Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Resumo

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Resumo

Detecção de expressão de genes em diferentes tipos de células do cérebro, por exemplo, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos, microglia e oligodendrócitos precursores, pode ser dificultada pela falta de anticorpos primários ou secundários específicos para a imunocoloração. Descrevemos aqui um protocolo para detectar a expressão de três genes diferentes na mesma secção utilizando cérebro de fluorescência dupla de hibridação in situ com duas sondas específicas para o gene seguido de imunocoloração com um anticorpo de alta especificidade dirigida contra a proteína codificada por um terceiro gene. O gene Aspartoacyclase (ASPA), de mutações que podem conduzir a uma doença da matéria branca humana rara - doença de Canavan - é pensado para ser expresso em oligodendrócitos e a microglia, mas não em neurónios e astrócitos. No entanto, o padrão de expressão precisa de ASPA no cérebro tem ainda de ser estabelecidos. Este protocolo nos permitiu determinar que ASPA é expressa em um subconjunto de oligodendrócitos maduros umND pode ser geralmente aplicado a uma ampla gama de estudos padrão de expressão do gene.

Introdução

As células da glia, que são as células mais abundantes no sistema nervoso central (SNC), compreendem oligodendrócitos (células mielinizantes do sistema nervoso central), oligodendrócitos precursores (PO, também conhecidos como "células") NG2, astrócitos e microglia. Há um interesse crescente nas funções de células gliais e de seus papéis potenciais em doenças neurológicas ^1. Por exemplo, a doença de Canavan (CD) é uma doença neurodegenerativa hereditária começando no início da infância com leucodistrofia espongiforme e uma perda progressiva de neurónios, que conduz a morte geralmente antes dos 10 anos de idade ^2,3. As mutações no gene Aspartoacyclase (ASPA) que levam à redução da actividade drasticamente ASPA ⁴ em CD foram identificados. ASPA é uma enzima que catalisa a desacetilação de N-acetilaspartato (NAA), uma molécula altamente concentrada no cérebro, acetato de gerar e aspartato ^5-7. Muitos pacientes com DC apresentam níveis mais elevados de NAA devido à falta de ASPA actividade. Alguns estudos especular que o acetato de NAA-derivado pode ser uma importante fonte de ácidos gordos / lípidos no cérebro durante o desenvolvimento e CD podem resultar da diminuição da síntese de mielina durante o desenvolvimento causado pela falha de NAA para ser discriminado ^3,5,6.

ASPA é predominantemente encontrado no rim, no fígado e da matéria branca do cérebro, e dado o papel importante da ASPA em CD, a expressão celular desta enzima no cérebro tem sido estudado por vários laboratórios. Ao olhar para a actividade enzimática ASPA no cérebro, estudos anteriores descobriu que o aumento da actividade durante o desenvolvimento cerebral ASPA paralelo ao curso de tempo de ^8-10 mielinização. Ao nível celular, ensaios para a actividade enzimática, bem como hibridação in situ (ISH) e imuno-histoquímica (IHC) ASPA análises sugerem que é expresso principalmente em oligodendrócitos no cérebro, mas não em neurónios ou de astrócitos ^11-16. Alguns estudos descobriram que ASPA pode tambémser expresso em microglia no sistema nervoso central ^12,14. dados até agora sobre a expressão ASPA em PO são limitadas. De acordo com um estudo recente em que transcriptomes de diferentes tipos de células no córtex cerebral do rato, incluindo neurónios, astrócitos, PO, oligodendrócitos recém-formados, oligodendrócitos myelinating, microglia, células endoteliais e pericitos foram analisados ​​por ARN de sequenciação ^17, ASPA é expresso exclusivamente em oligodendrócitos , em particular em myelinating oligodendrócitos (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Apesar desses estudos sobre padrão de expressão ASPA no cérebro, uma série de incertezas permanecem.

técnicas diferentes podem ser usadas para estudar os padrões de expressão de genes. IHC é um método vulgarmente utilizado para detectar o produto funcional (ou seja, proteína) de um gene de expressão em secções de tecido. Apesar de sua grande utilidade, esta técnica tem limitações como a sua aplicação e especificidade estão sujeitas tO a disponibilidade e a especificidade do anticorpo necessário. Por comparação, a ISH tem a vantagem de ser capaz de revelar a expressão de qualquer gene ao nível do ARNm. No entanto, pode ser tecnicamente difícil de usar várias sondas ao mesmo tempo, a fim de localizar um gene de expressão para tipos de células específicos. Neste artigo, descreve-se um protocolo que combina ARN de dupla fluorescência de hibridação in situ com fluorescência de uma imunomarcação de proteínas. Temos utilizado este conjunto de técnicas para analisar o padrão de expressão da Aspa no cérebro do rato. Este método permite o estudo preciso da expressão génica utilizando microscopia confocal.

Protocolo

Declaração de ética:
Rato criação e manipulação estão em conformidade com os regulamentos UK Home Office e as orientações do comitê de ética UCL, cumprindo com os Animais (procedimentos científicos) Act de 1986 do Reino Unido e dos seus regulamentos de alteração 2012.

Nota: Todas as soluções devem ser feitos com pirocarbonato de dietilo (DEPC) - água tratada para destruir qualquer RNase residual. Para o tratamento DEPC, adicione DEPC (1 ml por litro), agitar vigorosamente até que todos os glóbulos DEPC desapareceram depois autoclave para degradar o DEPC.

1. RNA Probe Synthesis

1. CUIDADO: Ao manusear formamida, usar Equipamentos de Proteção Individual (EPI) e usar uma cabine de segurança. Preparar tampão de hibridação: água desionizada com 50% (v / v) de formamida desionizada, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, tratada com DEPC 5 mM de NaH ₂ PO _4, 5 mM de Na ₂ HPO _4, 0,01 mg / ml de ARNt de levedura, 1 × soluti de Denhardtno, e 10% w / v de sulfato de dextrano.
2. Escolher um clone de ADN que contém a sequência de cDNA do gene de interesse num plasmídeo com promotores de ARN-polimerase. Para este exemplo, utilizar um clone de ADN pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), com T7 e promotores da polimerase de ARN de Sp6 para Aspa (Recurso Figura 1).
3. Preparar DNA de plasmídeo linearizado como molde.
   1. Cresça o clone de ADN, extrair o plasmídeo com um kit de purificação de plasmídeo em pequena escala de acordo com o protocolo do fabricante e a sequência com a T7 e os iniciadores universais SP6.
   2. Digerir o ADN do plasmídeo 1020 ug com uma enzima de restrição que corta na extremidade 5 'da cadeia com sentido do cDNA. Para este exemplo, usamos 100 unidade Sal I para digerir o plasmídeo pCMV-SPORT6- Aspa. Incubar durante 1,5 horas a 37 ^o C.
   3. Executar uma pequena alíquota num gel de agarose para verificar que o plasmídeo é linearizado totalmente.
4. Purifica-se oplasmídeo linearizado utilizando fenol-clorofórmio.
   1. Adicionar 1/10 volume de 3 M de acetato de sódio, um volume de Tris 10 mM HCI (pH 8,0) - fenol equilibrado e um volume de clorofórmio / álcool isoamílico (IAA) (24: 1).
   2. Centrifugar a 16000 xg durante 1 min à temperatura ambiente (20 - 25 ° C, TA) e extrai-se fase aquosa superior.
   3. Adicionar um volume de clorofórmio / IAA, centrifugar a 16000 xg durante 1 min e extrair fase aquosa superior.
   4. Repita o passo 1.4.3.
   5. Adicionar 2 volumes de etanol e deixou-se a -20 ^° C durante 1 h ou O / N.
   6. Centrifuga-se a 16000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Descartar o sobrenadante.
   7. Lava-se a pastilha com etanol frio a 70% e ressuspender em approximatively um ADNc ug por 2,5 ul em TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5).
5. Sintetizar as duas sondas, uma marcada com digoxigenina (DIG) e a outra com isotiocianato de fluoresceína (FITC).
   1. Seleccione a RNA polimerase adequada para fazer o anti-sesonda NSE (complementar para o ARNm alvo). Para este exemplo, utilizar ARN-polimerase T7 para fazer sonda Aspa.
   2. Prepare a reacção de transcrição in vitro: adicionar 1 ug do ADN linearizado, 4,0 ul 5 tampão de transcrição X, 6,0 ul de DTT 100 mM, 2,0 ul de 10x DIG ou FITC ARN rotulagem mistura contendo dNTP, 1 ul de inibidor de RNase, e 20 - 40 unidades de polimerase de ARN; tornar o volume final até 20 ul com água tratada com DEPC.
   3. Incubar a 37 ^° C durante 1,5 horas.
6. RUN1 ul da reacção de transcrição num gel de agarose a 1,0% para verificar que a reacção funcionou. O gel deve mostrar o modelo linear e uma banda brilhante da sonda.
7. Completar o volume até 100 ul com tampão de hibridação e armazenar alíquotas de 10 uL a -80 ° C.

2. Perfusão, Fixação e Recolha de Tecidos

1. CUIDADO: Ao manusear paraformaldeído (PFA), ambos sólida eaquosa, utilizar EPI e usar uma cabine de segurança. Preparar a solução de formaldeído por dissolução de 4% (w / v) de PFA em 1x tampão fosfato salino (PBS) utilizando calor (55 ° C). Filtra-se a solução de formaldeído com papel de filtro.
2. Preparar a solução de sacarose através da dissolução de 20% (w / v) de sacarose em água destilada e adiciona-se 0,1% (v / v) de DEPC. Deixe O / N à temperatura ambiente com uma tampa solta e, em seguida, autoclave.
3. Terminalmente anestesiar um ratinho por injecção intra-peritoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e ausência de reflexo de retirada indica anestesia profunda.
4. Uma vez que o mouse está sob anestesia profunda, fazer uma incisão abaixo da caixa torácica e cortar através da caixa torácica em ambos os lados, levante-a para expor o coração.
5. Inserir uma agulha de 25 G para o ventrículo esquerdo do coração. Fazer uma pequena incisão no átrio direito do coração.
6. Perfundir o animal com 20 ml de PBS e, em seguida, 40 ml de solução de formaldeído. Para P30 e mais velhosratinhos, utilizar uma taxa de perfusão de 12 ml / min, mas para os animais mais jovens usar uma taxa mais baixa (7-10 ml / min).
7. Dissecar o cérebro.
   1. Cortar a cabeça do rato com uma tesoura cirúrgica, fazendo uma posterior corte das orelhas. Fazer uma incisão na linha média na pele caudal e rostral trabalhar para remover a pele do crânio.
   2. A partir da parte caudal, corte através da parte superior do crânio, ao longo da linha média e entre os olhos com uma tesoura íris. Remova o parietal e placas ósseas frontais inclinando um lado de uma placa de osso de cada vez e colocando-a fora com pinças.
   3. Incline ligeiramente o cérebro para cima a partir da parte anterior com uma pinça e cortar os nervos ópticos e outros nervos cranianos. Levante cuidadosamente o cérebro fora do crânio.
8. Coloque o cérebro em uma matriz cérebro coronal mouse. Cortar o cérebro em 3 de aproximadamente 4 pedaços mm com uma lâmina de barbear pena.
9. Transferir as fatias em solução PFA a 4% e incubar O / N a 4 ° C.
10. cérebro transferênciafatias para tratada com DEPC 20% de solução de sacarose e incubar O / N a 4 ° C
11. Coloque cada fatia do cérebro em um cryomould seca, cercar com a temperatura ideal de corte médio (OCT) e congelar em gelo seco. Armazenar a -80 ° C.

3. cryosectioning

1. Corte de 15 um secções de tecido congelado em um criostato e recolher as secções em lâminas de microscópio. Se necessário, molhar as seções com PBS tratado com DEPC e alise-os com um pincel fino.
2. Deixar as lâminas secar durante aproximadamente 1 h para assegurar que o tecido adere à lâmina.

4. Hibridização

1. Preparar o tampão de lavagem de 65 ° C: 150 mM de NaCl, 15 mM de Na ₃ C ₃ H ₅ O (COO) ₃ (1x ​​= citrato de sódio salino), 50% (v / v) de formamida e 0,1% (v / v) de Tween- 20.
2. Preparar tampão MABT: ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5.
3. Diluir as duas sondas (DIG-rotulados e FITC-Labelled) 1 / 1.000 em tampão de hibridação pré-aquecida a 65 ° C e misture bem.
4. Aplicar cerca de 300 ul de mistura de hibridação sobre cada lâmina, coverslipwith (C 200 ^o) lamelas de forno e incubar O / N a 65 ° C numa câmara humidificada.
5. Transferir as lâminas em um frasco Coplin contendo tampão de lavagem pré-aquecido. Lavam-se as lâminas durante 30 min, duas vezes a 65 ° C com tampão de lavagem.
6. Lavam-se as lâminas durante 10 minutos três vezes com MABT à TA.

5. Visualização do Probe FITC

1. Preparar tampão de bloqueio ISH: MABT com reagente de bloqueio a 2% e 10% de soro de ovelha inactivado pelo calor.
2. Opcional: utilizar uma caneta hidrofóbico para desenhar círculos em torno das secções de tecido na lâmina para reduzir o volume das soluções de anticorpo necessários.
3. Incubar as lâminas durante 1 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio ISH numa câmara humidificada.
4. Incubar as lâminas O / N a 4 ° C com uma peroxidase de rábano (POD) - conjugadoanticorpo anti-FITC d diluído 1/500 (v / v) de tampão de bloqueio ISH.
5. Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo PBS com 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavar 3 vezes durante 10 min em PBST e substituir com PBST fresco de cada vez.
6. Imediatamente antes da utilização, prepare o tiramida fluorescente diluindo 100 vezes no diluente amplificação. Para este exemplo, utilizar FITC-tiramida.
7. Adicione isto a os slides e deixe por 10 minutos em temperatura ambiente.
8. Colocar as lâminas em um frasco Coplin e lavar 3 vezes em PBST durante 10 min.

6. Visualization da Sonda DIG

1. Prepare 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
2. Incubar as lâminas com tampão ISH bloqueio durante 1 h à TA.
3. Incubar as lâminas O / N a 4 ° C com uma fosfatase alcalina (AP) -conjugated anticorpo anti-DIG diluído a 1 / 1.500 (v / v) de tampão de bloqueio ISH.
4. Lavar com MABT durante 10 minutos, três vezes.
5. Lavar duas vezes com 0,1 M de Tris-HCl pH 8,2, durante 5 min à TA.
6. Imediatamente antes da utilização, preparar solução Fast Red por dissolução dos comprimidos em 0,1 M de Tris pH 8,2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um.
7. Incubar as lâminas a 37 ° C com uma solução de Fast Red numa câmara humidificada. À medida que o tempo para o desenvolvimento óptimo varia, verificar regularmente as lâminas com um microscópio de fluorescência para monitorizar a formação de precipitado. Para este exemplo, parar a reacção após 2-3 h.
8. Lavar com PBST, durante 10 minutos, três vezes.

7. Imuno-histoquímica

1. Prepare tampão de bloqueio IHC: 10% (v / v) de soro (de uma espécie diferente de acolhimento anticorpo primário) em PBST.
2. Incubar as lâminas com IHC tampão de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara humidificada.
3. Prepare anticorpo primário: diluir o anticorpo primário a uma diluição adequada em PBST com% de soro 5 (de uma espécie diferente de acolhimento anticorpo primário). Para este exemplo, utilizar um anticorpo de coelho anti-Olig2 a 1/400 (v / v) de diluição.
4. Incubar na solução de anticorpo primário a 4 ° CO / N.
5. Lavar com PBST, durante 10 minutos, três vezes.
6. Prepare o anticorpo secundário: diluir um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo em uma diluição apropriada em PBST com 5% (v / v) de soro (de uma espécie diferente de anticorpo primário hospedeiro) e 0,1% (v / v) a Hoechst 33258. Para este exemplo , usar um burro anti-coelho Alexa647 anticorpo secundário a 1 / 1.000 (v / v) de diluição.
7. Incubar na solução de anticorpo secundário à TA durante 1 h.
8. Lavar com PBST, durante 10 minutos, três vezes.

8. montagem

1. Parcialmente secar as lâminas a RT, e montar com um meio de montagem de fluorescência. Deixe os slides para secar e depois imagem em um microscópio confocal sob 10X, 20X e 63X objetivos utilizando 4 canais diferentes com os seguintes comprimentos de onda de excitação: 570 nm para o Red rápido, 488 nm para FITC, 647 nm para Olig2 imunomarcação e 350 nm para a Hoechst .

Resultados

Este artigo descreve um método para a ISH dupla fluorescência seguido por imunomarcação em seções do cérebro do rato. Uma breve descrição deste protocolo é demonstrado na Figura 1. O primeiro passo foi sintetizar sondas específicas para Aspa e MBP (proteína básica da mielina). Para verificar que as sondas foram sintetizadas, uma pequena aliquota de cada reacção foi efectuada num gel de agarose. O modelo linear fraco e uma grande quantidad...

Discussão

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para um ARN de dupla hibridização in situ seguindo-se a imunocoloração. Temos utilizado este protocolo para confirmar que Aspa é expresso em oligodendrócitos maduros em várias áreas do cérebro.

Este processo multi-passo tem muitas armadilhas potenciais que podem afectar a sensibilidade e deve ser evitado. Em primeiro lugar, todas as soluções e tampões de armazenamento para a reacção de transcrição precisa ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Deionized formamide	Sigma	F9037	for ISH blocking buffer
Sodium chloride	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Hydrochloric acid	VWR International	20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt's solution	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Aspa cDNA clone	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Sodium acetate	Sigma	S2889
Equilibrated phenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl alcohol	Aldrich	496200
Ethanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polymerase	Promega	P4074
Transcription buffer	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Filter paper	Fisher scientific	005479470
Sucrose	Sigma	59378
Diethyl pyrocarbonate	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Dissecting scissors	World Precision Instruments	15922
25 gauge needle	Terumo	300600
Peristaltic pump	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
Iris scissors	Weiss	103227
No.2 tweezers	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Razor blade	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Cryostat/microtome	Bright
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	for 65 °C wash buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Heat-inactivated sheep serum	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
.22 µM filter	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica