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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Résumé

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Introduction

En dépit de la capacité de régénération des hépatocytes remarquable 1, qui sont le principal type de foie de cellules parenchymales, l' insuffisance hépatique chronique affecte cette capacité, conduisant à une cellule progénitrice hépatique (HPC) de régénération -dépendante 2.

Des dommages au foie chronique provient principalement de l' abus d'alcool, le virus de l' hépatite C chronique (VHC) 3 et non-alcoolisées maladie du foie gras (NAFLD) 4. Elle conduit à une fibrose hépatique soutenue, qui est associée à l'accumulation de protéines de matrice extracellulaire (ECM). Persistance accumulation ECM déforme l' architecture hépatique intacte en formant un tissu de cicatrice fibreuse 5, ce qui entraîne par la suite dans la cirrhose avec une forte morbidité et la mortalité. De nombreuses tentatives ont été faites pour atténuer la réponse fibrotique principalement en se concentrant sur ​​l' inhibition des cytokines et profibrogenic activés myofibroblastes 6. Ce dernier est principalement dérivé de cellules étoilées du foie (HSCs), les cellules non hépatiques parenchymateuses principaux responsables de la formation d' une cicatrice hépatique 4. Néanmoins, les thérapies régénératives qui stimulent les sources cellulaires endogènes, y compris les CAH pour régénérer les hépatocytes en présence d'insultes fibrogéniques soutenues attendent une enquête plus approfondie.

De nombreux modèles expérimentaux de la fibrose hépatique ont été décrits chez les mammifères. Injection répétitive de tétrachlorure de carbone (CCl 4) a été largement utilisé pour induire une fibrose du foie chez les souris et de rat modèles 7. Lorsqu'il est combiné avec un régime alimentaire riche en graisses (HF), l' alcool conduit à une régulation positive substantielle de l' expression du gène profibrogenic et la fibrose hépatique 8. Bien stéatose (accumulation de lipides) résulte de l' exposition aiguë à l'alcool, il rend le foie sensibles aux lésions hépatiques plus sévères 9.

Le poisson zèbre, Danio rerio, a émergé comme un système modèle vertébré précieux pour l' étude de la régénération. Bien qued' autres vertébrés inférieurs tels que les tritons et les axolotls ont une remarquable capacité de régénération, le poisson zèbre a des avantages par rapport aux autres systèmes de modèle en ce qui concerne les stratégies de manipulation génétique et de visualisation nécessaires pour manipuler régénérative potentiel des facteurs 10. Le poisson zèbre constitue également un modèle vertébré attrayant pour étudier une maladie hépatique alcoolique (ALD) par simple addition d'éthanol (EtOH) pour leur eau. L' exposition aiguë EtOH à zebrafish larvaire et adulte a causé la stéatose hépatique 11-13. Lorsque le poisson zèbre adulte a reçu une exposition de EtOH prolongée, le dépôt de collagène a été observée avec une régulation positive de gènes liés à la fibrose 14. Cependant, il existe un besoin pour le développement de modèles pour étudier la régénération du foie en réponse à l'EtOH comme un stimulant fibrogène.

Récemment, nous avons développé un modèle de foie fibrotique induit EtOH-zebrafish 15. Nous avons combiné un système d'ablation génétique spécifique hépatocytes avec un traitement EtOH dans larvaire et adult poisson zèbre. Nous avons généré des deux lignées transgéniques, Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1 et Tg (fabp10a: mCherry-NTR) gt2, dans lequel E. coli nitroreductase (NTR) sont fusionnées au cyan et mCherry protéine fluorescente, respectivement, sous le contrôle de la protéine de liaison 10a, le foie de base (fabp10a) promoteur acide gras spécifiques des hépatocytes. Dans ce système, NTR convertit un métronidazole promédicament non toxique (MTZ) dans un ADN inter-brin agent de réticulation 16, induisant la mort explicite des hépatocytes. En utilisant ce modèle, nous avons démontré qu'une population de cellules hépatiques, qui sont sensibles à la signalisation Notch, converti en hépatocytes en la quasi-absence d'hépatocytes et dans l'excès de l'ECM. Nous avons désigné ces cellules comme CAH. En outre, à travers des écrans chimiques, nous avons identifié les petites activateurs de molécules de signalisation Wnt et des inhibiteurs de la signalisation Notch qui augmentent la régénération hépatocytaire dans le foie fibrotique. Therefore, notre modèle de foie fibrotique chez le poisson zèbre représente un système de criblage chimique superbe par rapport à culture- cellulaire ou d'un système de dépistage des mammifères à base. Il est un système in vivo avec des coûts importants et des avantages de gain de temps. Nous décrivons ici les procédures détaillées pour établir un modèle de foie fibrotique induit EtOH et pour réaliser des écrans chimiques en utilisant ce modèle chez le poisson zèbre. De plus, des analyses de temps cours ont été réalisées pour étudier la façon dont la régénération des hépatocytes se produit dans le foie fibrotique. Ce protocole fournira un outil précieux pour étudier les mécanismes et les stratégies de renforcement de régénération des hépatocytes dans le foie fibrotique.

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Protocole

Zebrafish ont été soulevées et élevé en utilisant un protocole standard qui répond aux critères du National Institutes of Health et approuvés par le Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Préparation des solutions

  1. Préparer l'eau d'œuf de 20 L (utilisés de façon interchangeable avec «moyen d'embryons ') pour maintenir le poisson zèbre embryonnaire / larvaire. Dissoudre 1,5 g de CaSO 4 et 6 g de sel marin instantané de la mer dans 250 ml d' eau distillée. Verser dans une bonbonne remplie de 20 L d'eau distillée et agiter.
  2. Préparer 1 L (PTU) solution mère-2-thiourée 1-phenyl (20x). Dissoudre 0,6 g PTU poudre dans 1 litre d'eau distillée. Ajouter 1 ml de solution mère par 20 ml de milieu d'embryon à une concentration finale de 0,003% en tant que solution de travail.
    ATTENTION: PTU peut provoquer une toxicité systémique après inhalation ou exposition cutanée. Préparer et utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
  3. Préparer 1 L éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate (Tricaine) solution mère (20x). Dissoudre 4 g de poudre de Tricaine dans de l'eau distillée. Ajuster le pH à 7 par addition de tampon Tris 1 M (pH 9), et amener le volume final à 1 litre avec de l'eau distillée. Aliquoter dans 50 ml et conserver à -20 ° C. Décongeler avant utilisation.
    ATTENTION: Tricaine peut induire une perte de sensation. Préparer et utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
  4. Préparer 100 ml métronidazole larvaire (MTZ) solution de travail. Faire une solution fraîche 15 mM MTZ en dissolvant 0,25 g MTZ poudre dans 0,1% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans 100 ml de milieu d'embryon. Dissoudre la poudre MTZ complètement par agitation vigoureuse. Faire une solution fraîche MTZ et utiliser une feuille d'aluminium pour empêcher la dégradation photocatalytique de MTZ.
    ATTENTION: MTZ peut provoquer une irritation. Préparer et utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées.
  5. Préparer 100 ml larvaire éthanol / métronidazole (EtOH / MTZ) solution de travail. Faire une solution fraîche MTZ et utiliser une feuille d'aluminium pour empêcher photocatalytique degradation de MTZ. Ajouter 1,5 ml d'éthanol à 100% dans 100 ml d'une solution MTZ à une concentration finale de 1,5% juste avant l'utilisation.
  6. Préparer 500 ml d'une solution de travail adulte MTZ. Faire une solution fraîche 10 mM MTZ en dissolvant 0,83 g MTZ poudre dans 0,1% de DMSO dans 500 ml d'eau du système. Dissoudre la poudre MTZ complètement par agitation vigoureuse. Faire une solution fraîche MTZ et utiliser une feuille d'aluminium pour empêcher la dégradation photocatalytique de MTZ.
  7. Préparer 1 tampon L PEM. Dissoudre 30,2 g TUYAUX, 0,74 g EGTA, et 0,12 g MgSO 4 dans de l' eau distillée. Ajuster le pH à 7 avec NaOH. Amener le volume final à 1 L avec de l'eau distillée.

2. Préparation de larvaire Zebrafish

  1. Mettre en place l' accouplement de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulte avec Tg (hand2: EGFP) PD24 13 zebrafish adulte dans des réservoirs d'accouplement. Utilisez diviseurs pour effectuer l'accouplement chronométré.
  2. Retirez le divider le lendemain matin et permettre aux poissons de s'accoupler sans interruption. embryons de récolte 2 heures plus tard par la tension de l'eau du système et le transfert des embryons en 100 mm boîtes de Pétri avec un milieu d'embryon.
  3. Gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri. En vertu d'un stéréomicroscope, enlever les œufs non fécondés à l'aide d'une pipette en verre. Cultiver des embryons à 28 ° C et ajouter phénylthiourée (PTU) à une concentration finale de 0,003% après 10 heures post-fécondation (HPF) pour inhiber le développement de pigment.

3. L'éthanol, le traitement métronidazole et la régénération du foie dans larvaire Zebrafish

  1. Préparer une solution d'EtOH en ajoutant de l'éthanol dans le milieu de l'embryon à une concentration finale de 1,5%. Ne pas ajouter de PTU.
  2. Traiter les embryons avec une solution d'éthanol à 20 ml par boîte de Petri de 56 à 80 HPF. Couvrir les boîtes de Pétri avec une pellicule de plastique pour empêcher l'éthanol évaporation.
  3. Trier [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] larves avec la taille du foie similaire, tel que déterminé par l' expression de la PCP, à 80 HPF. Ne pas utiliser Tricaine lors du tri des larves de EtOH traité parce que cela va provoquer des taux de mortalité élevé avec traitement ultérieur EtOH / MTZ. Gardez les larves triées à une densité de 30 embryons par boîte de Pétri.
  4. Préparer frais mM MTZ 15 dans le milieu de l'embryon dans 0,1% de DMSO. Ajouter la quantité appropriée de l'EtOH dans une solution de MTZ pour obtenir une concentration finale de 1,5%. Incuber larves dans 20 ml de solution EtOH / MTZ par boîte de Pétri pendant 24 heures à 28 ° C. Couvrir les boîtes de Pétri avec une pellicule de plastique pour maintenir la concentration EtOH et de papier d'aluminium pour protéger de la lumière.
  5. A la fin du traitement, éliminer la solution EtOH / MTZ en transférant les larves à de nouvelles boîtes de Pétri avec un milieu d'embryons frais. Laver les larves 3 fois avec le milieu de l'embryon et les conserver dans 20 ml de milieu d'embryon sans PTU.
  6. Pour trier les larves avec l'ablation presque complète des hépatocytes, observer la fluorescencesous un microscope à épifluorescence avec le filtre de PDC à un grossissement de 80X. les résultats d'ablation avec succès dans un minimum de fluorescence PCP dans le foie et le volume du foie réduit de manière significative.
  7. Pour éviter la mort des larves EtOH / MTZ-traité, ne pas utiliser Tricaine pour le tri. Fixer les larves pour immunocoloration (voir la section 5) ou de garder les larves trié dans des boîtes de Pétri à 28 ° C pour d'autres analyses.

4. Ecrans chimiques dans EtOH / MTZ-traité larvaire Zebrafish

  1. Apportez les plaques à 96 puits contenant 10 mM stocks de produits chimiques dans le DMSO (se référer à la liste des matières pour les détails concernant les bibliothèques chimiques commerciales) à partir de -80 ° C congélateur. Couvrir de papier d'aluminium pour empêcher la dégradation photocatalytique de produits chimiques. Décongeler les solutions mères à la température ambiante avec doux balancement.
  2. Préparer des solutions chimiques par dilution de solutions mères à 10 mM avec du milieu d'embryon jusqu'à une concentration finale de 50 uM (dans des plaques à 96 puits: s initialcreen; dans 1,5 ml tubes: réanalyse). Les larves de contrôle ont été traitées avec des concentrations égales de DMSO dans du milieu d'embryon.
  3. Les larves de transfert avec presque complète l'ablation des hépatocytes, qui ont été traités avec 1,5% EtOH / mM MTZ 15 et trié comme mentionné ci-dessus, soit 96 puits (écran initial) ou 24 puits (retester) plaques prérempli avec le milieu de l'embryon à une densité de 5 larves par puits. Utilisez des puits en double pour chaque produit chimique.
  4. Éliminer le milieu de l'embryon et ajouter soit 250 ul (plaques à 96 puits) ou 500 ul (plaques à 24 puits), des solutions chimiques à chaque puits. Plaques de recouvrement avec une feuille d'aluminium et de traiter les larves de 50 h à 28 ° C. Inspecter les larves de produits chimiques de trempage quotidien et retirer toutes les larves mortes dans des puits individuels.
  5. A la fin du traitement chimique, d'observer le nombre et / ou l'intensité de la PCP hépatocytes exprimant sous un microscope à épifluorescence avec le filtre de PDC à un grossissement de 80X. Photo montrant des larves vivantes améliorée ou réduirenuméro d et / ou l'intensité des hépatocytes de la PCP exprimant avec un appareil photo numérique pour les enregistrements.
  6. Préserver les larves par fixation de formaldéhyde pour l'imagerie confocale comme décrit dans la section 5.
  7. Pour tester à nouveau les produits chimiques qui facilitent la régénération hépatocytaire dans l'écran initial, examiner leur activité à des concentrations supérieures et inférieures pour trouver la concentration la plus efficace avec les procédures décrites dans 4.1-4.5 ( «réanalyse»).

5. larvaire Zebrafish Fixation, immunocoloration et imagerie confocale

  1. Anesthésier larves par l'addition Tricaine à une concentration finale de 0,02%. 10-15 larves transférer dans un tube de 1,5 ml et laver une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer PBS et ajouter 1 ml de fraîchement préparé 2% de formaldéhyde dans un tampon PEM pour fixer O / N à 4 ° C.
    ATTENTION: Formaldéhyde provoque une irritation et est connu pour être cancérigène pour l'homme. Manipuler dans une hotte chimique.
  2. Jeter la solution de fixation appropriée puis wash 3 fois avec du PBS à température ambiante. Les larves fixes peuvent être conservés dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu'à plusieurs jours. En procédant à l'étape suivante donne rapidement de meilleurs résultats immunocoloration.
  3. Retirez délicatement le jaune et la peau recouvrant la région du foie en utilisant un # 55 forceps sous un stéréomicroscope.
  4. Et perméabiliser les larves de bloc dans un tampon bloc (4% d'albumine de sérum bovin et 0,3% de Triton X-100 dans du PBS) O / N à 4 ° C.
  5. Incuber avec un anticorps de lapin anti-collagène I à une dilution de 1: 100 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois pendant 15 minutes chacune avec le tampon de lavage (0,3% de Triton X-100 dans du PBS).
  6. Incuber avec AlexaFluor 647 âne conjugué anticorps anti-lapin à une dilution de 1: 200 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois pendant 15 min chacune avec le tampon de lavage. Ensuite, laver une fois avec du PBS.
  7. transférer doucement les larves sur des lames de verre à l'aide d'une pipette en verre, et les larves fixe orient avec le côté latéral gauche vers le haut. Retirer l'excès de PBS en utilisant Kimwipes. Ajouter une goutte de milieu de montage, Et le joint couvercle en verre avec du vernis à ongles. Réalisation d'imagerie confocale immédiatement est fortement recommandé.
  8. Utiliser un système confocal équipé d'un objectif 40X / 1,3 d'huile pour capturer des images. Utilisez la force de laser à 20-50%. Capture d'images de la pile Z à 1 pm intervalles.

6. Préparation des adultes Zebrafish

  1. Mettre en place l' accouplement de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulte dans des réservoirs d'accouplement. Récolte des embryons le lendemain matin en forçant l'eau du système et le transfert des embryons dans 100 mm boîtes de Pétri avec un milieu d'embryon.
  2. Gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri. En vertu d'un stéréomicroscope, enlever les œufs non fécondés à l'aide d'une pipette en verre. Cultiver les embryons à 28 ° C et ajouter PTU à une concentration finale de 0,003% au bout de 10 HPF pour inhiber le développement des pigments.
  3. A 4 dpf, utilisez Tricaine pour anesthésier les larves et les trier [Tg (fabp10a: CFP-NTR)gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larves. Laver Tricaine en changeant d'embryon milieu frais plusieurs fois. Laisser les larves de récupérer à 28 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent le rythme cardiaque normal de 120-180 battements par minute 18.
  4. Soulever les larves triées pour 6-12 mois sur la base de la procédure standard 19.

7. Ethanol, traitement métronidazole et Régénération hépatique à l'âge adulte Zebrafish

  1. Transfert 6-12 mois [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] zebrafish adulte aux réservoirs d'accouplement à l' aide d' un filet. Gardez le poisson à une densité de pas plus de 10 poissons par réservoir.
  2. Préparer une solution d'EtOH, en ajoutant de l'EtOH dans l'eau du système jusqu'à une concentration finale de 1%. Traiter les poissons adultes avec 500 ml de solution de EtOH dans chaque réservoir et de les maintenir dans un incubateur à 28 °.
  3. poissons Transfert adulte à la solution de EtOH frais tous les jours, rejets de poissons morts prop de poissonErly comme un biohazard. traiter en continu les animaux pendant 72 heures avant le traitement MTZ.
  4. Préparer une solution fraîche mM MTZ 10 dans l'eau du système dans 0,1% de DMSO. Préchauffer la solution de MTZ dans un incubateur à 28 °. Traiter le poisson avec 500 ml de solution MTZ dans 1 L réservoir de passage pendant 8 heures à 28 ° C, protéger de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium.
  5. Observez toutes les heures pendant le traitement et enlever les poissons morts immédiatement. Jeter les poissons morts correctement comme un danger biologique. A la fin du traitement MTZ, laver MTZ en transférant les animaux à l'eau du système frais deux fois.
  6. Permettre aux animaux de récupérer et de les maintenir dans un incubateur à 28 ° C. Nourrir et transférer le poisson à l'eau du système frais tous les jours jusqu'à ce que le point de temps pour les analyses.

8. Adulte Zebrafish Foie Fixation, immunocoloration et imagerie confocale

  1. Anesthetize poissons adultes avec 0,02% Tricaine et euthanasier dans l'eau glacée pendant 15 minutes. Pat le poisson sec sur une serviette en papier et placez-le sur un tapis de dissection.
  2. Exposer les organes gastro - intestinaux en enlevant la peau et les muscles comme précédemment décrit 20. Utilisez des ciseaux pour couper la peau et le muscle sous-jacent le long du ventre de la nageoire anale à l'opercule, puis en arrière le long du côté du poisson à la nageoire anale.
  3. Mettez le poisson dans un tube conique de 15 ml et laver une fois avec du PBS. Retirer du PBS et ajouter 4 ml de fraîchement préparé 2% de formaldéhyde dans un tampon PEM pour fixer O / N à 4 ° C.
  4. Jeter la solution de fixation correctement, et laver 3 fois avec du PBS à la température ambiante. des échantillons fixes peuvent être conservés dans du PBS à 4 ° C pendant plusieurs jours. En procédant à l'étape suivante donne immédiatement de meilleurs résultats immunocoloration.
  5. Disséquer tout l'intestin au foie de la cavité du corps du poisson en coupant l'oesophage. Incluez les organes gastro-intestinaux avec 4% à faible point de fusion d'agarose dans un moule sectionner.
  6. Utilisez un vibratome pour couper des échantillons dans des sections transversales à 50 um intervalles dans le froid de la glace PBS, à partir de l'extrémité antérieure. Transfert sections à plaque de 6 puits avec du PBS en utilisant un pinceau # 1.
  7. Perméabiliser et sections de bloc dans le bloc tampon O / N à 4 ° C.
  8. Incuber avec un anticorps de lapin anti-collagène I à une dilution de 1: 100 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois, 15 min chacun avec le tampon de lavage.
  9. Incuber avec AlexaFluor 647 âne conjugué anticorps anti-lapin à une dilution de 1: 200 dans le bloc tampon O / N à 4 ° C. Laver 5 fois, 15 min chacun avec un tampon de lavage et une fois avec PBS.
  10. transférer doucement sections sur des lames de verre à l'aide d'un pinceau # 1. Enlever l'excès de PBS en utilisant Kimwipes, ajoutez une goutte de milieu de montage, et le verre de couverture de joint avec du vernis à ongles. Réalisation d'imagerie confocale immédiatement est fortement suggéré.
  11. Utiliser un système confocal équipé d'un objectif 40X / 1,3 d'huile pour capturer des images. Utilisez la force de laser à 20-50%. Capture d'images de la pile Z à 1 pm intervalles.

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Résultats

La figure 1 montre le développement d'un modèle de foie fibrotique induit EtOH-zebrafish larvaire. Pour optimiser un protocole pour exposer les larves du poisson zèbre, EtOH, nous avons d'abord évalué la toxicité EtOH. 2,5 jours post-fécondation (dpf) larves ont été exposées à une concentration EtOH 1%, 1,5%, ou 2% pendant 24 heures suivie d'une concurrente 24 h EtOH traitement / MTZ. L'exposition à 2% d'EtOH a provoqué une mortalité él...

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Discussion

Nous avons observé HPC à médiation par régénération des hépatocytes dans le foie se rétablissent EtOH / MTZ traités, ce qui suggère que, même en présence d'une quantité importante de protéines de la MEC, notamment le type de collagène fibrillaire, les CAH conservent leur aptitude à se régénérer en hépatocytes. Le MTZ que le traitement n'a pas augmenté le dépôt de protéines ECM de manière significative, alors que le seul traitement EtOH n'a pas induit l' activation du HPC 15....

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Déclarations de divulgation

The authors declare that they have no competing financial interests.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du GTEC (2731336 et 1411318), le NIH (K01DK081351) et la NSF (1.354.837) au SHC Nous remercions Alem Giorgis pour la lecture critique du manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)AcrosAC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4)EMDMX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EthanolSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldehydeFisher ScientificF79-500
Metronidazole (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)Sigma-AldrichA5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tabletAmrescoE404Dissolve one tablet with 100 ml distilled water
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Bovine serum albuminFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Low-melting agarose AmrescoBP165
Stem Cell Signaling Compound LibrarySelleck ChemicalsL210010 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K LibraryTimtecActiProbe-1K10 mM stock in DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Dissolve with DMSO to 10 mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Dissolve with DMSO to 10 mM
Anti-Collagen I antibodyAbcamab23730Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)Molecular ProbesA31573Use at 1:200 for immunostaining
Mounting media (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 mm Petri dishVWR25384-088
24-well plateVWR10062-896
ForcepsFine Science Tools11255-20Dumont #55
Glass slideVWR48312-00375x25 mm
Cover glassVWR48366-04518 mm
Plastic wrapFisher Scientific22305654
Aluminum foilFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomeLeicaVT1000 S
Stereo microscopeLeicaM80
Epifluoresence microscopeLeicaM205 FA
Confocol microscopeZeissLSM700

Références

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
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  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
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