفلورسنت من خلال تمييع 100 مرة في مخفف التضخيم. على سبيل المثال، استخدام FITC-tyramide.
7. هذا إضافة إلى الشرائح وتترك لمدة 10 دقيقة في RT.
8. ضع الشرائح في وعاء Coplin ويغسل 3 مرات في PBST لمدة 10 دقيقة.

6. التصور DIG التحقيق

1. تحضير 0.1 M Tris- حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2.
2. احتضان الشرائح العازلة مع ISH حجب لمدة 1 ساعة على RT.
3. احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية مع الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) -conjugated-DIG مكافحة الأجسام المضادة المخفف 1/1500 (ت / ت) عازلة في ISH الحجب.
4. يغسل مع MABT لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
5. يغسل مرتين مع 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2 لمدة 5 دقائق على RT.
6. مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد حل الأحمر السريع عن طريق إذابة أقراص في 0.1 م تريس درجة الحموضة 8.2. تصفية حل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
7. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية مع حل سريع الأحمر في غرفة ترطيب. كما يختلف الوقت للنماء، والتحقق من الشرائح بانتظام مع المجهر الفلورسنت لمراقبة تشكيل راسب. على سبيل المثال، والتوقف عن رد الفعل بعد 2-3 ساعة.
8. يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.

7. المناعية

1. إعداد IHC عازلة حظر: 10٪ (ت / ت) في مصل الدم (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية) في PBST.
2. احتضان الشرائح مع IHC عازلة تمنع لمدة 1 ساعة على RT في غرفة ترطيب.
3. إعداد الأجسام المضادة الأولية: تمييع الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المناسبة في PBST مع 5٪ مصل (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية). على سبيل المثال، استخدام أرنب مكافحة Olig2 الأجسام المضادة في 1/400 (/ ت ت) التخفيف.
4. احتضان في حل الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات CO / N.
5. يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
6. إعداد الأجسام المضادة الثانوية: تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق في التخفيف المناسبة في PBST مع 5٪ (ت / ت) في مصل الدم (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية) و 0.1٪ (ت / ت) هويشت 33258. على سبيل المثال ، استخدم حمار المضادة للأرنب Alexa647 الضد الثانوية في 1/1000 (/ ت ت) التخفيف.
7. احتضان في حل الضد الثانوية في RT لمدة 1 ساعة.
8. يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.

8. تركيب

1. تجف جزئيا الشرائح في RT، وجبل مع تصاعد المتوسط ​​مضان. ترك الشرائح لتجف ثم الصورة في المجهر متحد البؤر تحت 10X، 20X و63X الأهداف باستخدام 4 قنوات مختلفة مع موجات الإثارة التالية: 570 نانومتر للأحمر سريع، 488 نانومتر لFITC، 647 نانومتر لOlig2 immunolabelling و 350 نانومتر للهويشت .

النتائج

توضح هذه المقالة طريقة لISH مضان مزدوجة تليها immunolabelling في أقسام مخ الفأر. ويرد وصف موجز لهذا البروتوكول في الشكل 1. وكانت الخطوة الأولى لتجميع تحقيقات محددة لالإقليمين وم ب ب (بروتين النخاعين الأساسي). للتأكد من أن تحقيقات قد تم تولي?...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لRNA المزدوج في الموقع التهجين تليها المناعية. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتأكيد أن الإقليمين يعبر عنه قليلة التغصن ناضجة في العديد من مناطق الدماغ.

هذا الإجراء متعددة الخطوات لديه?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Deionized formamide	Sigma	F9037	for ISH blocking buffer
Sodium chloride	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Hydrochloric acid	VWR International	20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt's solution	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Aspa cDNA clone	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Sodium acetate	Sigma	S2889
Equilibrated phenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl alcohol	Aldrich	496200
Ethanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polymerase	Promega	P4074
Transcription buffer	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Filter paper	Fisher scientific	005479470
Sucrose	Sigma	59378
Diethyl pyrocarbonate	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Dissecting scissors	World Precision Instruments	15922
25 gauge needle	Terumo	300600
Peristaltic pump	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
Iris scissors	Weiss	103227
No.2 tweezers	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Razor blade	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Cryostat/microtome	Bright
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	for 65 °C wash buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Heat-inactivated sheep serum	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
.22 µM filter	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica