Calcificazione vascolare cellule muscolari lisce e imaging di aortica calcificazioni e infiammazione

Riepilogo

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Abstract

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo, compresi gli Stati Uniti dove rappresenta oltre 780.000 morti ogni anno. ¹ coronarica calcificazione delle arterie e calcificazione aortica sono le caratteristiche della malattia aterosclerotica e fungono da forti predittori di eventi cardiovascolari. ^{2- 4} Due tipi principali di calcificazione vascolare sono stati riportati in adulti: calcificazione intimale, associata con l'aterosclerosi, e mediale (noto anche come Mönckeberg) calcificazione, associata a malattia renale cronica e diabete ⁵ intimale la calcificazione si verifica nel contesto di accumulo di lipidi e macrofagi. infiltrazione nella parete del vaso. ^5,6 mediale calcificazione parete si verifica indipendentemente intimale calcificazioni, localizza alle fibre di elastina o cellule muscolari lisce, e non è associato con la deposizione di lipidi o infiltrazione dei macrofagi. ^5,7,8 studi sui meccanismi molecolari dicalcificazione vascolare hanno fatto affidamento su sistemi modello basati su celle e animali. Modelli di roditori per la malattia atherocalcific includono topi deficienti in entrambi apolipoproteina E (ApoE) ^9,10 o recettore delle lipoproteine ​​a bassa densità (LDLR) ¹¹ alimentati con una dieta ricca di grassi, mentre i modelli per la calcificazione mediale includono topi con deficit di matrice proteica Gla (MGP) ¹² o ratti che si sviluppano uremia o da nefrectomia quasi totale (il modello nefrectomia 5/6 °) o dall'esposizione ad una dieta ricca di adenina. ¹³

Qui, il modello di calcificazione vascolare mediale associata a carenza di MGP è focalizzata su. MGP è una proteina extracellulare che inibisce la calcificazione delle arterie. ¹² mutazioni nel gene MGP sono state identificate nella sindrome Keutel, una malattia umana rara, caratterizzata da diffuse calcificazioni cartilagine oltre a brachitelefalangia, perdita di udito, e la stenosi polmonare periferica. ^14-18 Anche se non spesso osservato, ¹⁹calcificazioni concentrica di più arterie è stata descritta nella sindrome Keutel. ²⁰ polimorfismi comuni nel gene MGP umana sono associate ad un aumentato rischio di calcificazione delle arterie coronariche, ^21-23 mentre alti livelli circolanti di uncarboxylated, MGP biologicamente inattivo predicono la mortalità cardiovascolare. ²⁴ A differenza di esseri umani con la sindrome Keutel, topi MGP-deficienti sviluppano un fenotipo vascolare grave composto da spontanea diffusa la calcificazione delle arterie a partire da due settimane di età e morire 6-8 settimane dopo la nascita a causa di rottura aortica. ¹²

A differenza di ApoE ^{- / -} e LDLR ^{- / -} mice nutriti con una dieta ricca di grassi, che si sviluppano calcificazione vascolare intimale con l'infiammazione dei macrofagi indotta associata, MGP ^{- / -.} Topi sviluppano calcificazione vascolare mediale in assenza di infiltrazione di macrofagi ^11,25 Sebbene questi risultati suggeriscono stimoli diversi sottostanti incontri intimiAl e calcificazione mediale, non vi è sovrapposizione nei meccanismi di segnalazione che mediano entrambe le forme di calcificazione. ²⁶ Molteplici vie di segnalazione sono stati identificati che contribuiscono alla calcificazione vascolare compreso mediatori infiammatori come fattore di necrosi tumorale-α e IL-1 e fattori pro-osteogeniche come Notch, Wnt, e la proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione. ^27,28 Questi percorsi di segnalazione aumentare l'espressione dei fattori di trascrizione runt legati fattore di trascrizione 2 (Runx2) e Osterix, che a loro volta aumentano l'espressione di proteine ​​ossee correlate ( . ad esempio, osteocalcina, sclerostina, e fosfatasi alcalina) nel sistema vascolare che mediano la calcificazione ^28-30 Noi e altri hanno dimostrato che la calcificazione vascolare osservata in ApoE ^{- / -} e LDLR ^{- / -} topi nutriti con una dieta ricca di grassi e la spontanea calcificazione vascolare osservato in MGP ^{- / -} mice tutti dipendono dalla proteina morfogenetica dell'osso (BMP) SIgnaling, ed è questo percorso che si concentra qui. ^11,25,31 BMP sono potenti fattori osteogeniche necessari per la formazione delle ossa e sono noti per esporre una maggiore espressione nell'aterosclerosi umana. ^32-34 Studi in vitro hanno implicato segnalazione BMP nella regolazione l'espressione di fattori osteogenici come Runx2. ^35-37 sovraespressione del ligando BMP, BMP-2, accelera lo sviluppo di calcificazione vascolare in topi ApoE-carente alimentati con una dieta ad alta percentuale di grassi. ³⁸ Inoltre, l'uso di specifici BMP segnalazione inibitori tali come LDN-193.189 (LDN) ^39,40 e / o ALK3-Fc impedisce lo sviluppo di calcificazione vascolare in entrambi LDLR ^{- / -} mice nutriti con una dieta ricca di grassi e topi MGP-deficienti ^11,25.

Cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) hanno un ruolo fondamentale nello sviluppo della calcificazione vascolare. ^30,41,42 La calcificazione vascolare mediale che si sviluppa in MGP-carente topo è caratterizzati da una transdifferenziazione di VSMC a un fenotipo osteogenico. Perdita di MGP risultati in diminuita espressione di marcatori VSMC tra cui myocardin e alfa actina muscolo liscio, con un concomitante aumento marcatori osteogeniche quali Runx2 e osteopontina. Questi cambiamenti coincidono con lo sviluppo di calcificazione vascolare. ^25,43,44

Calcificazione aortica e l'infiammazione nei topi sono in genere valutate utilizzando tecniche istochimiche come l'attività della fosfatasi alcalina per la calcificazione precoce e l'attività osteogenica, von Kossa e alizarina colorazione rossa per la fine di calcificazione, e protocolli di immunoistochimica che colpiscono marcatori proteici macrofagi (ad es., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). ^9,45 Tuttavia, queste tecniche di imaging standard richiede la lavorazione di tessuti aortici in sezioni trasversali, che è lunga e imperfetta tempo a causa di errori di campionamento, e sono limitati nella loro capacità di quantificare l'infiammazione e calcificatione in tutta dell'aorta. Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare e quantificare tutta la calcificazione delle arterie aortica e medie imprese e l'accumulo di macrofagi utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIR) imaging molecolare ex vivo. È inoltre disponibile un metodo per la raccolta e la coltura VSMC aortici primari da topi e indurre il calcificazione dei murina e VSMC umani in vitro al fine di determinare i meccanismi molecolari alla base calcificazione vascolare. Queste tecniche prevedono l'investigatore sia in vivo e metodi in vitro per lo studio della malattia atherocalcific.

Protocollo

Tutti gli studi con i topi sono stati eseguiti in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Corpo e tutte le procedure che coinvolgono i topi descritti in questo studio sono stati approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Uso comitati del Massachusetts General Hospital (sottocomitato per Animal Care Research). Tutte le procedure sono state eseguite con cura per ridurre al minimo le sofferenze.

1. Preparazione dei reagenti

1. Near-Infrared imaging di fluorescenza di Whole aorte
   Nota:. Un bisfosfonato-derivato, nel vicino infrarosso sonda di imaging fluorescente può essere usato per marcare l'attività osteogenica nel sistema vascolare legandosi a idrossiapatite ^46,47 Una sonda di imaging a fluorescenza catepsina-attivo può servire come marker per proteolitica macrofagi e l'attività elastolytic in la vascolarizzazione. ⁹ Per consentire l'uso simultaneo di entrambe le sonde fluorescenti, è importanteper usare le sonde che sono spettralmente distinti. Il calcio notazione NIR sarà usato per indicare la sonda di imaging fluorescenti e catepsina vicino infrarosso NIR specifico calcificazione per indicare la sonda catepsina specifico all'attività vicino infrarosso di imaging fluorescente.
   1. Preparare le soluzioni di calcio NIR e catepsina NIR. Come per i protocolli del produttore, aggiungere 1,2 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) al flaconcino contenente 24 nmol di calcio NIR o catepsina NIR e agitare delicatamente.
      Nota: Secondo il produttore, una volta ricostituito con PBS, le soluzioni NIR calcio e catepsina NIR rimangono stabili per 14 giorni se conservato al buio a 2-8 ° C.
2. L'isolamento e la calcificazione di Murine aortica VSMCs
   1. Aortica Digestione Soluzione:
      1. Preparare una soluzione fresca (~ 3-5 ml per dell'aorta raccolte) con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente 175 U / ml di tipo 2 collagenasi e 1,25 U / ml elastasi. Sterilizzare la soluzione with un sistema di filtrazione 0,22 micron sottovuoto guidato e mantenere la soluzione in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   2. Cellulare di media:
      1. Supplement 500 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% siero fetale bovino, 100 unità / ml di penicillina, e 100 ug / ml di streptomicina. Riscaldare i media a 37 ° C prima dell'uso.
   3. Calcificazione media:
      1. La calcificazione media A (NaPhos, utilizzato in linee cellulari di topo):
         1. Supplemento 100-500 ml di DMEM (volume come necessario) con 10% siero fetale bovino, 2 mM sodio fosfato, 100 unità / ml di penicillina, e 100 ug / ml di streptomicina. Riscaldare i media a 37 ° C prima dell'uso.
            
            O
            
      2. La calcificazione media B (βGP / Asc / DEX; utilizzato in entrambi i mouse o linee cellulari umane):
         1. Supplemento 100-500 ml di DMEM (volume come necessario) con il 10% di siero fetale bovino, sodio 10 mM β-glicerofosfato, / ml di acido L-ascorbico 50 mg, 10nM desametasone, 100 unità / ml di penicillina, e 100 ug / ml di streptomicina. Riscaldare i media a 37 ° C prima dell'uso.

2. Tail Vein Injection

1. Prima dell'iniezione coda, riscaldare i topi sotto una lampada blando riscaldamento per 5 min.
2. Trattenere il mouse in un supporto tubo roditore. Disinfettare la coda con un tampone imbevuto di alcool.
3. Utilizzare un ago da 30 G per l'iniezione coda vena. vene coda si trovano lateralmente.
   1. Applicare una leggera pressione in avanti sulla siringa come l'ago viene fatto avanzare nella coda. La vena, si accede dopo la resistenza all'iniezione non è più presente.
   2. Iniettare un volume di 100 ml di calcio NIR e / o 100 ml di catepsina NIR ad un tasso costante. Al termine dell'iniezione, dopo una pausa 5 sec, estrarre l'ago.
4. Raccogliere le aorte (vedi sezione 3) 3-24 ore dopo l'iniezione.

3. mouse Dissection

1. Euthanize mouse con 200 mg / kg iniezione intraperitoneale pentobarbital.
2. Posare il supina animale sulla tavola di dissezione e stabilizzare con nastro adesivo ogni zampa alla scheda. Utilizzando un microscopio da dissezione e piccole forbici, fare una incisione mediana estende dal basso addome al torace superiore.
3. Staccare la pelle con una pinza e rimuovere il peritoneo, rivelando gli organi addominali. Rimuovere gli organi gastrointestinali, facendo attenzione a non transetto l'aorta.
4. Effettuare una incisione laterale nel diaframma anteriore e continuare l'incisione attraverso l'addome. Utilizzando forbici dissezione, rilasciare la gabbia toracica tagliando attraverso i lati delle costole e rimuovendo l'aderente tessuti molli alla porzione superiore dello sterno. Rimuovere la gabbia toracica, rivelando i polmoni.
5. Lasciare il cuore a posto inizialmente (per gli aiuti a identificare e sezionare l'aorta prossimale) e rimuovere con attenzione i polmoni. Rimuovere il timo, la trachea, l'esofago e con cura, ensuring che l'aorta rimane intatto.
6. Utilizzando una pinza dritto sottili e forbici micro-dissezione, rimuovere il tessuto molle che circonda l'aorta dalla biforcazione iliaca per l'arco aortico, facendo attenzione quando si rimuove il grasso (Figura 1A) peri-aortica. Rimuovere il tessuto grasso e morbido rimanente che circonda i grandi rami dell'arco aortico (cioè le arterie, brachiocefalici, carotidi comuni e succlavia, Figura 1B).
   Nota: È importante rimuovere il grasso dall'aorta perché il grasso può aumentare il segnale di fondo durante l'esecuzione di imaging di fluorescenza.
7. Rimuovere il cuore dalla cavità toracica, con attenzione staccandola dall'aorta prossimale, e scartare. Transetto l'aorta distale alla biforcazione iliaca. Utilizzando un ago da insulina, iniettare soluzione fisiologica nell'aorta dall'arco aortico per lavare globuli rimanenti. Staccare l'aorta con i vasi dell'arco aortico, rimuovendo completamentedal corpo.
8. Inserire l'aorta in soluzione fisiologica in ghiaccio fino per l'imaging.

4. aortica Imaging

1. Aorte Immagine ex vivo subito dopo la raccolta da imaging di fluorescenza di riflettanza nel vicino infrarosso. ²⁵
   1. Impostare l'imager fluorescenza a lunghezze d'onda multicanale appropriate per quantificare l'intensità del segnale di fluorescenza dalle aorte di calcio NIR e topi catepsina NIR-iniettato, come descritto in precedenza. ²⁵ Secondo il produttore, NIR calcio può essere eccitato da ~ 650-678 nm luce con una emissione massima nella ~ 680-700 nm gamma. Cathepsin NIR può essere eccitato da ~ 745-750 nm luce con una emissione di massimo a ~ 770 nm.

5. L'isolamento di primaria murini aortica vascolari cellule muscolari lisce

1. Eseguire i passaggi 3,1-3,7 come descritto sopra.
2. Mettere aorte in HBSS freddo fino a quando le dissezioni sono completi. Attentamente tagliare qualsiasi remaining grasso periaortica e dei tessuti molli, lasciando solo l'aorta.
3. Sotto una cappa di coltura di tessuti sterili, trasferire i aortas alla digestione Solution aortica in x 10 mm piatti di coltura di tessuti da 35 mm. Inserire in termostato a 37 ° C per 30 minuti con dolce dondolio intermittente. Dopo la digestione, le aorte presentano un aspetto allungato o sfilacciato.
4. Con il microscopio dissezione e pinza sterile, rimuovere lo strato esterno avventiziale dell'aorta, mantenendo intatto lo strato mediale. Una tecnica per rimuovere il avventizia è a staccarsi lo strato esterno dell'aorta ad una estremità e rimuoverlo dallo strato sottostante mediale come un calzino potrebbe essere sfogliato indietro e rimosso.
5. Una volta che lo strato avventiziale è stato rimosso, posizionare l'aorta rimanenti in un nuovo piatto di coltura di tessuti con mezzi di coltura cellulare e conservare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 2-4 ore.
6. Sotto una cappa sterile e l'utilizzo di 3 mm forbici micro-dissezione sterili, tagliare l'aorta in 1-2 mm di larghezzaanelli.
7. Mettere questi anelli in un nuovo piatto di coltura tissutale con aortica digestione Solution e incubare a 37 ° C con dolce intermittente a dondolo per 120 min. Pipetta la soluzione su e giù più volte durante questa incubazione per risospendere le cellule.
8. Aggiungere 5 ml di media caldo coltura cellulare per la soluzione di digestione e trasferimento in un tubo da 15 ml.
9. Centrifugare la provetta per 5 min a 200 x g.
10. Aspirare media e risospendere le cellule nel volume desiderato di terreni di coltura cellulare (per esempio, 5 ml).
11. Piatto l'intera quantità di cellule isolate da ciascuna aorta in cm 25 pallone di coltura cellulare ² e incubare a 37 ° C con 5% di CO _2. Propagare cellule utilizzando tecniche standard, come descritto in precedenza. ^25,48 Durante i primi 7-10 giorni di incubazione, cambiare i media ogni 72-96 ore. Come le cellule si avvicinano confluenza, ricostituire i media più frequentemente (ogni 48 ore).
    Nota: Si può richiedere molte settimane per crescere un qua sufficiententity di cellule.
12. Una volta confluenti, le cellule di passaggio con tripsina che viene riscaldato a 37 ^{° C.}
    1. Aggiungere 0,5-1,0 ml di tripsina ad ogni pallone di coltura e incubare per 3-5 minuti; toccare delicatamente il lato del pallone ogni 30-60 sec come necessario per staccare le cellule dalla superficie.
    2. Una volta che le cellule si staccano dal fondo del pallone, aggiungere 10 ml di mezzi cellule alle cellule in tripsina. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. Aspirare i media e tripsina dal pellet cellulare. Risospendere le cellule in quantità desiderata di supporto cellulare fresca (ad esempio, 5-10 ml) e trasferire in un pallone (con alcune cellule trasferiti a una diapositiva camera).
13. Al primo passaggio di cellule, confermano lineage cellule muscolari lisce con tecniche immunocitochimica standard come descritto in precedenza, ⁴⁹ usando un anticorpo diretto contro α-actina del muscolo liscio.

6. Induzione calcificazione di Cultured muscolo lisciocellule

1. cellule piastra ottenuti da 5.12 in un formato da 6 pozzetti. Nota: A partire da 1 x 10 ⁵ cellule / pozzetto in un volume totale di 2,0 ml di supporti per cellule si raccomanda bene.
2. Consentono alle cellule di crescere in media calcificazione A o B per almeno 7 giorni in un formato 6-pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO _2.
3. Cambiare supporti cellulari ogni 48 ore.

7. Valutare VSMC calcificazione Utilizzando la von Kossa metodo di colorazione

Nota:. Il metodo di von Kossa per misurare matrice extracellulare calcificazione dei tessuti o cellule coltivate si basa sulla sostituzione di ioni calcio fosfato-bound con ioni d'argento ⁵⁰ In presenza di composti leggeri e organici, gli ioni d'argento sono ridotti e visualizzati come metallico argento. Qualsiasi argento non reagito viene rimosso per trattamento con sodio tiosolfato ⁵⁰ Il protocollo per von Kossa colorazione è come segue.:

1. supporti Aspirare da cu cellularePiastre lture.
2. Fissare cellule mettendoli in 1 ml di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 min.
3. Rimuovere formalina e lavare le cellule fissate con acqua distillata per 5 min.
4. Incubare le cellule in 1 ml di soluzione di nitrato d'argento 5% sotto una lampadina 60-100 W per 1-2 ore.
5. Aspirare la soluzione di nitrato d'argento e lavare con acqua distillata per 5 min.
6. Rimuovere argento non reagito ponendo le cellule in 1 ml di tiosolfato di sodio 5% (w / v) in acqua distillata per 5 min.
7. Risciacquare le cellule con acqua distillata per 5 min. lavaggi Ripetere 3x. La macchia von Kossa è pronto per l'imaging con lo standard microscopio ottico invertito.
8. Passaggio opzionale: Controcolorare con 1 ml di rosso veloce nucleare per 5 min. Seguire questo con tre lavaggi con acqua distillata (5 minuti ciascuno).

O

8. Valutare VSMC calcificazione con Imaging fluorescente vicino infrarosso

Nota: Simile alla sua capacitàindividuare calcificazioni all'interno aorte del mouse, il calcio NIR si lega facilmente calcifica minerale depositato da cellule in coltura. Utilizzando questa tecnica, microscopia a fluorescenza e lettori di piastre con filtri lunghezza d'onda può immagine e quantificare la calcificazione in vitro, rispettivamente. La lunga lunghezza d'onda di emissione calcio NIR consente l'utilizzo simultaneo di più bassa lunghezza d'onda fluorofori che emettono per rilevare altre caratteristiche. Il protocollo per il calcio NIR colorazione è la seguente:

1. Come descritto nella Sezione 1.1.1, aggiungere 1,2 ml di PBS 1x per il flacone contenente 24 nmol di calcio NIR.
2. Diluire il calcio NIR magazzino 1: 100 nei media di calcificazione o di controllo adeguate.
3. supporti cellule Aspirare da piastre di coltura e sostituire con il calcio NIR contenenti terreni di coltura.
4. Incubare le piastre di coltura con i media NIR di calcio durante la notte a 37 ° C.
5. Aspirare il supporto dai pozzetti e lavare i pozzetti una volta con PBS.
   Nota: A questo punto,mezzo di coltura originale può essere aggiunta ai pozzetti e le cellule può essere realizzata live. In caso contrario, procedere con la seguente procedura.
6. Fissare cellule mettendoli in 1 ml di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 min.
7. Rimuovere formalina e lavare le cellule fissate con acqua distillata per 5 min. lavaggi Ripetere 3x.
8. Passaggio facoltativo:. Eseguire la colorazione di immunofluorescenza o altro controcolorazioni per le proteine ​​di interesse ^8,9
9. Immagine o rilevare la macchia NIR di calcio usando lunghezze d'onda di eccitazione di fluorescenza appropriata (ad esempio, NIR calcio può essere eccitata da 650-678 nm luce) e filtri di emissione (~ 680-700 nm).

Risultati

Calcificazione aortica in MGP ^{- / -} e wild-type topi è stata misurata utilizzando l'imaging di NIR calcio fluorescenza. Nessun segnale NIR calcio è stato rilevato nelle aorte di topi wild-type, che indica l'assenza di calcificazione (figura 2). Un segnale NIR calcio forte è stata rilevata nelle aorte da MGP-carente topo, che è coerente con la calcificazione vascolare avanzata. Le sezioni di tessuto di aorte da wild-type e MGP ^{- / -} mice ...

Discussione

Calcificazione arteriosa è un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari negli esseri umani e può contribuire direttamente alla patogenesi di eventi cardiovascolari. ^1,5,52 deposizione di calcio intimale nei sottili tappi fibrose di malattia aterosclerotica è stato proposto di aumentare lo stress biomeccanico locale e contribuire alla rottura della placca. ^53,54 calcificazione impatti mediale risultati clinici, aumentando la rigidità arteriosa, che può indurre l'ipertrof...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tube	Falcon	352096
30 G needle	BD	305106
Alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	SAB2500963
Chamber slide	Nunc Lab-Tek	154461
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004176
Dexamethasone	Sigma	D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium	Gibco	14190-144
Elastase	Sigma	E1250
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Forceps, fine point	Roboz	RS-4972
Forceps, full curve serrated	Roboz	RS-5138
Formalin (10%)	Electron Microscopy Sciences	15740
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells	PromoCell	C-12511
Insulin syringe with needle	Terumo	SS30M2913
L-ascorbic acid	Sigma	A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13 mm)	Roboz	RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3 mm)	Roboz	RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX)	Perkin Elmer	NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX)	Perkin Elmer	NEV10020EX
Normal Saline	Hospira	0409-4888-10
Nuclear fast red	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey Imaging System	Li-Cor	Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-001-CI
Silver nitrate (5%)	Ricca Chemical Company	6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S-9390
Sodium thiosulfate	Sigma	S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma	G9422
Tissue culture flask, 25 cm2	Falcon	353108
Tissue culture plate (35 mm x 10 mm)	Falcon	353001
Tissue culture plate, six-well	Falcon	353046
Trypsin	Corning	25-053-CI
Tube rodent holder	Kent Scientific	RSTR551
Vacuum-driven filtration system	Millipore	SCGP00525