前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

要約

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

要約

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

概要

肝臓の主要な実質細胞型である肝細胞^1、の顕著な再生能力にもかかわらず、慢性肝不全、肝前駆細胞（HPC）依存性再生²につながる、この能力を損ないます。

慢性肝障害は、主にアルコールの乱用、慢性C型肝炎ウイルス（HCV）感染³及び非アルコール性脂肪肝疾患^（NAFLD）4から誘導されます。それは、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の蓄積に関連している持続的な肝線維症につながります。永続化ECMの蓄積はその後、高い罹患率と死亡率との肝硬変で、その結果、線維性瘢痕組織^5を形成することにより、無傷の肝アーキテクチャを歪めます。多くの試みがprofibrogenicサイトカインおよび活性化筋線維芽細胞^6を阻害^することに焦点を当て、主に線維化反応を緩和するために行われてきました。後者は主にH（肝星細胞に由来しますSCS）、肝臓の瘢痕形成⁴に責任原則肝非実質細胞。それにもかかわらず、持続的な線維形成侮辱の存在下で肝細胞を再生成するのHPCを含む内因性の細胞源を刺激する再生治療は、さらなる調査を待ちます。

肝線維症の多くの実験モデルは、哺乳動物において記載されています。四塩化炭素（CCl _4）の繰り返し注射が広くマウスおよびラットモデル⁷における肝線維症を誘導するために使用されてきました。高脂肪（HF）ダイエットと組み合わせると、アルコールはprofibrogenic遺伝子発現と肝線維症⁸の実質的なアップレギュレーションにつながりました。脂肪症（脂質蓄積）が急性アルコール暴露から生じるが、それはより重度の肝損傷⁹に肝臓が受けやすくなります。

ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは、再生を研究するための貴重な脊椎動物モデル系として浮上しています。しかしこのようなイモリやアホロートルなどの他の下等脊椎動物は、再生のための驚くべき能力を持っている、ゼブラフィッシュは、潜在的な回生要因^10を操作するために必要な遺伝子操作と可視化戦略に関して、他のモデル系を超える利点を有しています。ゼブラフィッシュは、単にそれらの水エタノール（エタノール）を添加してアルコール性肝疾患（ALD）を研究するための魅力的な脊椎動物モデルを表します。幼虫と大人のゼブラフィッシュへの急性エタノール曝露は、肝臓脂肪症^11-13を引き起こし^ました 。成体ゼブラフィッシュは、拡張エタノール曝露を受けたときに、コラーゲン沈着は、線維症関連遺伝子¹⁴のアップレギュレーションを観察しました。ただし、必要が線維形成刺激としてのEtOHに応じて、肝臓の再生を研究するためのモデルを開発するために存在します。

最近、我々はゼブラフィッシュ¹⁵におけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルを開発しました。私たちは、幼虫とADULにエタノール治療と肝細胞特異的遺伝子除去システム​​を組み合わせましたトンのゼブラフィッシュ。我々は2つのトランスジェニック系統を生成し、Tgは^{（fabp10a：CFP-NTR）GT1}及びTg（fabp10a：mCherryを^{-NTR）GT2、} 大腸菌ニトロレダクターゼ（NTR）が制御の下で、それぞれシアン、mCherryを蛍光タンパク質に融合されています肝細胞特異的な脂肪酸のタンパク質10aは結合、肝臓基本 （fabp10a）プロモーター。このシステムでは、NTRは、肝細胞の明示的な死を誘導する、DNAストランド間架橋剤¹⁶に非毒性のプロドラッグメトロニダゾール（MTZ）に変換します。このモデルを使用して、我々は、Notchシグナル伝達に応答する肝細胞の集団は、肝細胞の近くにない場合およびECMを超える肝細胞に変換することを実証しました。私たちは、HPCのように、これらの細胞を指定しました。さらに、化学画面を、我々は線維症、肝臓における肝細胞の再生を増強する小分子Wntシグナル伝達の活性化剤およびNotchシグナル伝達の阻害剤を同定しました。 Therefo再は、ゼブラフィッシュにおける当社の線維性肝臓モデルは、セルculture-または哺乳動物に基づくスクリーニングシステムと比較して、優れた化学的スクリーニングシステムを表します。これは、かなりの費用と時間節約のメリットとin vivo系です。ここでは、エタノール誘発性線維症肝臓モデルを確立するためのゼブラフィッシュでは、このモデルを用いて化学スクリーンを実行するための詳細な手順を説明します。また、経時的分析は、肝細胞の再生が線維性肝臓で発生方法の検討を行いました。このプロトコルは、線維性肝臓で肝細胞の再生を促進するメカニズムと戦略を研究するための貴重なツールを提供します。

プロトコル

ゼブラフィッシュは上昇し、国立衛生研究所の基準を満たしており、ジョージア工科大学施設内動物管理使用委員会により承認された標準プロトコルを使用して飼育しました。

ソリューションの調製

1. 胚/幼虫のゼブラフィッシュを維持するために、（同義的に「胚培地」で使用される）20 Lの卵の水を準備します。蒸留水250ミリリットル中に1.5グラムのCaSO ₄と6グラムインスタント海の海の塩を溶解させます。 20 Lの蒸留水で満たされたカーボイに注ぎ、かき混ぜます。
2. 1 L 1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）ストック溶液（20倍）を準備します。 1 Lの蒸留水に0.6グラムのPTU粉末を溶かします。作動液として0.003％の最終濃度は、20 mlの胚培地当たりストック溶液1mlを加えます。
   注意：PTUは、吸入または皮膚暴露後の全身毒性を引き起こす可能性があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。
3. 1 Lのエチル3- aminobeを準備nzoateメタン（トリカイン）ストック溶液（20倍）。蒸留水で4グラムのトリカイン粉末を溶かします。 1 Mトリス緩衝液（pH 9）を加えることによりpHを7に調整し、蒸留水で1Lの最終容量をもたらします。 -20℃で50ミリリットルにアリコートとストア。使用前に解凍します。
   注意：トリカインは、感覚の喪失を誘導することができます。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。
4. 100ミリリットル幼虫メトロニダゾール（MTZ）ワーキング溶液を調製します。 100 mlの胚培地中の0.1％のジメチルスルホキシド（DMSO）0.25グラムMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な15mMのMTZ溶液を作ります。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。
   注意：MTZが、炎症を引き起こす場合があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。
5. 100ミリリットル幼虫のエタノール/メトロニダゾール（エタノール/ MTZ）ワーキング溶液を調製します。新鮮なMTZ溶液を作製し、光触媒ドを防ぐためにアルミ箔を使用MTZのグラデーション。使用直前に1.5％の最終濃度まで100ミリリットルMTZ溶液に1.5ミリリットルの100％エタノールを追加します。
6. 500ミリリットル大人MTZ作業溶液を準備します。 500ミリリットルシステムの水に0.1％のDMSO中に0.83グラムのMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な10mMのMTZソリューションを作成します。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。
7. 1 L PEMバッファを準備します。 30.2グラムのPIPES、0.74グラムのEGTA、および0.12グラムの蒸留水に_硫酸マグネシウム_を溶解させます。 NaOHでpHを7に調整します。蒸留水で1リットルに最終容量を持参。

幼虫のゼブラフィッシュの調製

1. [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配^GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを^）JH11] のTg（hand2：EGFP）で^15,17大人のゼブラフィッシュは、交配タンク内の¹³の大人のゼブラフィッシュを^PD24。時限交配を行うために仕切りを使用します。
2. Dを削除します翌朝ividerと魚が中断することなく交尾することを可能にします。 2時間後、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより収穫胚。
3. ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10時間ポスト受精（HPF）の後に0.003％の最終濃度にフェニルチオ尿素（PTU）を追加します。

幼虫ゼブラフィッシュ3.エタノール、メトロニダゾール治療と肝再生

1. 1.5％の最終濃度まで胚培地にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。 PTUを追加しないでください。
2. 56〜80 HPFからペトリ皿当たり20ミリリットルのエタノール溶液で胚を扱います。エタノールの蒸発を防ぐためにラップでペトリ皿をカバーしています。
3. ソートアウト[Tgは^{（fabp10a：CFP-NTR）GT1。} Tgは（Tp1の：mCherryを^）JH11 SUP>; Tgは（hand2：EGFP）同様の肝臓サイズと^PD24]幼虫、80 HPFで、CFP式によって決定されます。エタノールで処理した幼虫をソートするとき、これは、その後のエタノール/ MTZ処理と高い死亡率の原因となりますので、トリカインを使用しないでください。ペトリ皿当たり30の胚の密度でソートされた幼虫を保管してください。
4. 0.1％DMSO中の胚培地中で新鮮な15mMのMTZを準備します。 1.5％の最終濃度にするMTZ溶液にエタノールを適量加えます。 28℃で24時間、ペトリ皿当たり20ミリリットルのEtOH / MTZ溶液中の幼虫をインキュベートします。光から保護するために、エタノール濃度とアルミホイルでを維持するために、プラスチック製のラップでカバーペトリ皿。
5. 治療の終わりに、新鮮胚培地で新しいペトリ皿に幼虫を転送することによってエタノール/ MTZ溶液を除去。胚培地で幼虫を3回洗浄し、PTUなし20ミリリットル胚培地に保管してください。
6. 肝細胞のほぼ完全な切除で幼虫を整理するには、蛍光を観察します80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下で。肝臓での最小限のCFPの蛍光と大幅に減少肝体積で成功したアブレーション結果。
7. エタノール/ MTZ-処理した幼虫の死を回避するために、ソートにトリカインを使用しないでください。免疫染色のための幼虫を修正しました（セクション5を参照）、またはさらなる分析のために28℃でペトリ皿に並べ替えられた幼虫を保ちます。

エタノール/ MTZ-処理した幼虫のゼブラフィッシュ4.化学画面

1. DMSO中の10mMに化学銘柄を含む96ウェルプレートを持参℃の冷凍庫から-80（商業化学物質ライブラリーに関する詳細については、物質一覧を参照してください）​​。化学物質の光触媒分解を防ぐためにアルミホイルで覆います。緩やかに揺り動かしながら室温でストック溶液を解凍します。
2. 初期秒：96ウェルプレートで、50μMの最終濃度（に胚培地と10mMストック溶液を希釈して薬液を準備creen;再テスト）：1.5ミリリットルチューブインチ対照幼虫を胚培地中のDMSOの同じ濃度で処理しました。
3. 1.5％のEtOH / 15mMのMTZで処理し、96ウェル（初期画面）またはの密度で胚培地を予め充填し、24ウェル（再検査）プレートのどちらかに、前述のように分類したほぼ完全な肝切除と転送幼虫ウェルあたり5幼虫。各化学物質のための二連のウェルを使用してください。
4. 胚培地を削除し、各ウェルに250μlの（96ウェルプレート）または500μlの（24ウェルプレート）化学溶液のいずれかを追加します。アルミホイルでカバープレートとは、28℃で50時間、幼虫を扱います。毎日化学浸漬幼虫を点検し、個々のウェルからの任意の死んだ幼虫を削除します。
5. 化学的処理の終わりには、80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下でCFPを発現する肝細胞の数および/または強度を観察します。写真ライブ幼虫を増強または低下させる示しますD番号および/またはレコードのデジタルカメラでCFPを発現する肝細胞の強度。
6. セクション5で説明したように、共焦点イメージングのためのホルムアルデヒド固定によって幼虫を保持します。
7. 初期画面での肝細胞の再生を促進する化学物質を再テストするには、4.1から4.5（「再試験」）に記載されている手順と最も効果的な濃度を見つけるために、より高い及びより低い濃度でその効力を調べます。

5.幼虫ゼブラフィッシュ固定、免疫染色、および共焦点イメージング

1. 0.02％の最終濃度までトリカインを追加することによって幼虫を麻酔。 1.5mlチューブに10~15幼虫を移し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの1ミリリットルを追加します。
   注意：ホルムアルデヒドは炎症を引き起こし、ヒトの発癌物質であることが知られています。化学ドラフト内で取り扱います。
2. WA正しく、次いで溶液を固定捨てます室温でPBSでshが3回。固定された幼虫は、数日間まで4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、速やかに優れた免疫染色の結果が得られます。
3. 慎重に実体顕微鏡下で＃55ピンセットを用いて肝臓領域をカバー卵黄と皮膚を取り除きます。
4. 4℃で透過処理し、ブロックバッファ内のブロックの幼虫（4％のウシ血清アルブミン、PBS中の0.3％トリトンX-100）O / N。
5. 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液（PBS中0.3％トリトンX-100）で15分間ずつ5回洗浄します。
6. 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄バッファーで15分間ずつ5回洗浄します。その後、PBSで1回洗浄。
7. 静かに左側面を上に向けてガラスピペット、および配向固定幼虫を用いてガラススライドに幼虫を移します。キムワイプを使用して過剰のPBSを削除してください。取り付けメディアのドロップを追加します。マニキュアと、シールカバーガラス。すぐに共焦点イメージングを行うことは大いに推奨されます。
8. 画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。

アダルトゼブラフィッシュの6準備

1. [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配^GT1。 Tgは：交配タンク内（Tp1とmCherryを^{）JH11] 15,17}大人のゼブラフィッシュ。収穫は、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより、翌朝胚。
2. ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10 HPF後の0.003％の最終濃度にPTUを加えます。
3. 4 DPFでは、幼虫を麻酔し、整理してトリカインを使用して、[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）^GT1; Tgは（Tp1の：mCherryを^）JH11]幼虫。新鮮胚培地を数回に変更することにより、トリカインを洗浄します。彼らは分¹⁸あたり120〜180拍の正常な心拍数を達成するまで、幼虫は28℃で回復させます。
4. 標準的な手順¹⁹に基づいて、6-12ヶ月齢にソートされた幼虫を上げます。

アダルトゼブラフィッシュ7.エタノール、メトロニダゾール治療、および肝再生

1. 6-12ヶ月齢[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）転送^GT1を 。 Tgは：ネットを使用して、相手側のタンクへ（Tp1のmCherryを^）JH11]大人のゼブラフィッシュ。タンクあたり10個以下の魚の密度で魚を保管してください。
2. 1％の最終濃度になるようにシステム水にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。各タンク内の500ミリリットルのEtOH溶液で成魚を治療し、28℃のインキュベーターでそれらを維持します。
3. 毎日新鮮なエタノール溶液への転送成魚、廃棄死んだ魚の小道具バイオハザードとしてerly。連続MTZ処理の前に72時間のために動物を扱います。
4. 0.1％DMSO中にシステムの水に新鮮な10 mMのMTZ溶液を調製します。 28℃インキュベーターでMTZソリューションを事前に温めます。 28℃で8時間、1 L交差タンク内の500ミリリットルMTZ溶液で魚を扱い、アルミ箔を使用して、光から保護します。
5. 治療中に毎時確認し、すぐに死んだ魚を削除します。バイオハザードとして適切に死んだ魚を捨てます。 MTZ処理の終了時に、二回新鮮なシステムの水に動物を転送することによりMTZを洗い流します。
6. 動物は28℃のインキュベーター中で回復し、それらを維持することを可能にします。フィードおよび分析のための時点まで毎日新鮮なシステムの水に魚を移します。

8.アダルトゼブラフィッシュ肝臓固定、免疫染色、および共焦点イメージング

1. 0.02％トリカインで大人の魚を麻酔し、15分間氷水中で安楽死させます。パット魚ペーパータオル上で乾燥し、解剖マットの上に置きます。
2. 以前に^20を説明したように皮膚や筋肉を除去することにより、胃腸の臓器を公開します。臀鰭に戻って後方魚の側面に沿って、その後蓋に臀鰭から腹に沿って皮膚とその下の筋肉をカットするはさみを使用し、。
3. 15ミリリットルコニカルチューブに魚を入れ、PBSで1回洗浄。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの4ミリリットルを追加します。
4. 適切溶液を固定捨て、そして室温でPBSで3回洗浄します。固定したサンプルは、数日間、4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、すぐに優れた免疫染色の結果が得られます。
5. 食道を切断することによって、魚の体腔からの肝臓と全体の腸を解剖。セク金型内の低融点アガロース4％と胃腸器官を埋め込みます。
6. 前端から出発し、氷冷PBSで50μmの間隔で横断切片にサンプルをカットするためにビブラトームを使用してください。秒の転送＃1ペイントブラシを使用して、PBSで6ウェルプレートにション。
7. 4℃でブロックバッファO / Nでの透過処理およびブロックセクション。
8. 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液で5回、各15分間洗浄します。
9. 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄緩衝液で一度PBSで5回、各15分間洗浄します。
10. 静か＃1ペイントブラシを使用してガラススライドにセクションを転送します。キムワイプを使用して過剰のPBSを取り外し、取り付けメディアのドロップを追加し、マニキュアでカバーガラスをシール。共焦点イメージングを行うことは、すぐに非常に示唆されています。
11. 画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。

結果

図1は、幼虫のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発を示しています。 EtOH中にゼブラフィッシュの幼生を露出させるためのプロトコルを最適化するには、まずエタノールの毒性を評価しました。 2.5日 - 受精後（DPF）の幼虫をEtOH濃度1％、1.5％、または同時24時間のエタノール/ MTZ処理に続いて24時間2％を暴露しました。ほぼ...

ディスカッション

私たちも、私はコラーゲン線維状の型を含むECMタンパク質の実質的な量の存在下では、HPCのが肝細胞として再生するために自分の能力を保持していることを示唆し、エタノール/ MTZ-扱わ回復肝臓におけるHPC媒介肝細胞の再生を観察しました。エタノールのみ処理はHPCの活性化^15を誘導しなかったMTZのみ処理は、大幅にECMタンパク質の沈着を増加させませんでした。合わせたエタノール...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)	Acros	AC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4)	EMD	MX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)	Sigma-Aldrich	P6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-500
Metronidazole (MTZ)	Sigma-Aldrich	M3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tablet	Amresco	E404	Dissolve one tablet with 100 ml distilled water
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Low-melting agarose	Amresco	BP165
Stem Cell Signaling Compound Library	Selleck Chemicals	L2100	10 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K Library	Timtec	ActiProbe-1K	10 mM stock in DMSO
SB 415286	Selleck Chemicals	S2729	Dissolve with DMSO to 10 mM
CHIR-99021	Selleck Chemicals	S2924	Dissolve with DMSO to 10 mM
Anti-Collagen I antibody	Abcam	ab23730	Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Molecular Probes	A31573	Use at 1:200 for immunostaining
Mounting media (Vectorshield)	Vector Laboratories	H-1400
100 mm Petri dish	VWR	25384-088
24-well plate	VWR	10062-896
Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Dumont #55
Glass slide	VWR	48312-003	75x25 mm
Cover glass	VWR	48366-045	18 mm
Plastic wrap	Fisher Scientific	22305654
Aluminum foil	Fisher Scientific	1213100
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Vibrotome	Leica	VT1000 S
Stereo microscope	Leica	M80
Epifluoresence microscope	Leica	M205 FA
Confocol microscope	Zeiss	LSM700