JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Abstract

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Introduction

وعلى الرغم من قدرة تجديد رائعة من خلايا الكبد 1، والتي هي كبرى نوع من الخلايا متني من الكبد، فشل الكبد المزمن يضعف هذه القدرة، مما يؤدي إلى خلية سلفية الكبدية (HPC) تجديد معتمد على 2.

ويستمد تلف الكبد المزمن بشكل رئيسي من تعاطي الكحول، التهاب الكبد الوبائي المزمن فيروس (HCV) إصابة 3 و غير الكحولية مرض الكبد الدهني (NAFLD) 4. أنه يؤدي إلى تليف الكبد المستمر، الذي يرتبط مع تراكم البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). استمرار تراكم ECM يشوه بنية الكبد سليمة من خلال تشكيل ندبة الأنسجة الليفية 5، مما أدى لاحقا في تليف الكبد مع معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة. وقد بذلت محاولات كثيرة لتخفيف استجابة التليف أساسا من خلال التركيز على تثبيط السيتوكينات profibrogenic وmyofibroblasts تنشيط 6. ويستمد هذا الأخير في المقام الأول من خلايا النجمية الكبدية (Hالمنبوذة)، وخلايا الكبد حيث المبدأ غير متني المسؤولة عن تشكيل ندبة الكبد 4. ومع ذلك، علاجات التجدد التي تحفز مصادر الخلوية الذاتية بما في ذلك HPCS على تجديد خلايا الكبد في وجود الشتائم التليف متواصلة في انتظار مزيد من التحقيقات.

وقد وصفت العديد من النماذج التجريبية من التليف الكبدي في الثدييات. وقد استخدم على نطاق واسع حقن المتكرر من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4) للحث على التليف في الكبد في الفئران والجرذان نماذج 7. عندما جنبا إلى جنب مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون (HF)، قاد الكحول إلى upregulation كبير في التعبير الجيني profibrogenic والتليف الكبدي 8. في حين تنكس دهني (تراكم الدهون) ناتج عن التعرض الكحول الحاد، فهو يجعل الكبد عرضة للإصابة الكبد أشد 9.

الزرد، دانيو rerio، ظهرت كنظام نموذج الفقاريات لا تقدر بثمن لدراسة تجديد. رغم أنالفقاريات الأخرى أقل مثل سمندل الماء وقنافذ البحر لديها قدرة فائقة على التجدد، والزرد ومزايا أكثر من النظم نموذج الأخرى في ما يخص استراتيجيات التلاعب الجيني والتصور اللازم لمعالجة التجدد المحتمل عوامل 10. يمثل الزرد أيضا نموذجا الفقاريات جذابة لدراسة أمراض الكبد الكحولية (محددة المدة) ببساطة عن طريق إضافة الإيثانول (ETOH) إلى المياه. الحادة ETOH التعرض لالزرد اليرقات والكبار تسبب تشحم الكبد 11-13. عندما تلقى الزرد الكبار التعرض ETOH موسعة، وقد لوحظ ترسب الكولاجين مع upregulation من الجينات ذات الصلة التليف 14. ومع ذلك، توجد حاجة لتطوير نماذج لدراسة تجديد الكبد ردا على ETOH كحافز التليف.

مؤخرا، قمنا بتطوير نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH في الزرد 15. نحن الجمع بين نظام الاجتثاث الوراثية-الكبدية محددة مع العلاج ETOH في اليرقات وأدولر الزرد. ولدت لنا اثنين من خطوط المعدلة وراثيا، تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1 وتيراغرام (fabp10a: mCherry-NTR) GT2، التي تنصهر القولونية nitroreductase (NTR) إلى السماوي وmCherry بروتين فلوري، على التوالي، تحت سيطرة من الأحماض الدهنية الكبدية محددة ملزمة 10A البروتين، والكبد الأساسي (fabp10a) المروج. في هذا النظام، NTR يحول ميترونيدازول دواء مساعد غير سام (MTZ) في الحمض النووي بين حبلا ربط عبر وكيل 16، استحثاث موت صريح من خلايا الكبد. استخدام هذا النموذج، أثبتنا أن مجموعة من الخلايا الكبدية، والتي تستجيب لإشارات الشق، وتحويلها إلى خلايا الكبد في غياب القريب من خلايا الكبد وفي الزيادة من ECM. بعثنا هذه الخلايا كما HPCS. وعلاوة على ذلك، من خلال شاشات الكيميائية، حددنا تفعيل جزيء صغير من إشارات Wnt ومثبطات يشير الشق أن زيادة تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة. Therefoإعادة، لدينا نموذج الكبد متليفة في الزرد يمثل نظام الفحص الكيميائي رائع بالمقارنة مع اختلاف الثقافات الخلية أو نظام الفرز على أساس الثدييات. وهو في الجسم الحي مع نظام من حيث التكلفة كبيرة وفوائد لتوفير الوقت. نحن هنا وصف الإجراءات التفصيلية لإنشاء نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH ولأداء شاشات الكيميائية باستخدام هذا النموذج في الزرد. وعلاوة على ذلك، تم إجراء التحليلات الوقت طبعا للتحقيق في كيفية تجديد خلايا الكبد ويحدث في الكبد متليفة. وهذا البروتوكول توفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة آليات واستراتيجيات لتعزيز تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأثيرت الزرد ولدت باستخدام بروتوكول قياسي يحقق المعايير من المعاهد الوطنية للصحة والتي وافق عليها معهد جورجيا للتكنولوجيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. إعداد حلول

  1. إعداد 20 لتر ماء بيضة (تستخدم بالتبادل مع "المتوسطة الجنين ') للحفاظ على الجنين الزرد / اليرقات. حل 1.5 غرام كبريتات 4 و 6 ز المحيط حظة ملح البحر في 250 مل من الماء المقطر. تصب في الدامجانة زجاجة مليئة 20 L الماء المقطر وتستنهض الهمم.
  2. إعداد 1 L (PTU) محلول المخزون-2-ثيوريا 1-فينيل (20x و). حل 0.6 غرام من مسحوق PTU في 1 لتر من الماء المقطر. إضافة 1 مل من المحلول لكل 20 مل الجنين المتوسطة إلى تركيز النهائي من 0.003٪ كحل العمل.
    تنبيه: PTU قد يسبب سمية جهازية بعد الاستنشاق أو التعرض عن طريق الجلد. إعداد واستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية معالجة مناسبة.
  3. إعداد 1 لتر إيثيل 3-aminobenzoate حل الأسهم methanesulfonate (تريكين) (20x و). حل 4 غرام من مسحوق تريكين في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7 بإضافة 1 M تريس العازلة (الرقم الهيدروجيني 9)، وجلب الحجم النهائي إلى 1 L مع الماء المقطر. قسامة إلى 50 مل ومخزن في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد قبل الاستخدام.
    تنبيه: تريكين يمكن أن تحفز على فقدان الإحساس. إعداد واستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية معالجة مناسبة.
  4. إعداد 100 مل ميترونيدازول اليرقات (MTZ) حل العاملة. جعل الطازجة 15 ملي MTZ حل عن طريق إذابة 0.25 غرام من مسحوق MTZ في 0.1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في 100 مل المتوسطة الجنين. حل مسحوق MTZ تماما من اهتزاز قوي. جعل حل MTZ الطازجة واستخدام رقائق الألومنيوم لمنع تدهور بهوتوكاتاليتيك من MTZ.
    تنبيه: MTZ قد يسبب تهيج. إعداد واستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية معالجة مناسبة.
  5. إعداد 100 مل من محلول العمل اليرقات الإيثانول / ميترونيدازول (ETOH / MTZ). جعل حل MTZ الطازجة واستخدام رقائق الألومنيوم لمنع دي ضوئيتدرج من MTZ. إضافة 1.5 مل الإيثانول بنسبة 100٪ إلى 100 مل من محلول MTZ إلى تركيز النهائي من 1.5٪ فقط قبل الاستخدام.
  6. إعداد 500 مل الكبار MTZ حل العاملة. جعل الطازجة 10 ملي حل MTZ بحل 0.83 غرام من مسحوق MTZ في 0.1٪ DMSO في 500 مل من الماء النظام. حل مسحوق MTZ تماما من اهتزاز قوي. جعل حل MTZ الطازجة واستخدام رقائق الألومنيوم لمنع تدهور بهوتوكاتاليتيك من MTZ.
  7. إعداد 1 عازلة L بيم. حل 30.2 أنابيب ز، ز 0.74 EGTA، و 0.12 غرام MgSO 4 في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7 مع هيدروكسيد الصوديوم. جلب الحجم النهائي إلى 1 L مع الماء المقطر.

2. إعداد يرقات اسماك الزرد

  1. إعداد التزاوج من [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] 15،17 الكبار الزرد مع TG (hand2: EGFP) PD24 13 الزرد الكبار في خزانات التزاوج. استخدام فواصل لإجراء التزاوج في الوقت المناسب.
  2. إزالة دivider في صباح اليوم التالي والسماح الأسماك للتزاوج دون انقطاع. الأجنة الحصاد في وقت لاحق 2 ساعة عبر توتير المياه النظام ونقل الأجنة إلى 100 ملم أطباق بتري مع المتوسط ​​الجنين.
  3. لا تحتفظ بأكثر من 100 الأجنة في طبق بيتري. تحت مجهر تشريحي، وإزالة بويضة غير مخصبة باستخدام ماصة الزجاج. تنمو الأجنة عند 28 درجة مئوية وإضافة الفنيل (PTU) إلى تركيز النهائي من 0.003٪ بعد 10 ساعة بعد الإخصاب (HPF) لمنع تطور الصباغ.

3. الإيثانول، ميترونيدازول العلاج والكبد التجديد في اليرقات الزرد

  1. يعد حل ETOH جديدة من خلال إضافة الإيثانول إلى المتوسطة الجنين إلى التركيز النهائي من 1.5٪. لا تقم بإضافة PTU.
  2. علاج الأجنة مع 20 مل من محلول الإيثانول في طبق بتري 56-80 HPF. تغطية أطباق بتري مع غلاف بلاستيكي لمنع الإيثانول التبخر.
  3. فرز [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11 سوب>. TG (hand2: EGFP) PD24] اليرقات مع حجم الكبد مماثل، على النحو الذي يحدده التعبير CFP، في 80 HPF. لا تستخدم تريكين عندما يكون الترتيب اليرقات المعالجة ETOH لأن هذا سوف يسبب ارتفاع معدل الوفيات مع العلاج ETOH / MTZ اللاحقة. حافظ على اليرقات التي تم فرزها في مناطق ذات كثافة من 30 الأجنة في طبق بيتري.
  4. إعداد الطازجة 15 ملي MTZ في المتوسط ​​الجنين في 0.1٪ DMSO. إضافة كمية مناسبة من ETOH إلى حل MTZ لجعل تركيز النهائي من 1.5٪. احتضان اليرقات في 20 مل من محلول ETOH / MTZ في طبق بتري لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. تغطية أطباق بتري مع الاغطية البلاستيكية للحفاظ على تركيز ETOH ومع رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء.
  5. في نهاية العلاج، وإزالة حل ETOH / MTZ عن طريق نقل اليرقات إلى أطباق بتري جديدة مع المتوسط ​​الجنين جديدة. غسل اليرقات 3 مرات مع المتوسط ​​الجنين والاحتفاظ بها في 20 مل الجنين المتوسطة دون PTU.
  6. لفرز اليرقات مع الاجتثاث شبه الكامل للخلايا الكبد، ومراقبة مضانتحت المجهر epifluorescence مع فلتر CFP في التكبير من 80X. النتائج الاجتثاث الناجحة في الحد الأدنى من مضان CFP في الكبد وانخفاض كبير في حجم الكبد.
  7. لتجنب موت اليرقات المعاملة MTZ-ETOH /، لا تستخدم تريكين للفرز. إصلاح اليرقات لالمناعية (راجع القسم 5) أو الاحتفاظ اليرقات التي تم فرزها في أطباق بتري عند 28 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.

4. شاشات الكيميائية في المعالجة MTZ-ETOH / يرقات اسماك الزرد

  1. تقديم لوحات 96-جيدا تحتوي على 10 ملي الأسهم الكيميائية في DMSO (يرجى الرجوع إلى قائمة المواد للحصول على تفاصيل بشأن المكتبات الكيميائية التجارية) من الفريزر -80 درجة مئوية. يغطى بورق الألمنيوم لمنع تدهور الضوئي للمواد الكيميائية. ذوبان الجليد الحلول الأسهم في RT مع هزاز لطيف.
  2. تحضير المحاليل الكيميائية عن طريق تمييع 10 الحلول الأسهم ملم مع المتوسط ​​الجنين إلى التركيز النهائي من 50 ميكرومتر (في 96 لوحات جيدة: الصورة الأوليةcreen. في 1.5 مل أنابيب: إعادة الاختبار). تم علاج اليرقات السيطرة مع تركيزات متساوية من DMSO في المتوسط ​​الجنين.
  3. نقل اليرقات مع الاجتثاث شبه الكامل الكبدية، التي كانت تعامل مع 1.5٪ ETOH / 15 ملي MTZ وفرزها كما سبق ذكره، إما 96-جيدا (الشاشة الأولي) أو 24-جيدا (إعادة الاختبار) لوحات المعبأة مسبقا مع المتوسط ​​الجنين في كثافة 5 يرقات لكل بئر. استخدام الآبار مكررة لكل مادة كيميائية.
  4. إزالة المتوسطة الجنين وإضافة أي 250 ميكرولتر (لوحات 96-جيدا) أو 500 ميكرولتر (24-جيدا لوحات) المحاليل الكيميائية إلى كل بئر. بطانات بورق الألمنيوم وعلاج اليرقات لمدة 50 ساعة على 28 درجة مئوية. تفقد اليرقات التي تمتص المواد الكيميائية يوميا وإزالة أي اليرقات الميتة من الآبار الفردية.
  5. في نهاية علاج الكيميائي، ومراقبة عدد و / أو شدة خلايا الكبد CFP، معربا تحت المجهر epifluorescence مع فلتر CFP في التكبير من 80X. صورة الحية تظهر يرقات تعزيز أو تقليلعدد د و / أو كثافة خلايا الكبد، معربا عن CFP مع كاميرا رقمية للسجلات.
  6. الحفاظ على اليرقات التي كتبها تثبيت الفورمالديهايد للتصوير مبائر كما هو موضح في المادة 5.
  7. لإعادة اختبار مستوى المواد الكيميائية التي تسهل تجديد خلايا الكبد في الشاشة الأولى، ودراسة فعاليتها في تركيزات أعلى وأدنى للعثور على تركيز معظم فعال مع الإجراءات الموضحة في 4،1-4،5 ( 'إعادة الاختبار).

5. يرقات اسماك الزرد التثبيت، المناعية، ومتحد البؤر التصوير

  1. تخدير اليرقات بإضافة تريكين إلى تركيز النهائي من 0.02٪. نقل 10-15 اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل ويغسل مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من الطازجة 2٪ الفورمالديهايد في المخزن بيم لإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
    تنبيه: الفورمالديهايد يسبب تهيج وأنه من المعروف أن مادة مسرطنة الإنسان. التعامل في غطاء الدخان الكيميائية.
  2. تجاهل تحديد الحل بشكل صحيح ومن ثم واش 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في RT. اليرقات الثابتة يمكن أن تظل في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى عدة أيام. الانتقال إلى الخطوة التالية يعطي على الفور النتائج المناعية أفضل.
  3. إزالة بعناية صفار البيض والجلد الذي يغطي منطقة الكبد باستخدام رقم 55 ملقط تحت مجهر تشريحي.
  4. Permeabilize وكتلة اليرقات في المخزن بلوك (4٪ زلال المصل البقري و 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. احتضان مع أرنب المضادة للالكولاجين أنا الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 100 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات لمدة 15 دقيقة مع كل غسل عازلة (0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني).
  6. احتضان مع AlexaFluor 647 حمار مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 200 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع العازلة غسل. ثم يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  7. نقل بلطف اليرقات على الشرائح الزجاجية باستخدام ماصة الزجاج، واليرقات ثابت توجيه مع الجانب الجانبي الأيسر مواجها لها. إزالة الزائد PBS باستخدام Kimwipes. إضافة قطرة من وسائل الاعلام المتزايدةوختم غطاء زجاجي مع طلاء الأظافر. إجراء التصوير متحد البؤر فورا ينصح إلى حد كبير.
  8. استخدام نظام متحد البؤر مجهزة عدسة 40X / 1.3 النفط لالتقاط الصور. استخدام قوة الليزر على 20-50٪. التقاط الصور كومة Z في 1 ميكرومتر فترات.

6. إعداد اسماك الزرد الكبار

  1. إعداد التزاوج من [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] 15،17 الزرد الكبار في خزانات التزاوج. حصاد الأجنة في صباح اليوم التالي عبر توتير المياه النظام ونقل الأجنة في أطباق بتري 100 ملم مع المتوسطة الجنين.
  2. لا تحتفظ بأكثر من 100 الأجنة في طبق بيتري. تحت مجهر تشريحي، وإزالة بويضة غير مخصبة باستخدام ماصة الزجاج. تنمو الأجنة عند 28 درجة مئوية وإضافة PTU إلى تركيز النهائي من 0.003٪ بعد 10 HPF لمنع تطور الصباغ.
  3. في 4 DPF، استخدم تريكين لتخدير اليرقات وفرز [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR)GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] اليرقات. تغسل تريكين عن طريق تغيير الجنين المتوسطة عدة مرات الطازجة. السماح اليرقات لاسترداد عند 28 درجة مئوية حتى تحقيق معدل ضربات القلب الطبيعي لل120-180 نبضة في الدقيقة 18.
  4. رفع اليرقات المفروزة إلى 6-12 شهرا على أساس الإجراء العادي 19.

7. الإيثانول، ميترونيدازول العلاج، والكبد التجديد في اسماك الزرد الكبار

  1. نقل 6-12 شهرا [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] الكبار الزرد إلى خزانات التزاوج باستخدام الشبكة. حفاظ على الأسماك في مناطق ذات كثافة لا تزيد عن 10 السمك في خزان.
  2. يعد حل ETOH جديدة عن طريق إضافة ETOH في المياه النظام إلى تركيز النهائي من 1٪. علاج الأسماك الكبار مع 500 مل حل ETOH في كل خزان والمحافظة عليها في 28 حاضنة درجة مئوية.
  3. الأسماك نقل الكبار إلى حل ETOH الطازجة يوميا، ونبذ ميت دعامة الأسماكerly باعتبارها واقية. علاج مستمر الحيوانات لمدة 72 ساعة قبل العلاج MTZ.
  4. إعداد الطازجة حل 10 ملم MTZ في الماء النظام في 0.1٪ DMSO. قبل تدفئة حل MTZ في 28 درجة مئوية الحاضنة. علاج السمك مع 500 مل حل MTZ في 1 لتر خزان معبر لمدة 8 ساعة على 28 درجة مئوية، وحماية من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  5. مراقبة كل ساعة أثناء فترة العلاج وإزالة الأسماك النافقة على الفور. تجاهل الأسماك النافقة بشكل صحيح كما هو واقية. في نهاية العلاج MTZ، تغسل MTZ عن طريق نقل الحيوانات إلى نظام المياه العذبة مرتين.
  6. سماح للحيوانات لاستعادة والحفاظ عليها في حاضنة عند 28 درجة مئوية. تغذية ونقل الأسماك إلى المياه منظومة جديدة يوميا حتى نقطة زمنية للتحاليل.

8. اسماك الزرد الكبار الكبد التثبيت، المناعية، ومتحد البؤر التصوير

  1. تخدير الأسماك البالغة مع 0.02٪ تريكين والموت ببطء في الماء المثلج لمدة 15 دقيقة. بات الجافة السمك على منشفة ورقية ووضعه على حصيرة تشريح.
  2. كشف أجهزة الجهاز الهضمي عن طريق إزالة الجلد والعضلات كما سبق وصفها 20. استخدام المقص لقطع الجلد والعضلات الكامنة على طول البطن من الزعنفة الشرجية على الغطاء الخيشومي، ثم الخلف على طول الجانب من الأسماك إلى الزعنفة الشرجية.
  3. وضع الأسماك في أنبوب مخروطي 15 مل ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 4 مل من الطازجة 2٪ الفورمالديهايد في المخزن بيم لإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
  4. تجاهل تحديد الحل بشكل صحيح، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في RT. عينات الثابتة يمكن أن تظل في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أيام. الانتقال إلى الخطوة التالية يعطي على الفور النتائج المناعية أفضل.
  5. تشريح الأمعاء كله مع الكبد من تجويف جسم السمكة عن طريق قطع المريء. تضمين أجهزة الجهاز الهضمي مع 4٪ المنخفضة للذوبان الاغاروز في قالب باجتزاء.
  6. استخدام vibratome لقطع العينات في المقاطع العرضية في 50 ميكرومتر فترات في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني، بدءا من نهاية الأمامي. نقل ثانيةستعقد لوحة 6 جيدا مع برنامج تلفزيوني باستخدام فرشاة الطلاء # 1.
  7. Permeabilize وأقسام كتلة في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية.
  8. احتضان مع أرنب المضادة للالكولاجين أنا الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 100 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات، كل مع العازلة غسل لمدة 15 دقيقة.
  9. احتضان مع AlexaFluor 647 حمار مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 200 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات، 15 دقيقة لكل منهما مع العازلة غسل ومرة ​​واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  10. نقل بلطف أقسام على الشرائح الزجاجية باستخدام فرشاة الطلاء # 1. إزالة الزائد PBS باستخدام Kimwipes، إضافة قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة، وغطاء ختم الزجاج بطلاء الأظافر. إجراء التصوير متحد البؤر فورا واقترح للغاية.
  11. استخدام نظام متحد البؤر مجهزة عدسة 40X / 1.3 النفط لالتقاط الصور. استخدام قوة الليزر على 20-50٪. التقاط الصور كومة Z في 1 ميكرومتر فترات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويبين الشكل (1) وتطوير نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH في الزرد اليرقات. لتحسين بروتوكول لتعريض اليرقات الزرد إلى ETOH، علينا أولا تقييم ETOH سمية. في مرحلة ما بعد الإخصاب أيام تعرضت 2.5 (DPF) يرقات إلى تركيز ETOH 1٪، 1.5٪، أو 2٪ لمدة 24 ساعة تليها 24 ساعة ETO...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لاحظنا بوساطة HPC الكبدية تجديد في كبد ETOH / MTZ المعاملة يتعافى، مما يشير إلى أنه حتى في وجود كمية كبيرة من البروتينات ECM بما في ذلك نوع ييفي أنا الكولاجين، وHPCS تحتفظ كفاءتهم لتجديد خلايا الكبد كما. وقال إن MTZ فقط المعالجة لا تزيد ترسب البروتينات ECM بشكل ملحوظ، في حين أن ETOH ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من GTEC (2731336 و 1411318)، والمعاهد الوطنية للصحة (K01DK081351)، وجبهة الخلاص الوطني (1354837) لكلية العلوم الصحية نشكر عالم جيورجيس للقراءة نقدية للمخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)AcrosAC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4)EMDMX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EthanolSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldehydeFisher ScientificF79-500
Metronidazole (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)Sigma-AldrichA5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tabletAmrescoE404Dissolve one tablet with 100 ml distilled water
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Bovine serum albuminFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Low-melting agarose AmrescoBP165
Stem Cell Signaling Compound LibrarySelleck ChemicalsL210010 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K LibraryTimtecActiProbe-1K10 mM stock in DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Dissolve with DMSO to 10 mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Dissolve with DMSO to 10 mM
Anti-Collagen I antibodyAbcamab23730Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)Molecular ProbesA31573Use at 1:200 for immunostaining
Mounting media (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 mm Petri dishVWR25384-088
24-well plateVWR10062-896
ForcepsFine Science Tools11255-20Dumont #55
Glass slideVWR48312-00375x25 mm
Cover glassVWR48366-04518 mm
Plastic wrapFisher Scientific22305654
Aluminum foilFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomeLeicaVT1000 S
Stereo microscopeLeicaM80
Epifluoresence microscopeLeicaM205 FA
Confocol microscopeZeissLSM700

References

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137(2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

111 nitroreductase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved