Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación

Resumen

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Resumen

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introducción

La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo, incluyendo los Estados Unidos, donde es responsable de más de 780.000 muertes al año. ¹ calcificación de las arterias coronarias y la calcificación aórtica son características de la enfermedad aterosclerótica y sirven como fuertes predictores de eventos cardiovasculares. ^{2- 4} Dos tipos principales de la calcificación vascular han sido reportados en adultos: la calcificación de la íntima, asociada con la aterosclerosis, y medial (también conocido como Mönckeberg) calcificación, asociada con la enfermedad renal crónica y diabetes ⁵ calcificación intimal se produce en el contexto de la acumulación de lípidos y de los macrófagos. infiltración en la pared del vaso. ^5,6 calcificación de la pared medial se produce independientemente de la calcificación de la íntima, se localiza en las fibras de elastina o de células musculares lisas, y no está asociada con la deposición de lípidos o la infiltración de macrófagos. ^5,7,8 estudios sobre los mecanismos moleculares decalcificación vascular se han basado en sistemas de modelos basados ​​en células y animales. Modelos de roedores para la enfermedad atherocalcific incluyen ratones deficientes en cualquiera de apolipoproteína E (ApoE) ^9,10 o receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) ¹¹ alimentados con una dieta alta en grasas, mientras que los modelos de calcificación de la media incluyen ratones con la proteína Gla de la matriz (MGP), la deficiencia ¹² o ratas que desarrollan uremia, ya sea por la nefrectomía casi total (el 5 / sexto modelo de nefrectomía) o por exposición a una dieta alta en adenina. ¹³

Aquí, el modelo de la calcificación vascular medial asociada con la deficiencia de MGP se centra en. MGP es una proteína extracelular que inhibe la calcificación arterial. ¹² mutaciones en el gen MGP se han identificado en el síndrome de Keutel, una enfermedad humana rara caracterizada por calcificación del cartílago difusa además de brachytelephalangy, pérdida de audición, y estenosis pulmonar periférica. ^14-18 Aunque no se observado a menudo, ¹⁹calcificación concéntrica de múltiples arterias se ha descrito en el síndrome Keutel. ²⁰ polimorfismos comunes en el gen MGP humana están asociados con un mayor riesgo para la calcificación de las arterias coronarias, ^21-23, mientras que altos niveles circulantes de uncarboxylated MGP, biológicamente inactivo predicen la mortalidad cardiovascular. ²⁴ A diferencia de los seres humanos con el síndrome de Keutel, los ratones con deficiencia de MGP desarrollan un fenotipo vascular severa que consiste en una calcificación arterial generalizada espontánea a partir de las dos semanas de edad y morir 6-8 semanas después del nacimiento debido a la ruptura aórtica. ¹²

A diferencia de ApoE ^{- / -} y LDLR ^{- / -} ratones alimentados con una dieta alta en grasas, que se desarrollan calcificación vascular de la íntima con la inflamación inducida por macrófagos asociados, MGP ^{- / -.} Ratones desarrollan calcificación vascular medial en ausencia de la infiltración de macrófagos ^11,25 Aunque estos hallazgos sugieren diferentes estímulos subyacentes para intimal y la calcificación medial, no hay superposición en los mecanismos de señalización que median en ambas formas de calcificación. ²⁶ vías de señalización múltiples han sido identificados que contribuyen a la calcificación vascular incluyendo mediadores inflamatorios tales como factor de necrosis tumoral-α y la IL-1 y los factores pro-osteogénicas tales como Notch, Wnt, y la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización. ^27,28 Estas vías de señalización aumentan la expresión de los factores de transcripción factor de transcripción relacionados con runt-2 (Runx2) y osterix, que a su vez aumentan la expresión de proteínas relacionadas con los huesos ( . por ejemplo, osteocalcina, esclerostina, y fosfatasa alcalina) en la vasculatura que median la calcificación ^28-30 Nosotros y otros han demostrado que la calcificación vascular observada en ApoE ^{- / -} y LDLR ^{- / -} ratones alimentados con una dieta alta en grasas y la espontánea calcificación vascular observada en MGP ^{- / -} ratones, todos dependen de la proteína morfogenética ósea (BMP) SIgnaling, y es esta vía que se centra en aquí. ^11,25,31 BMP son factores osteogénicos potentes necesarios para la formación de hueso y se sabe que presentan una mayor expresión en la aterosclerosis humana. ^32-34 Los estudios in vitro han implicado en la regulación de la señalización de BMP la expresión de factores osteogénicos tales como Runx2. ^35-37 la sobreexpresión del ligando BMP, BMP-2, acelera el desarrollo de la calcificación vascular en ratones ApoE deficientes alimentados con una dieta alta en grasas. ³⁸ por otra parte, el uso de inhibidores específicos BMP tales señalización como LDN-193189 (LDN) ^39,40 y / o ALK3-Fc impide el desarrollo de la calcificación vascular tanto en LDLR ^{- / -} ratones alimentados con una dieta alta en grasas y los ratones con deficiencia de MGP ^11,25.

Células del músculo liso vascular (CMLV) tienen un papel crítico en el desarrollo de la calcificación vascular. ^30,41,42 La calcificación vascular medial que se desarrolla en MGP ratones deficientes es caracracterizado por una transdiferenciación de CMLV a un fenotipo osteogénico. La pérdida de la MGP en disminución en la expresión de marcadores de CMLV incluyendo miocardina y alfa actina de músculo liso, con el consiguiente incremento de los marcadores osteogénicos tales como la osteopontina y Runx2. Estos cambios coinciden con el desarrollo de la calcificación vascular. ^25,43,44

Calcificación de la aorta y la inflamación en los ratones se evalúan típicamente utilizando técnicas histoquímicas tales como la actividad de la fosfatasa alcalina para la calcificación temprana y la actividad osteogénica, von Kossa y alizarina tinción roja para fines de calcificación y protocolos de inmunohistoquímica que se dirigen a los marcadores de proteínas de macrófagos (por ejemplo., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). ^9,45 Sin embargo, estas técnicas de imagen estándar requiere el procesamiento de los tejidos aórticos en secciones transversales, que es lento y imperfecta tiempo debido al sesgo de muestreo, y están limitados en su capacidad de cuantificar la inflamación y calcificatION en toda la aorta. Este protocolo describe un método para visualizar y cuantificar toda la calcificación arterial aórtica y medianas y la acumulación de macrófagos utilizando fluorescente del infrarrojo cercano (NIR) de formación de imágenes molecular ex vivo. También se proporciona un método para la recolección y el cultivo de CMLV aórticas primarias de ratones y la inducción de la calcificación de murino y CMLV humanas in vitro con el fin de determinar los mecanismos moleculares que subyacen a la calcificación vascular. Estas técnicas proporcionan el investigador con tanto in vivo y métodos in vitro para el estudio de la enfermedad atherocalcific.

Protocolo

Se realizaron todos los estudios con ratones en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Vivienda y todos los procedimientos de los ratones descritos en este estudio fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comités del Hospital General de Massachusetts (Subcomité de Investigación Animal Care). Todos los procedimientos se llevaron a cabo con cuidado para minimizar el sufrimiento.

1. Preparación de los reactivos

1. Infrarrojo Cercano imagen de fluorescencia de Whole aortas
   Nota:. Un bisfosfonato derivados, infrarrojo cercano sonda de imagen fluorescente se puede utilizar para marcar la actividad osteogénica en la vasculatura mediante la unión a la hidroxiapatita ^46,47 Una sonda de formación de imágenes fluorescentes catepsina-activado puede servir como un marcador para proteolítica de macrófagos y la actividad elastolítica en . la vasculatura ⁹ Para permitir el uso simultáneo de ambas sondas fluorescentes, es importanteutilizar sondas que son espectralmente distinta. El calcio notación NIR se utiliza para indicar la sonda de imagen fluorescente y catepsina infrarrojo cercano NIR-calcificación específica para indicar la sonda de imagen fluorescente catepsina específico de la actividad en el infrarrojo cercano.
   1. Preparar las soluciones de calcio y catepsina NIR NIR. De acuerdo con los protocolos del fabricante, añadir 1,2 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS) al vial que contiene 24 nmol de calcio NIR o catepsina NIR y agitar suavemente.
      Nota: Según el fabricante, una vez reconstituido con PBS, las soluciones NIR NIR calcio y catepsina permanecen estables durante 14 días cuando se almacena en la oscuridad a 2-8 ° C.
2. El aislamiento y la calcificación de las CMLV aórtica murino
   1. Aórtica solución de digestión:
      1. Preparar una solución fresca (~ 3-5 ml por aorta cosechado) con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contenía 175 U / ml de tipo 2 colagenasa y 1,25 U / ml de elastasa. Esterilizar la solución won un sistema de filtración de vacío impulsada por 0,22 micras y mantener la solución en hielo hasta su uso.
   2. Medios Cell:
      1. Suplemento 500 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de comunicación a 37 ° C antes de su uso.
   3. Calcificación de los medios de comunicación:
      1. La calcificación de Medios A (NaPhos, que se utiliza en las líneas celulares de ratón):
         1. Suplemento 100-500 ml de DMEM (volumen según sea necesario) con 10% de suero fetal bovino, fosfato de sodio 2 mM, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de comunicación a 37 ° C antes de su uso.
            
            O
            
      2. La calcificación de Medios B (βGP / Asc / DEX; utilizado tanto en líneas celulares humanas o de ratón):
         1. Suplemento 100-500 ml de DMEM (volumen según sea necesario) con suero bovino fetal 10%, disódico 10 mM β-glicerofosfato, / ml de ácido L-ascórbico 50 mg, 10dexametasona nM, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de comunicación a 37 ° C antes de su uso.

2. vena de la cola de inyección

1. Antes de la inyección de cola, calentar los ratones bajo una lámpara de calentamiento suave durante 5 min.
2. Restringir el ratón en un soporte de roedores tubo. Desinfectar la cola con un algodón con alcohol.
3. Utilizar una aguja de 30 G para inyección en vena de cola. venas de la cola están situados lateralmente.
   1. Aplicar una cantidad suave de presión hacia adelante en la jeringa cuando la aguja se introduce en la cola. Se accede a la vena una vez que la resistencia a la inyección ya no está presente.
   2. Inyectar un volumen de 100 l de calcio NIR y / o 100 l de catepsina NIR a un ritmo constante. Al final de la inyección, después de una pausa de 5 segundos, retire la aguja.
4. Cosechar las aortas (véase la sección 3) 3-24 horas después de la inyección.

3. La disección de ratón

1. La eutanasia del ratón con una inyección de 200 mg / kg intraperitoneal pentobarbital.
2. Coloque la supina animal en la tabla de disección y estabilizar con cinta adhesiva cada pata a la placa. Utilizando un microscopio de disección y tijeras pequeñas, hacer una incisión en la línea que se extiende desde la parte inferior del abdomen a la parte superior del tórax.
3. Pelar la piel con pinzas y retirar el peritoneo, revelando los órganos abdominales. Retire los órganos gastrointestinales, teniendo cuidado de no seccionar la aorta.
4. Haga una incisión lateral en el diafragma anterior y continuar la incisión a través del abdomen. Usando tijeras de disección, suelte la caja torácica cortando a través de los lados de los nervios y eliminando el tejido blando adherente a la parte superior del esternón. Retire la caja torácica, dejando al descubierto los pulmones.
5. Deja el corazón en el lugar inicialmente (a la ayuda en la identificación y disección de la aorta proximal) y retirar con cuidado los pulmones. Retire el timo, tráquea y esófago con cuidado, ensuring de que la aorta se mantiene intacta.
6. El uso de pinzas y tijeras finas recta micro-disección, eliminar el tejido blando que rodea la aorta desde la bifurcación ilíaca al arco aórtico, prestando especial atención al retirar la grasa peri-aórtica (Figura 1A). Retire la grasa y el tejido blando que rodea a los restantes grandes ramas del cayado aórtico (es decir, las arterias, braquiocefálica, carótida común y subclavia, Figura 1B).
   Nota: Es importante eliminar la grasa de la aorta porque la grasa puede aumentar la señal de fondo cuando se realiza imágenes de fluorescencia.
7. Retire el corazón de la cavidad torácica, separando cuidadosamente de la aorta proximal, y desechar. Seccionar la aorta distal a la bifurcación ilíaca. Usando una aguja de insulina, inyectar solución salina normal en la aorta desde el arco aórtico para lavar células sanguíneas restantes. Separar la aorta junto con los vasos del cayado aórtico, eliminando por completodel cuerpo.
8. Coloque la aorta en solución salina normal en hielo hasta que esté listo para la imagen.

4. Imaging aórtica

1. Aortas Image ex vivo inmediatamente después de la cosecha mediante formación de imágenes de fluorescencia de reflectancia en el infrarrojo cercano. ²⁵
   1. Establecer el generador de imágenes de fluorescencia a las longitudes de onda de múltiples canales apropiados para cuantificar las intensidades de señal de fluorescencia de las aortas de calcio NIR y ratones catepsina NIR-inyectado, como se ha descrito previamente. ²⁵ Según el fabricante, NIR de calcio puede ser excitado por ~ 650-678 nm de luz con una emisión máxima en el rango de 680-700 nm ~. Catepsina NIR puede ser excitado por ~ 745-750 nm de luz con una emisión máxima a ~ 770 nm.

5. Aislamiento de vasculares de aorta primaria murino células del músculo liso

1. Realice los pasos 3.1 a 3.7 como se describe anteriormente.
2. Coloque aortas en HBSS fría hasta que las disecciones se han completado. Corte con cuidado cualquier remaining grasa periaortic y el tejido blando, dejando sólo la aorta.
3. Bajo una campana de cultivo de tejido estéril, transferir las aortas a la solución de digestión aórtica en 35 mm x 10 mm placas de cultivo de tejidos. Colocar en una incubadora a 37 ° C durante 30 minutos con agitación intermitente suave. Después de la digestión, las aortas exhiben una apariencia estirada o deshilachado.
4. Con el microscopio de disección y pinzas estériles, eliminar la capa externa de la adventicia de la aorta, manteniendo intacta la capa media. Una de las técnicas para la eliminación de la adventicia es para despegar la capa externa de la aorta en un extremo y sacarlo de la capa media subyacente como un calcetín podría desprendió y se retira.
5. Una vez que la capa adventicia se ha eliminado, coloque la aorta restantes en una nueva placa de cultivo de tejidos con medios de cultivo celular y se almacena a 37 ° C con 5% de _CO2 durante 2-4 horas.
6. Bajo una campana estéril y con unas tijeras de disección micro-estériles de 3 mm, cortar la aorta hasta 1-2 mm de anchoanillos.
7. Coloque estos anillos en una nueva placa de cultivo de tejido aórtico con solución de digestión y se incuba a 37 ° C con suave balanceo intermitente durante 120 minutos. Pipetear la solución hacia arriba y abajo varias veces durante la incubación para volver a suspender las células.
8. Añadir 5 ml de medio de cultivo celular caliente a la solución de la digestión y la transferencia a un tubo cónico de 15 ml.
9. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 200 x g.
10. Aspirar los medios de comunicación y Resuspender las células en el volumen deseado de medio de cultivo celular (por ejemplo, 5 ml).
11. Placa de la cantidad total de células aisladas de cada aorta en un 25 cm matraz de cultivo de ² células y se incuba a 37 ° C con 5% de CO _2. Propagar las células usando técnicas estándar, como se describe anteriormente. ^25,48 Durante los primeros 7-10 días de incubación, cambiar los medios de comunicación cada 72 a 96 hr. A medida que las células se aproximan a la confluencia, reponer los soportes con más frecuencia (cada 48 horas).
    Nota: Puede tomar varias semanas para hacer crecer un sine qua suficientesntity de las células.
12. Una vez confluentes, las células con tripsina de paso que se calienta a 37 ^{° C.}
    1. Añadir 0,5-1,0 ml de tripsina a cada frasco de cultivo y se incuba durante 3-5 minutos; golpee suavemente el lateral del matraz cada 30 a 60 segundos, según sea necesario para separar las células de la superficie.
    2. Una vez que las células se separan de la parte inferior del frasco, añadir 10 ml de medio de células a las células en tripsina. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. Aspirar los medios de comunicación y la tripsina del sedimento celular. Resuspender las células en la cantidad deseada de medio de células fresco (por ejemplo, 5 a 10 ml) y la transferencia a un nuevo matraz (con algunas células transferidas a un portaobjetos de cámara).
13. En el primero paso de las células, confirmar el linaje de células de músculo liso con técnicas de inmunocitoquímica estándar, como se describe anteriormente, ⁴⁹ el uso de un anticuerpo dirigido contra actina de músculo α-liso.

6. Inducción de calcificación de músculo liso cultivadasCélulas

1. células de la placa obtuvieron a partir de 5,12 en un formato de 6 pocillos. Nota: A partir de las células de 1 x 10 ⁵ / pocillo en un volumen total de 2,0 ml de medio de células por se recomienda también.
2. Permiten que las células crezcan en la calcificación de Medios A o B durante al menos 7 días en un formato de placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO _2.
3. Cambio de medio de células cada 48 horas.

7. Evaluación de VSMC Calcificación Uso de la Kossa tinción von Método

Nota:. El método de von Kossa para la medición de la calcificación de la matriz extracelular de los tejidos o células cultivadas se basa en la sustitución de los iones de calcio unido a fosfato con los iones de plata ⁵⁰ En presencia de compuestos ligeros y orgánicos, los iones de plata se reducen y se visualizan como metálico plata. Cualquier plata sin reaccionar se elimina por tratamiento con tiosulfato de sodio ⁵⁰ El protocolo para la tinción de von Kossa es el siguiente.:

1. Aspirar los medios de cu celularlture placas.
2. Fijar las células colocándolos en 1 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 min.
3. Eliminar la formalina y lavar las células fijadas con agua destilada durante 5 min.
4. Se incuban las células en 1 ml de solución de nitrato de plata 5% bajo una bombilla de 60 a 100 W durante 1-2 horas.
5. Aspirar la solución de nitrato de plata y lavar con agua destilada durante 5 min.
6. Retire plata sin reaccionar mediante la colocación de las células en 1 ml de tiosulfato de sodio al 5% de solución en agua destilada durante 5 min (v / w).
7. Enjuagar las células con agua destilada durante 5 min. Se repite 3 veces lavados. La tinción de von Kossa está listo para la imagen con el microscopio de luz invertida estándar.
8. Paso opcional: contratinción con 1 ml de rojo nuclear durante 5 minutos. Siga esto con tres lavados con agua destilada (5 min cada uno).

O

8. La evaluación de CMLV con calcificación de imagen fluorescente del infrarrojo cercano

Nota: Al igual que su capacidadpara identificar la calcificación dentro de aortas de ratones, calcio NIR se une fácilmente mineral calcificada depositada por las células cultivadas. Usando esta técnica, microscopía fluorescente y lectores de placas con filtros de longitud de onda larga puede imagen y cuantificar la calcificación in vitro, respectivamente. La larga longitud de onda de emisión del calcio NIR permite la utilización simultánea de fluoróforos que emiten longitud de onda inferior a detectar otras características. El protocolo para el calcio NIR tinción es la siguiente:

1. Como se describe en la Sección 1.1.1, añadir 1,2 ml de 1x PBS al vial que contiene 24 nmol de calcio NIR.
2. Diluir el calcio NIR stock 1: 100 en los medios de calcificación o de control apropiadas.
3. Aspirar medio de células de placas de cultivo y reemplazar con el calcio NIR que contiene medio de cultivo.
4. Se incuban las placas de cultivo con medios NIR de calcio durante la noche a 37 ° C.
5. Aspirar los medios de los pocillos y lavar los pocillos una vez con PBS.
   Nota: En este punto,los medios de cultivo original se puede añadieron a los pocillos, y las células se pueden obtener imágenes en vivo. De lo contrario, continúe con los pasos siguientes.
6. Fijar las células colocándolos en 1 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 min.
7. Eliminar la formalina y lavar las células fijadas con agua destilada durante 5 min. Se repite 3 veces lavados.
8. Paso opcional:. Realizar la tinción de inmunofluorescencia u otros contratinciones de proteínas de interés ^8,9
9. Imagen o detectar la mancha NIR de calcio utilizando longitudes de onda de excitación de fluorescencia apropiada (por ejemplo, calcio NIR puede ser excitado por la luz 650-678 nm) y filtros de emisión (~ 680-700 nm).

Resultados

Calcificación aórtica en MGP ^{- / -} y de tipo salvaje ratones se midió utilizando imágenes de fluorescencia NIR calcio. No se detectó señal NIR calcio en las aortas de ratones de tipo salvaje, que indica la ausencia de calcificación (Figura 2). Se ha detectado una señal de calcio NIR fuerte en las aortas de los ratones con deficiencia de MGP, lo cual es consistente con la calcificación vascular avanzada. Las secciones de tejido de aortas de tipo salvaj...

Discusión

La calcificación arterial es un importante factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular en los seres humanos y puede contribuir directamente a la patogénesis de los eventos cardiovasculares. Se ha propuesto ^1,5,52 depósito de calcio en la íntima de las delgadas cubierta fibrosa de la enfermedad aterosclerótica para aumentar el estrés biomecánico local y contribuir a ruptura de la placa. ^53,54 calcificación medial impactos resultados clínicos mediante el aumento de la rigidez arterial...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tube	Falcon	352096
30 G needle	BD	305106
Alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	SAB2500963
Chamber slide	Nunc Lab-Tek	154461
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004176
Dexamethasone	Sigma	D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium	Gibco	14190-144
Elastase	Sigma	E1250
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Forceps, fine point	Roboz	RS-4972
Forceps, full curve serrated	Roboz	RS-5138
Formalin (10%)	Electron Microscopy Sciences	15740
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells	PromoCell	C-12511
Insulin syringe with needle	Terumo	SS30M2913
L-ascorbic acid	Sigma	A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13 mm)	Roboz	RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3 mm)	Roboz	RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX)	Perkin Elmer	NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX)	Perkin Elmer	NEV10020EX
Normal Saline	Hospira	0409-4888-10
Nuclear fast red	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey Imaging System	Li-Cor	Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-001-CI
Silver nitrate (5%)	Ricca Chemical Company	6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S-9390
Sodium thiosulfate	Sigma	S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma	G9422
Tissue culture flask, 25 cm2	Falcon	353108
Tissue culture plate (35 mm x 10 mm)	Falcon	353001
Tissue culture plate, six-well	Falcon	353046
Trypsin	Corning	25-053-CI
Tube rodent holder	Kent Scientific	RSTR551
Vacuum-driven filtration system	Millipore	SCGP00525