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Resumo

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Resumo

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Introdução

Apesar da notável capacidade de regeneração de hepatócitos 1, que são o tipo de célula parenquimatosa grande do fígado, insuficiência hepática crónica prejudica essa capacidade, levando a célula progenitora hepática (HPC) regeneração dependente 2.

Lesão hepática crônica é essencialmente derivada de abuso de álcool, o vírus da hepatite C crônica (HCV) 3 e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) 4. Ele conduz a fibrose do fígado sustentada, que está associada com a acumulação de proteínas da matriz extracelular (ECM). Persistindo acumulação ECM distorce a arquitetura hepática intacta através da formação de um tecido fibroso de cicatriz 5, posteriormente, resultando em cirrose com alta morbidade e mortalidade. Muitas tentativas têm sido feitas para reduzir a resposta fibrótica, principalmente, concentrando-se em inibir citocinas profibrogenic e miofibroblastos activados 6. Este último é derivado principalmente de células estreladas hepáticas (HSCs), as células não-parenquimatosas hepáticas responsáveis ​​principais para a formação de cicatriz hepática 4. No entanto, as terapias de regeneração que estimulam fontes celulares endógenos, incluindo HPCs para regenerar hepatócitos na presença de insultos fibrogênicas sustentados aguardam uma investigação mais aprofundada.

Muitos modelos experimentais de fibrose hepática foram descritos em mamíferos. Injecção repetida de tetracloreto de carbono (CCl 4) tem sido amplamente utilizado para induzir a fibrose do fígado em modelos de rato e de murino 7. Quando combinado com uma dieta de elevado teor de gordura (HF), álcool levou a uma regulação positiva da expressão do gene substancial profibrogenic e fibrose hepática 8. Enquanto esteatose (acumulação de lípidos) resulta da exposição aguda do álcool, faz o fígado suscetível a lesões hepáticas mais graves 9.

O peixe-zebra, Danio rerio, tem emergido como um inestimável sistema modelo para o estudo de vertebrados regeneração. Emboraoutros vertebrados inferiores, tais como tritões e axolotls têm uma notável capacidade de regeneração, o peixe-zebra tem vantagens sobre outros sistemas modelo em relação às estratégias de manipulação genética e visualização necessários para manipular potencial regenerativo fatores 10. O peixe-zebra também representa um modelo atractivo para estudar vertebrado doença hepática alcoólica (ALD) pela simples adição de etanol (EtOH) para a água. A exposição aguda EtOH para peixe-zebra larval e adulto causada esteatose hepática 11-13. Quando peixe-zebra adulto recebeu a exposição EtOH estendida, deposição de colágeno foi observada com a regulação positiva de genes relacionados à fibrose 14. No entanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de modelos para estudar a regeneração do fígado em resposta a um estímulo de EtOH como fibrogênica.

Recentemente, desenvolvemos um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra 15. Nós combinados um sistema de ablação genética específicos de hepatócitos com o tratamento de EtOH em larvas e adult de peixe-zebra. Geramos duas linhagens transgênicas, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 e Tg (fabp10a: mCherry-NTR) gt2, no qual E.coli nitro-redutase (NTR) são fundidos ao ciano e proteína fluorescente mCherry, respectivamente, sob o controle do ácido graxo específico do hepatócito de ligação 10a proteína, fígado básico (fabp10a) promotor. Neste sistema, NTR converte um pró-f ármaco não tóxico metronidazol (MTZ) num ADN agente de reticulação inter-cadeia 16, induzir a morte explícita dos hepatócitos. Utilizando este modelo, foi demonstrado que uma população de células hepáticas, que respondem à sinalização de Notch, convertido em hepatócitos na quase ausência de hepatócitos e o excesso de ECM. Nós designado essas células como HPCs. Além disso, através de telas químicas, identificamos pequenas ativadores de moléculas de sinalização Wnt e inibidores da sinalização Notch que aumentam a regeneração de hepatócitos no fígado fibrótico. Therefore, o nosso modelo de fígado fibrótico no peixe-zebra representa um sistema de triagem química excelente em comparação com cultura- celular ou sistema de triagem de mamíferos-based. É um sistema in vivo, com custo significativo e benefícios de economia de tempo. Aqui nós descrevemos os procedimentos detalhados para o estabelecimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol e para a realização de telas químicos usando este modelo no peixe-zebra. Além disso, foram realizadas análises de tempo-curso para investigar a forma como a regeneração de hepatócitos no fígado ocorre fibrótica. Este protocolo irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos e estratégias de reforço de hepatócitos regeneração no fígado fibrótico.

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Protocolo

Peixe-zebra foram levantadas e criados usando um protocolo padrão que atenda aos critérios dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Instituto de Tecnologia da Geórgia Institutional Animal Care e do Comitê Use.

1. Preparação de Soluções

  1. Prepare 20 L de água de ovo (intercambiável usado com "médio embrião ') para manter peixe-zebra embrionária / larval. Dissolver 1,5 g CaSO 4 e 6 g de sal do mar instantânea oceano em 250 ml de água destilada. Despeje em um garrafão cheio com 20 L de água destilada e agite.
  2. Prepare 1 L (PTU) solução estoque-2-tioureia 1-fenil (20x). Dissolve-se 0,6 g de pó PTU em 1 L de água destilada. Adicionar 1 ml de solução de reserva por 20 ml de meio de embrião para uma concentração final de 0,003% como uma solução de trabalho.
    CUIDADO: PTU pode causar toxicidade sistémica após inalação ou exposição dérmica. Preparar e usar, de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  3. Prepare 1 L de acetato de 3-aminobemetanossulfonato (tricaina) solução estoque nzoate (20x). Dissolve-se 4 g tricaina pó em água destilada. Ajustar o pH a 7 por adição de tampão Tris 1 M (pH 9), e levar o volume final a 1 litro com água destilada. Alíquota para 50 ml e armazenar a -20 ° C. Descongelar antes de usar.
    CUIDADO: tricaina pode induzir uma perda de sensação. Preparar e usar, de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  4. Prepare 100 ml de solução de metronidazol larval (MTZ) trabalhando. Adicione solução fresca 15 MTZ mM por dissolução de 0,25 g do MTZ em pó 0,1% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) em 100 ml de meio de embrião. Dissolver MTZ pó completamente por agitação vigorosa. Faça solução MTZ fresco e utilizar folha de alumínio para evitar a degradação fotocatalítica de MTZ.
    CUIDADO: MTZ pode causar irritação. Preparar e usar, de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  5. Preparar solução de trabalho de 100 ml de etanol larvar / metronidazol (EtOH / MTZ). Faça solução MTZ fresco e utilizar folha de alumínio para evitar de fotocatalíticogradação da MTZ. Adicionar 1,5 ml de 100% de etanol em 100 ml de solução de MTZ para uma concentração final de 1,5% imediatamente antes da utilização.
  6. Prepare 500 ml de solução de trabalho de adultos MTZ. Faça fresco solução a 10 MTZ mM por dissolução de 0,83 g MTZ pó em 0,1% DMSO em 500 ml de água do sistema. Dissolver MTZ pó completamente por agitação vigorosa. Faça solução MTZ fresco e utilizar folha de alumínio para evitar a degradação fotocatalítica de MTZ.
  7. Preparar um tampão de L PEM. Dissolver 30,2 g tubulações, 0,74 g EGTA e 0,12 g MgSO4 em água destilada. Ajustar o pH a 7 com NaOH. Levar o volume final a 1 L com água destilada.

2. Preparação de larvas de peixe-zebra

  1. Configurar o acasalamento de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 peixe-zebra adulto com Tg (hand2: EGFP) PD24 13 adulto zebrafish em tanques de acasalamento. Use divisórias para realizar o acasalamento cronometrado.
  2. Remover o divider na manhã seguinte e permitir que os peixes para acasalar sem interrupções. embriões colheita 2 horas mais tarde por esforço água do sistema e transferir os embriões em 100 mm placas de Petri com meio embrião.
  3. Mantenha há mais de 100 embriões por placa de Petri. Sob um microscópio estereoscópico, remover os ovos não fertilizados usando uma pipeta de vidro. Cresça embriões a 28 ° C e adiciona-feniltioureia (PTU) para uma concentração final de 0,003% após 10 horas pós-fertilização (HPF) para inibir o desenvolvimento de pigmentos.

3. O etanol, Tratamento Metronidazol e fígado Regeneração na larval Zebrafish

  1. Preparar a solução de EtOH fresco por adição de etanol no meio de embrião para uma concentração final de 1,5%. Não adicione PTU.
  2. Tratar os embriões com uma solução de etanol a 20 ml por placa de Petri de 56-80 HPF. Cobrir placas de Petri com filme plástico para evitar a evaporação do etanol.
  3. Classificar para fora [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] larvas com tamanho semelhante fígado, como determinado por expressão da PCP, a 80 HPF. Não use tricaina ao classificar as larvas tratadas com EtOH, porque isso irá causar elevada taxa de mortalidade, com posterior tratamento EtOH / MTZ. Manter larvas classificada a uma densidade de 30 embriões por placa de Petri.
  4. Prepare fresco mM MTZ 15 em meio embrião em 0,1% DMSO. Adicionar uma quantidade apropriada de EtOH em solução MTZ para fazer uma concentração final de 1,5%. Incubar larvas em 20 ml de solução de EtOH / MTZ por placa de Petri durante 24 h a 28 ° C. Cobrir placas de Petri com filme plástico para manter a concentração EtOH e com folha de alumínio para proteger da luz.
  5. No final do tratamento, remover a solução de EtOH / MTZ através da transferência de larvas para novas placas de Petri com meio fresco embrião. Lavar as larvas 3 vezes com meio embrião e mantê-los em 20 ml de meio de embrião sem PTU.
  6. Para resolver as larvas com a ablação quase completa dos hepatócitos, observar fluorescênciasob um microscópio de epifluorescência, com o filtro de PCP com uma ampliação de 80X. Resultados da ablação com sucesso em um mínimo de fluorescência PCP no fígado e volume do fígado reduzida significativamente.
  7. Para evitar a morte das larvas tratadas MTZ EtOH /, não use tricaina para classificação. Corrigir as larvas para a imunocoloração (consulte a secção 5) ou manter larvas classificada em placas de Petri a 28 ° C para posteriores análises.

4. Telas químicos em tratados MTZ EtOH / larval Zebrafish

  1. Trazer as placas de 96 poços contendo 10 mM stocks químicos em DMSO (consulte a lista de materiais para obter detalhes sobre as bibliotecas químicas comerciais) dos -80 ° C congelador. Cubra com papel alumínio para evitar a degradação fotocatalítica de produtos químicos. Descongelar as soluções estoque em temperatura ambiente com agitação suave.
  2. Prepare soluções químicas por diluição de soluções de estoque 10 mM com meio embrião para uma concentração final de 50 uM (em placas de 96 poços: s inicialcreen; em tubos de 1,5 ml: reteste). larvas de controlo foram tratadas com concentrações iguais de DMSO em meio de embrião.
  3. Transferência das larvas com ablação completa ou quase completa de hepatócitos, os quais foram tratados com 1,5% de EtOH / MTZ 15 mM e classificadas como acima mencionado, quer para 96 ​​poços (tela) ou 24 poços (reteste) placas pré-cheio com meio de embrião a uma densidade de 5 larvas por poço. Use poços duplicados para cada produto químico.
  4. Remover o meio e adicionar embrião, quer 250 ul (placas de 96 cavidades) ou 500 ul (placas de 24 poços) soluções químicas a cada poço. Cubra as placas com folha de alumínio e tratamento de larvas por 50 horas a 28 ° C. Inspecione larvas de imersão química diária e remover qualquer larvas mortas em poços individuais.
  5. No final do tratamento químico, observar o número e / ou a intensidade de hepatócitos que expressam PCP sob um microscópio de epifluorescência, com o filtro de PCP com uma ampliação de 80X. Fotografia ao vivo mostrando larvas reforçada ou reduzirnúmero d e / ou intensidade de hepatócitos expressando PCP com uma câmera digital para registros.
  6. Preserve larvas por fixação em formol para a imagem latente confocal como descrito no capítulo 5.
  7. Para testar novamente os produtos químicos que facilitam a regeneração de hepatócitos no ecrã inicial, examinar a sua potência em concentrações mais elevadas e mais baixas para encontrar a concentração mais eficaz com os procedimentos descritos no 4,1-4,5 ( 'reanálise').

5. larval Zebrafish Fixation, imunocoloração e Imagem Confocal

  1. Anestesiar larvas adicionando tricaina a uma concentração final de 0,02%. Transferir 10-15 larvas para um tubo de 1,5 ml e lava-se uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover PBS e adicionar 1 mL de 2% preparada de fresco em tampão PEM formaldeído para fixar O / N a 4 ° C.
    CUIDADO: O formaldeído provoca irritação e é conhecido por ser um carcinogéneo humano. Pega em um exaustor química.
  2. Descartar solução de fixação adequadamente e, em seguida, WAsh 3 vezes com PBS à temperatura ambiente. larvas fixas podem ser mantidos em PBS a 4 ° C durante até vários dias. Prosseguir para a próxima etapa dá prontamente melhores resultados de positividade.
  3. Remova cuidadosamente gema e pele que cobre a área do fígado usando um # 55 fórceps sob microscópio estereoscópico.
  4. Permeabilizar e larvas de bloco em tampão de bloqueio (4% de albumina de soro bovino e 0,3% de Triton X-100 em PBS) O / N a 4 ° C.
  5. Incubar com anticorpo de coelho anti-colagénio I a uma diluição de 1: 100 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes durante 15 minutos cada, com tampão de lavagem (0,3% de Triton X-100 em PBS).
  6. Incubar com AlexaFluor anticorpo anti-coelho de burro conjugado 647, a uma diluição de 1: 200 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes durante 15 minutos cada, com tampão de lavagem. Em seguida, lavar uma vez com PBS.
  7. Gentilmente transferir larvas de lâminas de vidro usando uma pipeta de vidro, e as larvas fixo oriente com o lado lateral esquerdo virado para cima. Retire o excesso de PBS utilizando Kimwipes. Adicionar uma gota de meio de montagemE tampa de vidro selo com unha polonês. Realização de imagem confocal imediatamente é muito recomendada.
  8. Use um sistema confocal equipado com uma lente de 40X / 1.3 petróleo para capturar imagens. Use a força do laser em 20-50%. Capturar imagens da pilha Z em intervalos de 1 mm.

6. Preparação de Zebrafish Adulto

  1. Configurar o acasalamento de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 peixe-zebra adulto em tanques de acasalamento. Colheita de embriões na manhã seguinte por esforço água do sistema e transferir os embriões em placas de Petri de 100 mm com meio embrião.
  2. Mantenha há mais de 100 embriões por placa de Petri. Sob um microscópio estereoscópico, remover os ovos não fertilizados usando uma pipeta de vidro. Cresça embriões a 28 ° C e adicionar o PTU para uma concentração final de 0,003% após 10 HPF para inibir o desenvolvimento de pigmentos.
  3. Às 4 dpf, use tricaina para anestesiar as larvas e resolver [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] larvas. Lave a tricaina mudando para embriões médio várias vezes frescos. Permitir larvas para recuperar a 28 ° C até atingirem a taxa normal do coração de 120-180 batimentos por minuto 18.
  4. Levante larvas classificada para 6-12 meses de idade com base no procedimento padrão de 19.

7. Etanol, Tratamento Metronidazol, e Liver Regeneração Zebrafish Adulto

  1. Transferir 6-12 meses de idade [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] adulto peixe-zebra para tanques de acasalamento com uma rede. Manter o peixe a uma densidade de não mais de 10 peixes por tanque.
  2. Preparar a solução de EtOH fresco por adição de EtOH em água do sistema a uma concentração final de 1%. Trate peixes adultos com 500 ml solução EtOH em cada tanque e mantê-los em um 28 ° C incubadora.
  3. peixes transferência de adultos para solução EtOH fresco diariamente, descarte prop peixes mortosErly como um risco biológico. Continuamente tratar os animais durante 72 horas antes do tratamento MTZ.
  4. Preparar a solução MTZ 10 mM fresco na água do sistema em 0,1% DMSO. Pré-aquecer a solução de MTZ em uma incubadora de 28 ° C. Tratar peixe com 500 ml de solução de MTZ em 1 L tanque de cruzamento, durante 8 h a 28 ° C, protegido da luz utilizando folha de alumínio.
  5. Observe hora em hora durante o tratamento e remover os peixes mortos imediatamente. Descarte peixes mortos adequadamente como um risco biológico. No final do tratamento MTZ, lavar a MTZ através da transferência de animais para água do sistema fresco duas vezes.
  6. Permitir que os animais recuperar e mantê-las em uma incubadora a 28 ° C. Alimentar e transferência de peixe à água sistema de fresco diariamente até o ponto de tempo para análise.

8. Zebrafish Adulto fígado Fixation, imunocoloração e Imagem Confocal

  1. Anestesiar os peixes adultos com 0,02% tricaina e eutanásia em água de gelo durante 15 min. Seque a peixe em uma toalha de papel e coloque-o sobre um tapete de dissecação.
  2. Expor órgãos gastrointestinais, removendo a pele e os músculos, como descrito anteriormente 20. Utilize uma tesoura para cortar a pele e o músculo subjacente ao longo da barriga da barbatana anal para o opérculo, e, em seguida, posteriormente ao longo do lado do peixe de volta à barbatana anal.
  3. Coloque o peixe num tubo cónico de 15 mL e lavar uma vez com PBS. Remover PBS e adicionar 4 ml de 2% preparada de fresco em tampão PEM formaldeído para fixar O / N a 4 ° C.
  4. Descartar solução de fixação correctamente, e lavar 3 vezes com PBS à temperatura ambiente. As amostras fixadas podem ser mantidos em PBS a 4 ° C durante vários dias. Prosseguir para a próxima etapa imediatamente dá melhores resultados de positividade.
  5. Dissecar todo o intestino com o fígado a partir da cavidade do corpo do peixe, por corte do esófago. Incorporar os órgãos gastrointestinais com 4% baixo ponto de fusão de agarose em um molde de corte.
  6. Usar um vibratome para cortar amostras em secções transversais em intervalos de 50 mm em PBS gelado, a partir da extremidade anterior. transferir secções a placa de 6 poços com PBS usando um pincel # 1.
  7. Permeabilizar e secções de bloco em bloco de buffer o / n a 4 ° C.
  8. Incubar com anticorpo de coelho anti-colagénio I a uma diluição de 1: 100 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes, 15 min cada, com tampão de lavagem.
  9. Incubar com AlexaFluor anticorpo anti-coelho de burro conjugado 647, a uma diluição de 1: 200 em tampão de bloco S / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes, 15 min cada, com tampão de lavagem e uma vez com PBS.
  10. Gentilmente transferir seções para lâminas de vidro usando um pincel # 1. Retire o excesso de PBS utilizando Kimwipes, adicione uma gota de meio de montagem e tampa de vidro selo com unha polonês. Realização de imagem confocal imediatamente é altamente recomendado.
  11. Use um sistema confocal equipado com uma lente de 40X / 1.3 petróleo para capturar imagens. Use a força do laser em 20-50%. Capturar imagens da pilha Z em intervalos de 1 mm.

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Resultados

A Figura 1 mostra o desenvolvimento de um modelo de fígado de fibrose induzida por etanol no peixe-zebra larval. Para otimizar um protocolo para expor larvas do peixe para EtOH, primeiro avaliou a toxicidade EtOH. 2,5 dias pós-fertilização (DPF) larvas foram expostas a concentração de EtOH a 1%, 1,5%, ou 2% durante 24 horas seguido por um tratamento de 24 horas de EtOH / MTZ concomitante. A exposição a 2% de EtOH causaram elevada mortalidade, enquanto quase todas...

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Discussão

Observamos mediada por HPC regeneração de hepatócitos no fígado recuperando-tratada MTZ EtOH /, sugerindo que, mesmo na presença de uma quantidade substancial de proteínas de ECM, incluindo o tipo I fibrilar colagénio, os HPCs conservam a sua competência para regenerar como hepatócitos. A única MTZ-tratamento não aumentar a deposição das proteínas da MEC significativamente, ao passo que o único tratamento EtOH não induziu activação de HPC 15. Ao utilizar o tratamento combinado de EtOH / MTZ,...

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Divulgações

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte por doações do GTEC (2731336 e 1411318), o NIH (K01DK081351), ea NSF (1.354.837) para CHS Agradecemos Alem Giorgis para a leitura crítica do manuscrito.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)AcrosAC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4)EMDMX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EthanolSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldehydeFisher ScientificF79-500
Metronidazole (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)Sigma-AldrichA5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tabletAmrescoE404Dissolve one tablet with 100 ml distilled water
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Bovine serum albuminFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Low-melting agarose AmrescoBP165
Stem Cell Signaling Compound LibrarySelleck ChemicalsL210010 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K LibraryTimtecActiProbe-1K10 mM stock in DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Dissolve with DMSO to 10 mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Dissolve with DMSO to 10 mM
Anti-Collagen I antibodyAbcamab23730Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)Molecular ProbesA31573Use at 1:200 for immunostaining
Mounting media (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 mm Petri dishVWR25384-088
24-well plateVWR10062-896
ForcepsFine Science Tools11255-20Dumont #55
Glass slideVWR48312-00375x25 mm
Cover glassVWR48366-04518 mm
Plastic wrapFisher Scientific22305654
Aluminum foilFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomeLeicaVT1000 S
Stereo microscopeLeicaM80
Epifluoresence microscopeLeicaM205 FA
Confocol microscopeZeissLSM700

Referências

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