تكلس الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء والتصوير من الأورطي تكلس والتهاب

Summary

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات والأمراض في العالم، بما في ذلك الولايات المتحدة حيث تمثل ما يزيد عن 780،000 حالة وفاة سنويا. ¹ التاجي تكلس الشرايين وتكلس الأبهر هي السمات المميزة لمرض تصلب الشرايين ويعمل تنبؤ قوية اعتبارا من أحداث القلب والأوعية الدموية. ^2- تم الإبلاغ عن ⁴ نوعان رئيسيان من تكلس الأوعية الدموية لدى البالغين: تكلس باطنة، يرتبط مع تصلب الشرايين، وسطي (المعروف أيضا باسم منكيبيرغ) تكلس، ويرتبط مع مرض الكلى المزمن ومرض السكري يحدث ⁵ باطنة تكلس في الإعداد لتراكم الدهون والبلاعم. تسلل إلى جدار الوعاء الدموي يحدث ^5،6 الإنسي تكلس جدار مستقل عن تكلس باطنة، يموضع للألياف الإيلاستين أو خلايا العضلات الملساء، وغير مقترن ترسب الدهون أو تسلل بلعم. ^5،7،8 دراسات عن الآليات الجزيئية لوقد اعتمدت تكلس الأوعية الدموية على أنظمة نموذج قائم على الخلايا والحيوانات. وتشمل نماذج القوارض لمرض atherocalcific الفئران التي تعاني من نقص في أي ئي E (APOE) ^9،10 أو منخفض الكثافة مستقبلات البروتين الدهني (LDLR) ¹¹ تغذت على وجبات عالية الدهون، في حين تشمل نماذج للتكلس وسطي الفئران مع مصفوفة غلا البروتين (مجان) نقص ¹² أو الفئران التي تعاني بولينا إما عن طريق استئصال الكلية شبه الكامل (نموذج استئصال الكلية 5/6) أو عن طريق التعرض لاتباع نظام غذائي عالي الأدينين ¹³

هنا، يركز نموذج من تكلس الأوعية الدموية وسطي المرتبطة نقص مجان جرا. مجان هو بروتين الخلية الذي يمنع تكلس الشرايين. وقد تم تحديد ¹² الطفرات في الجين مجان في متلازمة Keutel، وهو مرض يصيب الانسان نادر يتصف تكلس الغضاريف منتشر بالإضافة إلى brachytelephalangy، فقدان السمع، وتضيق الرئوي الطرفية ^14-18 على الرغم من عدم كثيرا ما لاحظت، ¹⁹وقد وصفت تكلس متحدة المركز الشرايين متعددة في متلازمة Keutel. وترتبط ²⁰ الأشكال الشائعة في الجين مجان البشري مع خطر متزايد للتكلس الشريان التاجي، ^21-23 بينما مستويات تداول أعلى من uncarboxylated، مجان غير نشط بيولوجيا تتوقع وفيات القلب والأوعية الدموية. ²⁴ وخلافا للبشر مع متلازمة Keutel والفئران التي تعاني من نقص مجان تطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية الشديدة التي تتكون من تلقاء أنفسهم تكلس الشرايين على نطاق واسع ابتداء من اسبوعين من العمر ويموت 6-8 أسابيع بعد الولادة بسبب تمزق الشريان الأورطي. ¹²

على عكس APOE ^{- / -} وLDLR ^{- / -} الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون، التي تنمي تكلس الأوعية الدموية باطنة مع المرتبطة التهاب الناجم عن بلعم، مجان ^{- / -} الفئران تطوير تكلس الأوعية الدموية وسطي في غياب تسلل بلعم ^11،25 وعلى الرغم من وتشير هذه النتائج المحفزات الأساسية مختلفة لintimالقاعدة وتكلس وسطي، وهناك تداخل في آليات الإشارات التي تتوسط كلا أشكال تم تحديدها تكلس ²⁶ مسارات الإشارات المتعددة التي تساهم في تكلس الأوعية الدموية بما في ذلك وسطاء التهابات مثل عامل نخر الورم α و IL-1 والعوامل المؤيدة للالمكونة للعظم مثل الشق، WNT، والبروتين المخلق للعظم (BMP) الإشارة. ^27،28 تزيد هذه مسارات إشارات التعبير عن عوامل النسخ المتعلقة قزم عامل النسخ 2 (Runx2) وosterix، والتي بدورها تزيد من التعبير عن البروتينات ذات الصلة العظام ( . على سبيل المثال، أوستيوكالسين، sclerostin، والفوسفاتيز القلوية) في الأوعية الدموية التي تتوسط تكلس ^28-30 نحن وغيرنا قد أظهرت أن تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في APOE ^{- / -} وLDLR ^{- / -} تغذية الفئران حمية عالية الدهون وعفوية تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في مجان ^{- / -} الفئران وكلها تعتمد على البروتين المخلق للعظم (BMP) سيgnaling، وأنه هو هذا المسار تركز على هنا. ^11،25،31 أفضل الممارسات الإدارية هي العوامل المكونة للعظم قوية المطلوبة لتكوين العظام، ومن المعروف أن تظهر زيادة التعبير في تصلب الشرايين البشرية. وقد تورط ^32-34 في الدراسات المختبرية BMP الإشارات في تنظيم التعبير عن العوامل المكونة للعظم مثل Runx2. ^35-37 overexpression من يجند BMP، BMP-2، ويسرع تطوير تكلس الأوعية الدموية في الفئران APOE التي تعاني من نقص تغذية نظام غذائي عالي الدهون. ³⁸ وعلاوة على ذلك، فإن استخدام BMP محدد يشير مثبطات مثل هذه كما LDN-193189 (LDN) ^39،40 و / أو ALK3-FC يمنع وضع تكلس الأوعية الدموية في كل من LDLR ^{- / -} الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون والفئران التي تعاني من نقص مجان ^11،25.

الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء (VSMCs) دورا حاسما في تطوير تكلس الأوعية الدموية. ^30،41،42 وتكلس الأوعية الدموية وسطي أن يتطور في مجان التي تعاني من نقص الفئران هو characterized من قبل transdifferentiation من VSMCs إلى النمط الظاهري عظمي المنشأ. ويؤدي فقدان مجان في التعبير انخفض من علامات VSMC بما في ذلك myocardin وألفا الأكتين العضلات الملساء، مع ما يصاحب ذلك ارتفاع في علامات المكونة للعظم مثل Runx2 وosteopontin. وتتزامن هذه التغيرات مع تطور تكلس الأوعية الدموية. ^25،43،44

وعادة ما يتم تقييمها تكلس الشريان الأورطي والتهاب في الفئران باستخدام تقنيات النسيجية مثل نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية للتكلس المبكر والنشاط عظمي المنشأ، فون كوسا والصبغ الأحمر تلطيخ الأحمر في أواخر تكلس، والبروتوكولات المناعى التي تستهدف علامات البروتين بلعم (على سبيل المثال، CD68، F4 / 80، ماك-1، ماك-2، ماك-3). ^9،45 ومع ذلك، هذه التقنيات التصوير القياسية تتطلب معالجة الأنسجة الأبهري في المقاطع العرضية، والتي هي مضيعة للوقت وغير كامل بسبب التحيز لأخذ العينات، وتقتصر في حياتهم القدرة على تحديد الالتهاب وcalcificatايون في الشريان الأورطي كله. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور وتحديد كله الأبهر والمتوسطة تكلس الشرايين وتراكم بلعم باستخدام الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) التصوير الجزيئي خارج الحي. كما قدم هو طريقة للحصاد وزراعة VSMCs الأبهر الأولية من الفئران وتحريض تكلس الفئران وVSMCs البشرية في المختبر من أجل تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية تكلس. توفر هذه التقنيات المحقق مع كل من في الحي وفي أساليب المختبر لدراسة مرض atherocalcific.

Protocol

وقد أجريت جميع الدراسات على الفئران بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على السكن وجميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران وصفها في هذه الدراسة من قبل مؤسسات الرعاية الحيوانية واللجان استخدم من مستشفى ماساتشوستس العام (اللجنة الفرعية للبحوث رعاية الحيوان). تم تنفيذ كافة الإجراءات مع الحرص على تقليل المعاناة.

1. إعداد الكواشف

1. بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الإسفار التصوير من الجامعة Aortas
   ملاحظة: A-المستمدة البايفوسفونيت، بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت التصوير التحقيق يمكن أن تستخدم للاحتفال النشاط عظمي المنشأ في الأوعية الدموية عن طريق ملزمة لهيدروكسيباتيت ^46،47 الفلورسنت التحقيق التصوير تنشيط كاثبسين يمكن أن تكون بمثابة علامة للحصول على بروتين بلعم والنشاط حال النسيج المرن في الأوعية الدموية. ⁹ للسماح الاستخدام المتزامن لكلا تحقيقات الفلورسنت، فمن المهملاستخدام المجسات التي تختلف طيفيا. الكالسيوم تدوين قوائم الجرد الوطنية وسوف تستخدم للإشارة إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة التحقيق الفلورسنت التصوير وكاثبسين الجرد الوطني تكلس محددة للدلالة على كاثبسين النشاط المحدد الأشعة تحت الحمراء القريبة التحقيق الفلورسنت التصوير.
   1. إعداد الحلول من الكالسيوم الجرد الوطني وكاثبسين الجرد الوطني. وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة، إضافة 1.2 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى القارورة التي تحتوي على 24 نانومول من الكالسيوم الجرد الوطني أو كاتيبسين الجرد الوطني ويهز بلطف.
      ملاحظة: وفقا لالصانع، أعيد مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، تبقى الحلول الجرد الوطني الكالسيوم وقوائم الجرد الوطنية كاثبسين مستقرة لمدة 14 يوما عند تخزينها في الظلام في 2-8 درجة مئوية.
2. العزلة وتكلس الفئران الأورطي VSMCs
   1. الأورطي الهضم الحل:
      1. يعد حل الطازجة (~ 3-5 مل لكل الشريان الأورطي المقطوع) مع محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) التي تحتوي على 175 وحدة / مل نوع 2 كولاجيناز و 1.25 U / الإيلاستاز مل. تعقيم الحل ثإيث نظام الترشيح 0.22 ميكرون يحركها الفراغ والحفاظ على حل على الجليد حتى الاستخدام.
   2. وسائل الإعلام الخلية:
      1. تكملة 500 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل الجنين البقري، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
   3. تكلس وسائل الإعلام:
      1. تكلس وسائل الإعلام و(NaPhos، وتستخدم في خطوط الخلايا الماوس):
         1. تكملة 100-500 مل من DMEM (حجم حسب الحاجة) مع 10٪ مصل الجنين البقري، 2 ملي فوسفات الصوديوم، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
            
            أو
            
      2. تكلس وسائل الإعلام ب (βGP / تصاعدي / DEX، تستخدم إما الماوس أو خطوط الخلايا البشرية):
         1. تكملة 100-500 مل من DMEM (حجم حسب الحاجة) مع 10٪ مصل بقري جنيني، ثنائي الصوديوم 10 ملي β-الغليسروفسفات، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك L-10نانومتر ديكساميثازون، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.

2. الذيل الوريد حقن

1. قبل الحقن الذيل، تدفئة الفئران تحت مصباح التدفئة خفيفة لمدة 5 دقائق.
2. كبح الماوس في حامل أنبوب القوارض. تطهير الذيل مع مسحة الكحول.
3. استخدام إبرة 30 G للحقن الوريد الذيل. وتقع الأوردة الذيل أفقيا.
   1. ضع كمية لطيف الضغط إلى الأمام على حقنة كما تقدمت الإبرة في الذيل. يتم الوصول إلى الوريد مرة واحدة المقاومة لحقن لم تعد موجودة.
   2. حقن حجم 100 ميكرولتر من الكالسيوم الجرد الوطني و / أو 100 ميكرولتر من كاثبسين الجرد الوطني بمعدل ثابت. في نهاية الحقن، بعد توقف 5 ثانية، سحب الإبرة.
4. حصاد aortas (انظر القسم 3) 3-24 ساعة بعد الحقن.

3. ماوس تشريح

1. الموت ببطء الفأر مع 200 ملغم / كغم من حقن بنتوباربيتال داخل الصفاق.
2. وضع مستلق الحيوانات على متن تشريح والاستقرار عن طريق تسجيل كل مخلب إلى المجلس. باستخدام مجهر تشريح ومقص صغير، وجعل شق خط الوسط تمتد من أسفل البطن إلى القفص الصدري العلوي.
3. قشر العودة الجلد بالملقط وإزالة الغشاء البريتوني، وكشف عن أعضاء البطن. إزالة الأجهزة الجهاز الهضمي، مع الحرص على عدم القطع الشريان الأورطي.
4. جعل شق الجانبي في الحجاب الحاجز الأمامي ومواصلة شق في البطن. باستخدام مقص تشريح، والإفراج عن القفص الصدري من خلال قطع الجانبين من أضلاعه وإزالة تمسكا الأنسجة اللينة إلى الجزء العلوي من عظمة القص. إزالة القفص الصدري، وكشف عن الرئتين.
5. ترك القلب في المكان في البداية (للمساعدة في تحديد وتشريح الشريان الأبهر الداني) وإزالة بعناية الرئتين. إزالة الغدة الصعترية، القصبة الهوائية، والمريء مع الرعاية، ensuriنانوغرام أن الشريان الأورطي لا تزال سليمة.
6. باستخدام ملقط مباشرة الجميلة ومقص تشريح الصغيرة، وإزالة الأنسجة الناعمة المحيطة الشريان الأورطي من التشعب الحرقفي إلى قوس الأبهر، مع إيلاء اهتمام دقيق عند إزالة شبه الأبهر الدهون (الشكل 1A). إزالة الأنسجة الدهنية وغير المادية المتبقية المحيطة فروع واسعة من قوس الأبهر (أي عضدي رأسي، السباتي المشترك وتحت الترقوة الشرايين، الشكل 1B).
   ملاحظة: من المهم لإزالة الدهون من الشريان الأورطي وذلك لأن الدهون يمكن أن تزيد من إشارة الخلفية أثناء أداء التصوير مضان.
7. إزالة القلب من تجويف الصدر، فصل بعناية من الشريان الأبهر الداني، وتجاهل. القطع الأبهر القاصي في التشعب الحرقفي. باستخدام إبرة الأنسولين، حقن محلول ملحي في الشريان الأورطي من قوس الأبهر لغسل خلايا الدم المتبقية. فصل الشريان الأورطي جنبا إلى جنب مع السفن قوس الأبهر، إزالته تمامامن الجسم.
8. وضع الشريان الأورطي في محلول ملحي طبيعي على الجليد حتى جاهزة للتصوير.

4. الأورطي التصوير

1. aortas صورة فيفو السابقين مباشرة بعد الحصاد من خلال الأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير مضان الانعكاس. ²⁵
   1. تعيين تصوير مضان في موجات متعددة القنوات المناسبة لقياس شدة إشارة مضان من aortas من الكالسيوم الجرد الوطني وكاثبسين الجرد الوطني حقن الفئران، كما هو موضح سابقا. ²⁵ وفقا لالصانع، نير الكالسيوم يمكن أن ولع ~ 650-678 نانومتر ضوء مع انبعاث القصوى في ~ 680-700 نانومتر النطاق. كاثبسين الجرد الوطني يمكن أن ولع ~ 745-750 نانومتر الخفيفة مع الانبعاثات القصوى في ~ 770 نانومتر.

5. عزل الابتدائية الفئران الأورطي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

1. تنفيذ الخطوات 3،1-3،7 كما هو موضح أعلاه.
2. وضع aortas في HBSS الباردة حتى تشريح كاملة. قطع بعناية بعيدا أي العينيةaining الدهون محيط بالأبهر والأنسجة اللينة، ولم يتبق سوى الشريان الأورطي.
3. تحت غطاء نسيج الثقافة العقيمة، ونقل aortas إلى الهضم الحل الأورطي في 35 ملم أطباق زراعة الأنسجة × 10 مم. مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز متقطع لطيف. بعد الهضم، وaortas تبدي مظهر تمدد أو المتوترة.
4. مع المجهر تشريح وملقط معقم، وإزالة طبقة الغلالة البرانية الخارجية من الشريان الأبهر مع الحفاظ على طبقة وسطي سليمة. أسلوب واحد لإزالة البرانية هي قشر بعيدا عن الطبقة الخارجية من الشريان الأورطي في نهاية واحدة وإزالته من طبقة وسطي الأساسية مثل جورب يمكن مقشر الظهر وإزالتها.
5. وبمجرد إزالة طبقة الغلالة البرانية، ضع الشريان الأورطي المتبقية في طبق نسيج الثقافة الجديد مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وتخزينها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة 2-4 ساعة.
6. تحت غطاء العقيمة واستخدام معقم 3 مم مقص تشريح الصغيرة، وقطع الشريان الأورطي إلى 1-2 ملم واسعةخواتم.
7. ضع هذه الحلقات في طبق نسيج الثقافة الجديد مع الأورطي الهضم الحل واحتضان عند 37 درجة مئوية مع متقطعة لطيف هزاز لمدة 120 دقيقة. ماصة الحل صعودا وهبوطا عدة مرات خلال هذه الحضانة ل resuspend الخلايا.
8. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية الحار الحل الهضم ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
9. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
10. نضح في وسائل الإعلام والخلايا resuspend في حجم المطلوب من وسائل الإعلام ثقافة الخلية (على سبيل المثال، 5 مل).
11. لوحة كامل المبلغ من الخلايا المعزولة عن بعضها الشريان الأورطي في 25 سم ² خلية قارورة الثقافة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2. نشر الخلايا باستخدام تقنيات القياسية، كما هو موضح سابقا. ^25،48 خلال 7-10 أيام الأولى من الحضانة، وتغيير وسائل الاعلام كل 72-96 ساعة. مع اقتراب الخلايا التقاء، وتجديد وسائل الإعلام أكثر في كثير من الأحيان (كل 48 ساعة).
    ملاحظة: قد يستغرق عدة أسابيع لتنمو منه كافيةntity من الخلايا.
12. مرة واحدة متموجة، وخلايا مرور مع التربسين التي تحسنت إلى 37 ^{درجة مئوية.}
    1. إضافة 0،5-1،0 مل من التربسين إلى كل قارورة الثقافة واحتضان لمدة 3-5 دقائق. اضغط برفق على جانب قارورة كل 30-60 ثانية حسب الحاجة لفصل الخلايا من السطح.
    2. مرة واحدة فصل الخلايا من الجزء السفلي من القارورة، إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الخلايا إلى الخلايا في التربسين. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وسائل الإعلام والتربسين من بيليه الخلية. resuspend الخلايا في المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام خلية جديدة (على سبيل المثال، 5-10 مل)، ونقل إلى قارورة جديدة (مع بعض الخلايا نقلها إلى شريحة غرفة).
13. في مرور الأول من الخلايا، تأكيد سلسة نسب الخلايا العضلية مع تقنيات مناعية القياسية، كما هو موضح سابقا، ⁴⁹ استخدام أجسام مضادة موجهة ضد α السلس الأكتين العضلات.

6. حمل تكلس العضلات الملساء مثقفخلايا

1. لوحة الخلايا التي تم الحصول عليها من 5.12 في شكل 6 جيدا. ملاحظة: بدءا من 1 × 10 ⁵ خلية / جيدا في إجمالي حجم 2.0 مل من وسائل الاعلام خلية في ويوصى أيضا.
2. تسمح للخلايا أن تنمو في تكلس وسائل الإعلام A أو B لمدة 7 أيام على الأقل في شكل لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
3. تغيير وسائل الإعلام خلية كل 48 ساعة.

7. تقييم VSMC تكلس باستخدام فون كوسا يلطخ الطريقة

ملاحظة: وتستند هذه الطريقة فون كوسا لقياس تكلس المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة أو الخلايا المستزرعة على إحلال أيونات الكالسيوم ملزمة الفوسفات مع أيونات الفضة ⁵⁰ في وجود مركبات الخفيفة والعضوية، ويتم تخفيض أيونات الفضة وتصور كما المعدنية فضي. تتم إزالة أي الفضة غير المتفاعل عن طريق العلاج مع ثيوكبريتات الصوديوم ⁽⁵⁰⁾ وبروتوكول لفون كوسا تلطيخ على النحو التالي:

1. وسائل الإعلام نضح من مكعب خليةلوحات lture.
2. إصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مل من 10٪ من الفورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
3. إزالة الفورمالين وغسل الخلايا الثابتة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
4. احتضان الخلايا في 1 مل من 5٪ من محلول نترات الفضة تحت لمبة 60-100 W لمدة 1-2 ساعة.
5. نضح في محلول نترات الفضة ويغسل بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
6. إزالة الفضة غير المتفاعل من خلال وضع الخلايا في 1 مل من 5٪ وحمض الصوديوم (ث / ت) حل في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
7. شطف الخلايا مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر يغسل 3X. وصمة عار فون كوسا مستعدة للتصوير مع معيار المجهر الضوئي المقلوب.
8. خطوة اختيارية: مباين مع 1ml من أحمر سريع النووي لمدة 5 دقائق. اتبع هذا مع ثلاثة يغسل بالماء المقطر (5 دقائق لكل منهما).

أو

8. تقييم VSMC تكلس مع التصوير الفلورسنت القريبة من الأشعة تحت الحمراء

ملاحظة: على غرار قدرتهلتحديد تكلس داخل aortas الماوس، الكالسيوم الجرد الوطني يربط بسهولة المعدنية المكلس أودعتها الخلايا المستزرعة. باستخدام هذه التقنية، المجهر الفلورسنت والقراء لوحة مع مرشحات الطول الموجي الطويل يمكن أن الصور وتحديد في المختبر تكلس، على التوالي. انبعاث الطول الموجي الطويل من الكالسيوم الجرد الوطني يسمح للاستخدام في وقت واحد من أدنى الطول الموجي fluorophores الباعثة للكشف عن غيرها من الميزات. بروتوكول للكالسيوم الجرد الوطني تلطيخ على النحو التالي:

1. كما هو موضح في القسم 1.1.1، إضافة 1.2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى القارورة التي تحتوي على 24 نانومول من الكالسيوم الجرد الوطني.
2. تمييع الكالسيوم الأسهم قوائم الجرد الوطنية 1: 100 في تكلس أو مراقبة وسائل الإعلام المناسبة.
3. وسائل الإعلام خلية نضح من لوحات ثقافة واستبدالها مع الكالسيوم قوائم الجرد الوطنية التي تحتوي على وسائل الإعلام والثقافة.
4. احتضان لوحات الثقافة مع وسائل الإعلام الجرد الوطني الكالسيوم ليلا 37 درجة مئوية.
5. نضح في وسائل الإعلام من الآبار، ويغسل الآبار مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: عند هذه النقطة،يمكن إضافة وسائل الإعلام ثقافة الأصلي إلى الآبار، والخلايا يمكن تصوير العيش. خلاف ذلك، انتقل إلى الخطوات التالية.
6. إصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مل من 10٪ من الفورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
7. إزالة الفورمالين وغسل الخلايا الثابتة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر يغسل 3X.
8. خطوة اختيارية: قم بإجراء تلطيخ المناعي أو counterstains البعض للبروتينات ذات الاهتمام ^8،9
9. صورة أو كشف وصمة عار الجرد الوطني الكالسيوم باستخدام موجات مضان المناسب الإثارة (مثل قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم يمكن ولع 650-678 ضوء نانومتر) والمرشحات الانبعاثات (~ 680-700 نانومتر).

النتائج

وقد تم قياس والبرية من نوع الفئران باستخدام التصوير مضان الجرد الوطني الكالسيوم ^- تكلس الشريان الأورطي في مجان ^{- /.} تم الكشف عن أي إشارة الجرد الوطني الكالسيوم في aortas من البرية من نوع الفئران، مما يدل على عدم وجود تكلس (الشكل 2). تم ...

Discussion

تكلس الشرايين هو عامل خطر مهم للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية في البشر ويمكن أن تسهم بصورة مباشرة في التسبب في أحداث القلب والأوعية الدموية. وقد اقترح ^1،5،52 باطنة ترسب الكالسيوم في مباراة دولية ليفية رقيقة من مرض تصلب الشرايين لزيادة التوتر النشاط الحيوي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tube	Falcon	352096
30 G needle	BD	305106
Alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	SAB2500963
Chamber slide	Nunc Lab-Tek	154461
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004176
Dexamethasone	Sigma	D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium	Gibco	14190-144
Elastase	Sigma	E1250
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Forceps, fine point	Roboz	RS-4972
Forceps, full curve serrated	Roboz	RS-5138
Formalin (10%)	Electron Microscopy Sciences	15740
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells	PromoCell	C-12511
Insulin syringe with needle	Terumo	SS30M2913
L-ascorbic acid	Sigma	A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13 mm)	Roboz	RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3 mm)	Roboz	RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX)	Perkin Elmer	NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX)	Perkin Elmer	NEV10020EX
Normal Saline	Hospira	0409-4888-10
Nuclear fast red	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey Imaging System	Li-Cor	Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-001-CI
Silver nitrate (5%)	Ricca Chemical Company	6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S-9390
Sodium thiosulfate	Sigma	S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma	G9422
Tissue culture flask, 25 cm2	Falcon	353108
Tissue culture plate (35 mm x 10 mm)	Falcon	353001
Tissue culture plate, six-well	Falcon	353046
Trypsin	Corning	25-053-CI
Tube rodent holder	Kent Scientific	RSTR551
Vacuum-driven filtration system	Millipore	SCGP00525