Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Özet

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Özet

Beyin hücreleri, örneğin nöronlar, astrositler, oligodendrositler, oligodendrosit öncüleri ve mikroglia farklı gen ifadesinin saptanması, immün spesifik primer ya da sekonder antikorların yokluğuyla engellenebilir. Burada üçüncü geni tarafından kodlanan proteine ​​karşı yöneltilmiş yüksek özgüllük bir antikor ile immün ardından, iki gen spesifik problar ile in situ hibridizasyon, çift floresan kullanılarak aynı beyin kısmında üç farklı gen ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol açıklar. Aspartoacyclase (ASPA) geni, mutasyonlar nadir insan beyaz madde hastalığı neden olabilir - Canavan hastalığı - oligodendrositler ve mikroglia ancak astrositler ve nöron ifade edilmesi düşünülmektedir. Bununla birlikte, beyinde ASPA kesin ifade deseni henüz belirlenmemiştir zorundadır. Bu protokol ASPA olgun oligodendrosit a bir alt kümesi olarak ifade edildiğini belirlemek için bize izin verdiND genellikle gen ekspresyon paterni çalışmalar çeşitli uygulanabilir.

Giriş

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içinde en bol hücrelerdir glial hücreler, oligodendrositlerin (CNS myelinating hücreleri), oligodendrositler öncüleri (aynı zamanda "NG2 hücreler" olarak da bilinir OP), astrositler ve mikroglia içermektedir. Nörolojik hastalıklarda ¹ glial hücreler ve bunların potansiyel rolleri fonksiyonları artan bir ilgi vardır. Örneğin, Canavan hastalığı (CD) genellikle yaş ^2,3 10 yıl önce ölüme yol açan, erken süngersi leukodystrophy ve nöronların ilerleyici kaybı ile bebeklik döneminde başlayan bir kalıtsal nörodejeneratif bir hastalıktır. Yol Aspartoacyclase (ASPA'nın) genindeki mutasyonlar ölçüde CD ASPA'nın aktivitesi ⁴ düşürülen tespit edilmiştir. ASPA N-asetilaspartat (NAA) deasetilasyonu katalize bir enzim, yüksek beyin içinde konsantre molekülü üreten asetat, aspartat ^5-7. Birçok CD hasta nedeniyle ASPA ac eksikliği NAA daha yüksek olduğunu göstermektedirtivity. Bazı çalışmalar NAA türetilmiş asetat gelişimi sırasında yağ asitleri / beyinde lipidlerin önemli bir kaynağı olabilir ve ^3,5,6 aşağı kırılması NAA yetmezliği nedeniyle gelişimi sırasında miyelin sentezi azaldığı CD neden olabilir spekülasyon.

ASPA ağırlıklı beyin böbrek, karaciğer ve beyaz cevherde bulunan ve CD'deki ASPA önemli rolü verilir, beyindeki bu enzimin hücre ifadesi birkaç laboratuvarlar tarafından incelenmiştir. Beyinde ASPA enzimatik aktivite bakarak, daha önceki çalışmalarda beyin gelişimi sırasında ASPA aktivite artışı miyelinasyon ^8-10 zaman sürecini paralellik bulundu. Hücresel düzeyde, enzimatik aktivitesi için hem de in situ hibridizasyon (ISH) ve immünohistokimya (IHC) deneyleri ASPA'nın esas olarak beyinde konumlandığı, fakat nöronlar veya astrosit ^11-16 oligodentrositler ifade olduğunu göstermektedir analizleri. Birkaç çalışmalarda ASPA da olabilir oCNS ^12,14 olarak mikroglia olarak ifade edilebilir. Operasyonel olarak ASPA ifadesine Şimdiye kadar veriler sınırlıdır. Nöronlar, astrositler, OP'lerle, yeni kurulan oligodendrositler, myelinating oligodendrositler, mikroglia, endotelyal hücreler ve perisitlere dahil fare serebral korteks farklı hücre tiplerinin transcriptomes RNA sıralanması ¹⁷ ile analiz edildi Yeni bir araştırmaya göre, ASPA sadece oligodendrositlere ifade edilir , oligodendrositlerin myelinating özellikle (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Beyinde ASPA ifade deseni bu çalışmalara rağmen, belirsizliklerin bir dizi kalır.

Farklı teknikler gen ekspresyonu incelemek için kullanılabilir. IHC doku kesitlerinde bir gen ekspresyonunun işlevsel bir ürün (örneğin, protein) tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. uygulama ve özgünlüğü tabi t gibi onun büyük yarar rağmen, bu tekniğin sınırlamaları vardırihtiyaç duyulan antikorun mevcudiyeti ve özgünlüğü o. Buna karşılık, ISH mRNA düzeyinde bir genin ekspresyonunu ortaya çıkarmak mümkün olma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, özel hücre tipleri için bir gen ekspresyonunu lokalize etmek için aynı anda birden fazla prob kullanımı teknik olarak zor olabilir. Bu yazıda, bir proteinin floresan immüno ile in situ hibridizasyon çift floresan RNA birleştiren bir protokol açıklar. Biz fare beyninde Aspa salgılanma modelini incelemek için teknikler bu dizi kullandık. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanılarak gen ekspresyonunun hassas çalışma sağlar.

Protokol

Etik Beyanı:
Fare hayvancılık ve taşıma Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler), Birleşik Krallık ve Değişiklik Yönetmeliği 2012 Yasası 1986 ile uyumlu, UK Home Office düzenlemeleri ve UCL etik komite kurallarına uygundur.

NOT: Tüm çözümler dietil pyrocarbonate (DEPC) ile yapılmalıdır - herhangi bir kalıntı RNAaz ari yok etmek için arıtılmış su. tüm DEPC globülleri sonra kayboldu DEPC aşağılamak için otoklav kadar DEPC tedavi için, DEPC (litre başına 1 ml) ekleyin, şiddetle çalkalanır.

1. RNA Probe Sentezi

1. DİKKAT: formamid tutarken, Kişisel Koruyucu Ekipman (KKE) aşınma ve güvenlik kabini kullanın. Hibridizasyon tamponu hazırlayın: DEPC ile muamele edilmiş% 50 (h / h) deiyonize formamid, mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI, 5 mM EDTA, 10 ile, iyonu giderilmiş suyun 5 mM NaH ₂ PO _4, 5 mM _Na-2 HPO _4, 0.01 mg / ml maya tRNA, 1 x Denhardt solutiilgili ve% 10 / h dekstran sülfat ağ.
2. RNA polimeraz promotörüne sahip bir plazmid olarak, ilgi konusu genin cDNA dizisini ihtiva eden bir DNA klonu seçin. Bu örnek için, Aspa için T7 ve SP6 RNA polimeraz promoterleri (Ek Şekil 1) sahip bir pCMV-SPORT6 klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934) kullanın.
3. şablon olarak doğrusallaştırılmış plazma DNA hazırlanır.
   1. DNA klonunun büyütün T7 ve SP6 evrensel primerler ile üreticinin protokolüne ve sırasına göre, küçük-ölçekli bir plazmid arındırma kiti ile plazmid ekstrakte edin.
   2. cDNA'nın yönlü sarmal kolunun 5 'ucunda kesen bir sınırlama enzimi ile 1.020 | ig plazmid DNA Digest. Bu örnek için, pCMV-SPORT6- Aspa plazmid sindirimi 100 birim SalI kullanın. 37 ^o C'de 1.5 saat süreyle inkübe edin
   3. plazmid tamamen doğrusallaştırılmış olup olmadığını kontrol etmek bir agaroz jel üzerinde küçük bir kısım çalıştırın.
4. arındırmakfenol-kloroform kullanılarak doğrusallaştırılmış plazmit kullanmak avantajlıdır.
   1. 3 M sodyum asetatın 1/10 hacmi, 10 mM Tris HCI (pH 8.0), bir hacim ekleyin - dengelenmiş fenol ve kloroform / izoamil alkol (IAA), bir hacim (24: 1).
   2. (- 25 ° C, RT 20) ve özü, üst sulu faz, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin.
   3. 1 dakika için 16,000 x g'de kloroform / IAA, santrifüj, bir hacim ekleyin ve üst akıcı faz ekstrakte edin.
   4. Adımı tekrarlayın 1.4.3.
   5. Etanol 2 hacimleri ekleyin ve 1 saat ya da O / N -20 ^o C'de bırakın.
   6. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 16,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
   7. % 70 soğuk etanol ile pelet yıkanır ve TE içinde 2.5 ul başına approximatively 1 ug cDNA (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7.5) yeniden askıya.
5. İki prob, digoxigenin (DIG) ile etiketlenmiş bir ve flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile diğer sentez.
   1. Anti-se yapmak için uygun RNA polimeraz seçin(Hedefe mRNA tamamlayıcı) nse sonda. Bu örnek için, Aspa probu yapmak için T7 RNA polimerazını kullanır.
   2. In vitro transkripsiyon reaksiyonu hazırlayınız: 1 linearize DNA ug, 4.0 ul 5 x transkripsiyon tamponu, 100 mM DTT, 6.0 ul 10x DIG ya da FITC RNA işaretleme karışımı içeren dNTP 2.0 ul, 1 ul RNaz inhibitörü ve 20 - Tr 40 RNA polimerazının birim; DEPC arıtılmış su ile 20 ul son hacmi oluşturuyor.
   3. 1.5 saat 37 ^o C'de inkübe edin.
6. % 1.0 agaroz jeli üzerinde transkripsiyon reaksiyonunun IKAZ1 ul reaksiyon çalıştığı kontrol etmek için. Jel doğrusal şablonu ve prob parlak bir bant göstermesi gerekir.
7. melezleme tamponu ile 100 ul birimi oluşturacak ve -80 ° C'de 10 ul alikotları saklayın.

2. perfüzyon, Fiksasyon ve Doku Koleksiyonu

1. DİKKAT: (PFA) paraformaldehid taşırken hem katı hem deSulu, PPE giymek ve bir güvenlik kabini kullanın. ısı (55 ° C) PFA 1x olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (ağ / hac)% 4 çözülmesiyle formaldehid çözeltisi hazırlayın. filtre kağıdı ile formaldehit çözüm Filtre.
2. damıtılmış su içinde sükroz (ağ / hac)% 20 eritilerek sukroz çözeltisi hazırlayın ve% 0.1 (h / h) DEPC çözeltisi ilave edilir. gevşek kapaklı ve otoklav ile oda sıcaklığında O / N bırakın.
3. Son aşamada pentobarbitonun intra-peritoneal enjeksiyonu (50 mg / kg) ile fare uyuşturan. ayak tutam anestezi derinliği değerlendirmek ve geri çekme refleksi yokluğu derin anestezi gösterir.
4. Fare derin anestezi altına alındıktan sonra, göğüs kafesine altında bir kesi yapmak ve her iki tarafta göğüs kafesinin kesti, kalp maruz kaldırın.
5. kalbin sol ventrikül içine 25 G iğne takın. kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak.
6. 20 mi, PBS ile hayvan ve daha sonra 40 mi formaldehid çözeltisi serpmek. P30 ve üzerifareler, 12 ml / dk'lık bir perfüzyon oranı kullanıldığında daha genç hayvanlar daha düşük bir oranı kullanım için (7-10 ml / dakika).
7. beyin teşrih.
   1. Kulağımıza gelen bir kesim posterior yaparak cerrahi makas ile fare kafasını Sever. deride bir kaudal orta hat kesi yapmak ve kafatası cilt kaldırmak için rostrally çalışır.
   2. kaudal kısmından başlayarak, orta hat boyunca kafatasının üst kısmından ve İris makasla gözler arasındaki kesti. Bir kemik plaka bir tarafını her zaman devrilir ve cımbız ile kapalı yakalamaya tarafından parietal ve frontal kemik plakaları çıkarın.
   3. Yavaşça cımbız ile ön kısmından yukarı doğru beyin tilt ve optik sinirleri ve diğer kranial sinirler kesilir. Yavaşça kafatası dışına beyin kaldırın.
8. Bir fare koronal beyin matriks içine beyin yerleştirin. Bir tüy jilet ile 3 yaklaşık 4 mm parçalar halinde beyin dilimleyin.
9. % 4 PFA çözeltisi içine dilim aktarın ve 4 ° C'de O / N inkübe edin.
10. aktarım beyindilim-DEPC işlenmiş% 20 sukroz çözeltisi ve 4 ° C 'de, O / N kuluçkalanması
11. kuru cryomould içine her beyin dilim koyun, optimum kesme sıcaklığı (OCT) orta ile çevreleyen ve kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C'de saklayın.

3. Cryosectioning

1. Bir kriyostat içinde donmuş doku 15 mikron bölümleri kesmek ve mikroskop lamı üzerine bölümleri toplamak. Eğer gerekirse, DEPC ile muamele edilmiş, PBS ile bölümleri ıslak ve ince bir fırça ile düzleştirin.
2. Doku slayt uygun olduğundan emin olmak için yaklaşık 1 saat boyunca kurumaya slaytlar bırakın.

4. Melezleme

1. 65 ° C yıkama tamponu hazırlayın: 150 mM NaCI, 15 mM _Na-3 Cı _{3H 5} O (COO) ₃ (= 1x tuzlu su, sodyum sitrat), 50% (h / h) formamid ile% 0.1 (h / h) Tween 20.
2. 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI,% 0.1 (h / h) Tween-20, pH 7,5: MABT tamponu hazırlayın.
3. DIG etiketli ve FITC-işaretlenmiş (iki prob seyreltind) hibridizasyon tampon maddesi içinde 1 / 1.000 65 ° C'ye önceden ısıtılmış ve iyice karıştırın.
4. Her bir slayt, coverslipwith fırında pişmiş (200 ^° C) lamelleri üzerine hibritleme karışımının yaklaşık 300 ul uygulayın ve nemli bir oda içinde 65 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin.
5. önceden ısıtılmış yıkama tampon içeren bir Coplin kavanoza slaytlar aktarın. Yıkama tamponu ile 65 ° C 'de iki kez 30 dakika için slaytlar yıkayın.
6. Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle MABT ile üç kez slaytlar yıkayın.

FITC Probe 5. Görselleştirme

1. ISH engelleme tamponu hazırlayın: MABT% 2 bloke reaktif ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu.
2. İsteğe bağlı: Gerekli antikor çözümleri hacmini azaltmak için slayt doku bölümleri etrafında daireler çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın.
3. ISH nemlendirilmiş bir odada Blokaj tamponu ile oda sıcaklığında 1 saat için slaytlar inkübe edin.
4. bir yaban turbu peroksidaz ile 4 ° C'de (POD) de slaytlar O / N inkübe - konjugatD, anti-FITC antikoru 1/500 (h / h) ISH engelleme tamponu seyreltilmiştir.
5. % 0.1 (h / h) Tween-20 (PBST) ile PBS içeren bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin. her PBST içinde 10 dakika süre ile 3 kere yıkayın ve taze PBST ile değiştirin.
6. Kullanımdan hemen önce, Amplifikasyon seyreltici olarak 100 kez seyreltilmesi ile floresan tiramid hazırlar. Bu örnek için, FITC-tiramid kullanımı.
7. slaytlar bu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
8. Bir Coplin kavanoza slaytlar yerleştirin ve 10 dakika süre ile PBST içinde 3 kez yıkayın.

DIG Probe 6. Görselleştirme

1. 0.1 M Tris-HCl, pH 8.2 hazırlanır.
2. Oda sıcaklığında 1 saat için ISH bloke edici tampon ile slaytlar inkübe edin.
3. bir alkalin fosfataz (AP) ile 4 ° C'de slaytlar O / N inkübe seyreltildi 1 / 1.500 (h / h) ISH engelleme tamponu, anti-DIG antikoru ile konjüge edilmiş.
4. 10 dakika için üç kez MABT ile yıkayınız.
5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 M Tris-HCI pH 8.2 ile iki kez yıkanır.
6. Kullanımdan hemen önce, 0.1 M Tris, pH 8.2 tabletler çözülmesiyle Hızlı Kırmızı solüsyon hazırlanır. 0.22 um'lik bir filtreden filtre solüsyonu.
7. nemli bir oda içinde Hızlı Kırmızı çözelti ile 37 ° C'de slaytlar inkübe edin. uygun gelişimi için geçen sürenin de, çökeltinin oluşumuna izlemek için flüoresan mikroskop ile düzenli slaytlar edin. 3 saat - Bu örnekte, 2, sonra reaksiyonu durdurun.
8. 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır.

7. İmmünhistokimya

1. IHC bloke tamponu hazırlayın:% 10 PBST (birincil antikor konak için farklı türlerin) (h / h) serum.
2. IHC nemlendirilmiş bir odada, oda sıcaklığında 1 saat süre ile blokaj tamponu ile slaytlar inkübe edin.
3. Primer antikor hazırlanması (birincil antikor konakçıya farklı türlerin)% 5 serum ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında primer antikor seyreltin. Bu örnekte, 1/400 (h / h) seyreltmede bir tavşan anti-olig2 antikor kullanımı.
4. 4 ° de CO / N primer antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
5. 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır.
6. İkincil antikor hazırlanması: Bu örnekte ve% 0.1 (h / h) Hoechst 33258. (farklı bir birincil antikor konak türlerin)% 5 ile PBST içinde, uygun bir seyreltme oranında (hac / hac), serum, bir florofor-konjuge sekonder antikor seyreltik 1 / 1.000 (h / h) seyreltmede ikincil antikor Alexa647 bir eşek anti-tavşan kullanın.
7. 1 saat boyunca oda sıcaklığında ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
8. 10 dakika için üç kez PBST ile yıkanır.

8. Montaj

1. Kısmen oda sıcaklığında slaytlar kuru ve, floresan montaj ortamına sahip monte edilir. Hızlı Red için 570 nm, FITC için 488 nm, olig2 immüno için 647 nm ve Hoechst için 350 nm: 10X altında konfokal mikroskop sonra, 20X ve aşağıdaki uyarma dalga boyları ile 4 farklı kanalları kullanarak 63X hedefleri görüntü kuru ve slaytlar bırakın .

Sonuçlar

Bu makalede, bir fare beyin bölümlerinde immüno ardından çift flüoresan ISH için bir yöntem tarif eder. Bu protokolün kısa bir açıklama ilk adım Aspa ve MBP (miyelin bazik proteini) özel problar sentezlemek oldu Şekil 1'de gösterilmiştir. Probes sentezlenmiş olduğunu kontrol etmek için, her bir reaksiyonun küçük bir kısım, bir agaroz jel üzerinde yürütülmüştür. Hafif lineer şablonu ve RNA probu büyük miktarda

Tartışmalar

Bu protokol immün tarafından takip In situ hibridizasyon çift RNA için bir adım-adım prosedürü sağlar. Biz Aspa birkaç beyin bölgelerindeki olgun oligodendrosit ifade edilmektedir onaylamak için bu protokolü kullanılır.

Bu çok aşamalı prosedür hassasiyetini etkileyebilir ve kaçınılmalıdır pek çok potansiyel tuzaklar vardır. İlk olarak, transkripsiyon reaksiyonu için tüm çözümleri ve depolama tamponlar RNaz ücretsiz olması gerekir. İkinci o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Deionized formamide	Sigma	F9037	for ISH blocking buffer
Sodium chloride	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Hydrochloric acid	VWR International	20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Sigma	S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma	30435
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt's solution	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Aspa cDNA clone	Source Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Sodium acetate	Sigma	S2889
Equilibrated phenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Isoamyl alcohol	Aldrich	496200
Ethanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polymerase	Promega	P4074
Transcription buffer	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Filter paper	Fisher scientific	005479470
Sucrose	Sigma	59378
Diethyl pyrocarbonate	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Dissecting scissors	World Precision Instruments	15922
25 gauge needle	Terumo	300600
Peristaltic pump	Cole-Parmer Instrument Co. Ltd	WZ-07522-30
Iris scissors	Weiss	103227
No.2 tweezers	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Razor blade	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Cryostat/microtome	Bright
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	for 65 °C wash buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Heat-inactivated sheep serum	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
.22 µM filter	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody	Life technologies	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica