La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Riepilogo

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Abstract

Rilevazione di espressione genica in diversi tipi di cellule cerebrali ad esempio, i neuroni, astrociti, oligodendrociti, precursori degli oligodendrociti e microglia, può essere ostacolato dalla mancanza di specifici anticorpi primari o secondari per immunocolorazione. Qui si descrive un protocollo per rilevare l'espressione di tre diversi geni nella stessa sezione del cervello utilizzando doppia ibridazione in situ fluorescente con due sonde gene-specifici seguiti da immunocolorazione con un anticorpo di alta specificità diretto contro la proteina codificata da un terzo gene. Il gene Aspartoacyclase (ASPA), mutazioni che possono portare a una malattia della sostanza bianca umana rara - malattia di Canavan - è pensato per essere espresso in oligodendrociti e microglia ma non in astrociti e neuroni. Tuttavia, deve ancora essere stabilito il pattern di espressione precisa ASPA nel cervello. Questo protocollo ha permesso di stabilire che ASPA è espresso in un sottogruppo di oligodendrociti maturi unnd può essere generalmente applicata a una vasta gamma di studi pattern di espressione genica.

Introduzione

cellule gliali, che sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale (CNS), comprendono oligodendrociti (cellule mielinizzanti di CNS), oligodendrociti precursori (PO, noto anche come "cellule NG2"), astrociti e microglia. Vi è un crescente interesse per le funzioni delle cellule gliali e dei loro ruoli potenziali nelle malattie neurologiche ^1. Ad esempio, malattia di Canavan (CD) è una malattia neurodegenerativa ereditaria di partenza nella prima infanzia con leucodistrofia spongiforme e una progressiva perdita di neuroni, che porta alla morte di solito prima dei 10 anni di età ^2,3. Le mutazioni nel gene Aspartoacyclase (ASPA), che portano a ridurre drasticamente l'attività ASPA ⁴ nel CD sono stati identificati. ASPA è un enzima che catalizza la deacetilazione di N-acetilaspartato (NAA), una molecola altamente concentrata nel cervello, acetato di generazione e aspartato ^5-7. Molti pazienti CD mostrano livelli più elevati di NAA causa della mancanza di ASPA actività. Alcuni studi ipotizzano che l'acetato NAA-derivato potrebbe essere una delle principali fonti di acidi grassi / lipidi nel cervello durante lo sviluppo e CD può derivare da una diminuzione sintesi della mielina durante lo sviluppo causata dal fallimento di NAA essere ripartiti ^3,5,6.

ASPA si trova soprattutto nel rene, fegato e materia bianca del cervello, e dato il ruolo importante ASPA in CD, l'espressione cellulare di questo enzima nel cervello è stato studiato da molti laboratori. Osservando ASPA attività enzimatica nel cervello, studi precedenti hanno trovato che l'aumento dell'attività ASPA durante lo sviluppo cerebrale parallelo l'andamento temporale della myelination ^8-10. A livello cellulare, saggi di attività enzimatica e ibridazione in situ (ISH) e immunoistochimica (IHC) analisi suggeriscono che ASPA è espresso principalmente in oligodendrociti nel cervello, ma non nei neuroni o astrociti ^11-16. Alcuni studi hanno trovato che ASPA potrebbe ancheessere espresso in microglia nel sistema nervoso centrale ^12,14. i dati finora su espressione ASPA OPS sono limitati. Secondo un recente studio in cui trascrittomi di diversi tipi di cellule nel topo corteccia cerebrale compresi i neuroni, astrociti, PO, oligodendrociti di nuova formazione, oligodendrociti mielinizzanti, microglia, cellule endoteliali e periciti sono stati analizzati da RNA sequenziamento ^17, ASPA è espresso esclusivamente in oligodendrociti , in particolare nel mielinizzanti oligodendrociti (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Nonostante questi studi sulla ASPA modello di espressione nel cervello, una serie di incertezze rimangono.

Diverse tecniche possono essere utilizzati per studiare gli schemi di espressione genica. IHC è un metodo comunemente utilizzato per rilevare il prodotto funzionale (cioè, proteine) dell'espressione genica in sezioni di tessuto. Nonostante la sua grande utilità, questa tecnica ha limitazioni sua applicazione e specificità sono soggetti to la disponibilità e specificità dell'anticorpo necessaria. In confronto, ISH ha il vantaggio di essere in grado di rivelare l'espressione di un gene a livello di mRNA. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile utilizzare più sonde contemporaneamente per localizzare una espressione genica di specifici tipi di cellule. In questo articolo, si descrive un protocollo che combina doppia RNA fluorescente in situ con fluorescenza ibridazione immunolabelling di una proteina. Abbiamo utilizzato questo insieme di tecniche per esaminare il pattern di espressione di Aspa in cervello di topo. Questo metodo permette la preciso studio dell'espressione genica mediante microscopia confocale.

Protocollo

Etica Dichiarazione:
allevamento e la gestione del mouse sono in conformità alla normativa del Regno Unito del Ministero degli e le linee guida del Comitato Etico UCL, rispettando gli animali (procedure scientifiche) Act 1986 del Regno Unito e la sua modifica Regolamento 2012.

NOTA: Tutte le soluzioni devono essere effettuate con dietilpirocarbonato (DEPC) - acqua trattata a distruggere ogni residuo RNasi. Per il trattamento DEPC, aggiungere DEPC (1 ml per litro), agitare energicamente fino a quando tutti i globuli DEPC sono scomparsi poi in autoclave a degradare il DEPC.

1. RNA Probe Synthesis

1. ATTENZIONE: Quando si maneggia formammide, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) e utilizzare una cappa di sicurezza. Preparare tampone di ibridazione: trattata con DEPC acqua deionizzata con il 50% (v / v) formammide deionizzata, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH ₂ PO _4, 5 mM Na ₂ HPO _4, 0,01 mg / ml tRNA di lievito, 1 × soluti di Denhardt, e 10% w / v destrano solfato.
2. Scegliere un clone di DNA che contiene la sequenza di cDNA del gene di interesse in un plasmide con i promotori RNA polimerasi. Per questo esempio, utilizzare un clone pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), con T7 e promotori polimerasi RNA Sp6 per Aspa (Figura supplementare 1).
3. Preparare DNA plasmide linearizzato come modello.
   1. Grow il clone DNA, estrarre il plasmide con una piccola scala kit di purificazione plasmide secondo il protocollo del produttore e sequenza con il T7 e SP6 primers universali.
   2. Digest 1.020 mg DNA plasmide con un enzima di restrizione che taglia all'estremità 5 'del filamento senso del cDNA. Per questo esempio, utilizzare il 100 unità Sai I a digerire il plasmide pCMV-SPORT6- Aspa. Incubare per 1,5 ore a 37 ^° C.
   3. Eseguire una piccola aliquota su gel di agarosio per verificare che il plasmide è completamente linearizzata.
4. purificare ilplasmide linearizzate con fenolo-cloroformio.
   1. Aggiungere 1/10 volume di 3 M acetato di sodio, un volume di 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - fenolo equilibrato e un volume di cloroformio / alcool isoamilico (IAA) (24: 1).
   2. Centrifugare a 16.000 xg per 1 min a RT (20 - 25 ° C, RT) ed estrarre fase acquosa superiore.
   3. Aggiungere un volume di cloroformio / IAA, centrifugare a 16.000 xg per 1 min e estrarre fase acquosa superiore.
   4. Ripetere il punto 1.4.3.
   5. Aggiungere 2 volumi di etanolo e lasciare a -20 ^° C per 1 ora o O / N.
   6. Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 10 min. Eliminare il surnatante.
   7. Lavare il pellet con il 70% di etanolo freddo e risospendere in approssimativamente 1 mg cDNA per 2,5 microlitri di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
5. Sintetizzare le due sonde, uno marcato con digossigenina (DIG) e l'altra con isotiocianato di fluoresceina (FITC).
   1. Selezionare la RNA polimerasi appropriata per rendere l'anti-seSonda NSE (complementare al bersaglio mRNA). Per questo esempio, utilizzare T7 RNA polimerasi a fare sonda Aspa.
   2. Preparare in vitro reazione di trascrizione: aggiungere 1 mg di DNA linearizzato, 4,0 ml 5 x buffer di trascrizione, 6.0 ml di 100 mM DTT, 2,0 ml di 10x DIG o FITC RNA etichettatura miscela contenente dNTP, 1 inibitore della RNasi ml, e 20 - 40 unità di RNA polimerasi; rendere il volume finale a 20 microlitri con acqua trattata con DEPC.
   3. Incubare a 37 ^° C per 1,5 ore.
6. microlitri Run1 della reazione di trascrizione su un gel di agarosio 1,0% per verificare che la reazione ha lavorato. Il gel dovrebbe mostrare il modello lineare e una banda luminosa della sonda.
7. Portare al volume di 100 ml con tampone di ibridazione e di memorizzare 10 aliquote microlitri a -80 ° C.

2. Perfusione, Fissazione e tessuto Collection

1. ATTENZIONE: Quando si maneggia paraformaldeide (PFA), sia solido eacquosa, indossare DPI e utilizzare una cappa di sicurezza. Preparare la soluzione di formaldeide sciogliendo 4% (w / v) di PFA in 1x tampone fosfato salino (PBS) utilizzando il calore (55 ° C). Filtrare la soluzione di formaldeide con carta da filtro.
2. Preparare la soluzione di saccarosio sciogliendo 20% (w / v) di saccarosio in acqua distillata e aggiungere 0,1% (v / v) DEPC. Lascia O / N a temperatura ambiente con un coperchio sciolto e poi in autoclave.
3. Terminally anaesthetize un topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbitone (50 mg / kg). Valutare la profondità dell'anestesia per pizzico punta e l'assenza di recesso riflesso indica anestesia profonda.
4. Una volta che il mouse è sotto anestesia profonda, fare un'incisione sotto la gabbia toracica e tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati, sollevarlo per esporre il cuore.
5. Inserire un ago da 25 G nel ventricolo sinistro del cuore. Fai una piccola incisione nell'atrio destro del cuore.
6. Profumato l'animale con 20 ml di PBS e quindi 40 ml di soluzione di formaldeide. Per P30 e anzianitopi, utilizzare un tasso di perfusione di 12 ml / min, ma per gli animali giovani utilizzano un tasso inferiore (7 - 10 ml / min).
7. Sezionare il cervello.
   1. Sever la testa del mouse con le forbici chirurgiche facendo una posteriore tagliata dalle orecchie. Effettuare una incisione mediana caudale nella pelle e lavorare rostralmente per rimuovere la pelle dal cranio.
   2. Partendo dalla parte caudale, tagliare la parte superiore del cranio lungo la linea mediana e tra gli occhi con le forbici Iris. Rimuovere parietale e placche ossee frontali inclinando un lato di una piastra ossea ogni volta e facendo scattare via con pinzette.
   3. inclinare leggermente il cervello verso l'alto dalla parte anteriore con una pinzetta e tagliare i nervi ottici e di altri nervi cranici. Sollevare delicatamente il cervello fuori dal cranio.
8. Mettere il cervello in una matrice cervello coronale del mouse. Tagliare il cervello in 3 circa 4 pezzi mm con una lama di rasoio piuma.
9. Trasferire le fettine in soluzione al 4% PFA e incubare O / N a 4 ° C.
10. Trasferimento del cervellofette di DEPC-trattati del 20% soluzione di saccarosio e incubare O / N a 4 ° C
11. Mettere ogni fetta cervello in un cryomould secca, circondare con la temperatura di taglio ottimale (OCT) di medie e congelare in ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C.

3. criosezionamento

1. Tagliare 15 sezioni micron di tessuto congelato in un criostato e raccogliere le sezioni su vetrini da microscopio. Se necessario, bagnare le sezioni con DEPC trattati con PBS e appiattire con un pennello fine.
2. Lasciare le diapositive asciugare per circa 1 ora a garantire che il tessuto aderisce alla slitta.

4. ibridazione

1. Preparare 65 ° C tampone di lavaggio: 150 mM NaCl, 15 mM Na ₃ C ₃ H ₅ O (COO) ₃ (= 1x salina di sodio citrato), 50% (v / v) formammide e 0,1% (v / v) Tween- 20.
2. Preparare MABT buffer: 100 mM di acido maleico, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5.
3. Diluire le due sonde (DIG-etichettati e FITC-Labelled) 1 / 1.000 in tampone di ibridazione pre-riscaldato a 65 ° C e mescolare bene.
4. Applicare circa 300 ml di miscela di ibridazione su ogni diapositiva, coverslipwith (C 200 ^o) coprioggetto da forno e incubare O / N a 65 ° C in una camera umidificata.
5. Trasferire i vetrini in una vaschetta Coplin contenente tampone di lavaggio pre-riscaldato. Lavare i vetrini per 30 minuti due volte a 65 ° C con tampone di lavaggio.
6. Lavare i vetrini per 10 minuti tre volte con MABT a temperatura ambiente.

5. Visualizzazione del FITC Probe

1. Preparare tampone di bloccaggio ISH: MABT con il 2% di bloccaggio del reagente e il 10% di siero di pecora inattivato al calore.
2. Opzionale: utilizzare una penna idrofobico per disegnare cerchi intorno sezioni di tessuto sul vetrino per ridurre il volume di soluzioni anticorpi necessari.
3. Incubare i vetrini per 1 ora a RT con ISH tampone di bloccaggio in una camera umidificata.
4. Incubare la vetrini O / N a 4 ° C con perossidasi di rafano (POD) - coniugatod anticorpo anti-FITC diluito 1/500 (v / v) in tampone bloccante ISH.
5. Porre i vetrini in una vaschetta Coplin contenente PBS con 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Lavare 3 volte per 10 min in PBST e sostituirlo con PBST fresco ogni volta.
6. Immediatamente prima dell'uso, preparare il tiramide fluorescente diluendo 100 volte nel diluente di amplificazione. Per questo esempio, utilizzare FITC-tiramide.
7. Aggiungere questo per le diapositive e lasciare per 10 minuti a temperatura ambiente.
8. Porre i vetrini in una vaschetta Coplin e lavare 3 volte in PBST per 10 min.

6. Visualizzazione della DIG Probe

1. Preparare 0.1 M Tris- HCl pH 8,2.
2. Incubare i vetrini con tampone ISH di blocco per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Incubare la vetrini O / N a 4 ° C con una fosfatasi alcalina (AP) coniugata anticorpo anti-DIG diluito 1 / 1.500 (v / v) in tampone bloccante ISH.
4. Lavare con MABT per 10 minuti tre volte.
5. Lavare due volte con 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 per 5 minuti a RT.
6. Immediatamente prima dell'uso, preparare la soluzione Red veloce sciogliendo le tavolette in 0.1 M Tris pH 8,2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron.
7. Incubare i campioni a 37 ° C con una soluzione Fast Red in una camera umidificata. Poiché il tempo per lo sviluppo ottimale varia, controlla le diapositive regolarmente con un microscopio a fluorescenza per monitorare la formazione di precipitato. Per questo esempio, arrestare la reazione dopo 2 - 3 ore.
8. Lavare con PBST per 10 minuti tre volte.

7. immunoistochimica

1. Preparare IHC tampone bloccante: 10% (v / v) di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario) in PBST.
2. Incubare i vetrini con IHC tampone bloccante per 1 ora a RT in una camera umidificata.
3. Preparare l'anticorpo primario: diluire l'anticorpo primario ad una diluizione appropriata in PBST con 5% di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario). Per questo esempio, utilizzare un anticorpo di coniglio anti-Olig2 a 1/400 (v / v) di diluizione.
4. Incubare la soluzione di anticorpo primario a 4 ° CO / N.
5. Lavare con PBST per 10 minuti tre volte.
6. Preparare anticorpo secondario: diluire un anticorpo secondario fluoroforo coniugato ad una diluizione appropriata in PBST con il 5% (v / v) di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario) e 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Per questo esempio , utilizzare un asino anti-coniglio Alexa647 anticorpo secondario a 1 / 1.000 (v / v) di diluizione.
7. Incubare la soluzione di anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora.
8. Lavare con PBST per 10 minuti tre volte.

8. Montaggio

1. Parzialmente asciugare le diapositive a temperatura ambiente, e montare con un mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare le diapositive asciugare e poi l'immagine in un microscopio confocale sotto 10X, 20X e 63X obiettivi utilizzando 4 canali diversi con le seguenti lunghezze d'onda di eccitazione: 570 nm per Fast Red, 488 nm per FITC, 647 nm per Olig2 immunolabelling e 350 nm per la Hoechst .

Risultati

Questo articolo descrive un metodo per un ISH doppia fluorescenza seguita da immunolabelling in sezioni cervello di topo. Una breve descrizione di questo protocollo è mostrato in Figura 1. Il primo passo è stato quello di sintetizzare sonde specifiche per Aspa e Mbp (proteina basica della mielina). Per controllare che le sonde erano sintetizzati, una piccola aliquota di ciascuna reazione è stata eseguita su gel di agarosio. Il modello lineare debole ...

Discussione

Questo protocollo prevede una procedura passo-passo per un doppio RNA ibridazione in situ seguito da immunocolorazione. Abbiamo usato questo protocollo per confermare che Aspa è espresso in oligodendrociti maturi in diverse aree del cervello.

Questa procedura multi-step ha molti potenziali insidie ​​che possono influenzare la sensibilità e dovrebbero essere evitati. In primo luogo, tutte le soluzioni e buffer di memorizzazione per la reazione di trascrizione devono es...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Deionized formamide	Sigma	F9037	for ISH blocking buffer
Sodium chloride	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Hydrochloric acid	VWR International	20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt's solution	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Aspa cDNA clone	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Sodium acetate	Sigma	S2889
Equilibrated phenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl alcohol	Aldrich	496200
Ethanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polymerase	Promega	P4074
Transcription buffer	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Filter paper	Fisher scientific	005479470
Sucrose	Sigma	59378
Diethyl pyrocarbonate	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Dissecting scissors	World Precision Instruments	15922
25 gauge needle	Terumo	300600
Peristaltic pump	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
Iris scissors	Weiss	103227
No.2 tweezers	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Razor blade	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Cryostat/microtome	Bright
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	for 65 °C wash buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Heat-inactivated sheep serum	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
.22 µM filter	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica