Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

Resumo

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Resumo

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Introdução

A doença cardiovascular é a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo, incluindo os Estados Unidos, onde é responsável por mais de 780.000 mortes anualmente. ¹ calcificação da artéria coronária e calcificação aórtica são características da doença aterosclerótica e servem como fortes preditores de eventos cardiovasculares. ^{2- 4} dois tipos principais de calcificação vascular foram relatadas em adultos: a calcificação da íntima, associado com a aterosclerose, e medial (também conhecido como Mönckeberg) calcificação, associada à doença renal crônica e diabetes ⁵ intimal calcificação ocorre no cenário de acumulação de lípidos e macrófagos. infiltração na parede do vaso. ^5,6 calcificação parede medial ocorre independentemente da calcificação da intima, localiza-se às fibras de elastina ou de células musculares lisas, e não está associada com a deposição de lípidos ou de infiltração de macrófagos. ^5,7,8 Estudos sobre os mecanismos moleculares decalcificação vascular têm contado com sistemas modelo baseados em células e animais. Modelos de roedores para a doença atherocalcific incluem ratinhos deficientes em qualquer apolipoproteína E (ApoE) ^9,10 ou receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR) ¹¹ alimentados com uma dieta rica em gordura, enquanto os modelos para a calcificação medial incluem ratos com proteína Gla de matriz deficiência (MGP) ¹² ou ratos que desenvolvem uremia quer por nefrectomia quase total (a 5/6 modelo de nefrectomia) ou por exposição a uma dieta rica em adenina. ¹³

Aqui, o modelo de calcificação vascular medial associada com deficiência de MGP é focado na. MGP é uma proteína extracelular que inibe a calcificação arterial. ¹² As mutações no gene de MGP foram identificados na síndrome Keutel, uma doença humana rara caracterizada por calcificação da cartilagem difusa para além brachytelephalangy, perda de audição, e estenose pulmonar periférica ^14-18. Embora não seja frequentemente observado, ¹⁹calcificação concêntrica de múltiplas artérias foi descrito na síndrome Keutel. ²⁰ polimorfismos comuns no gene MGP humana estão associados com risco aumentado de calcificação da artéria coronária, ^21-23, enquanto os níveis circulantes mais elevados de uncarboxylated MGP, biologicamente inactivo prever a mortalidade cardiovascular. ²⁴ Ao contrário dos humanos com a síndrome Keutel, ratos MGP-deficientes desenvolvem um fenótipo vascular grave que consiste de calcificação arterial generalizada espontânea a partir de duas semanas de idade e morrem 6-8 semanas após o nascimento, devido à ruptura da aorta ^12.

Ao contrário da ApoE ^{- / -} e de LDLR ^{- / -} ratos alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura, que se desenvolvem calcificação vascular da íntima com a inflamação induzida por macrófago associada, MGP ^{- / -.} Ratinhos desenvolvem calcificação vascular medial na ausência de infiltração de macrófagos ^11,25 Embora estes resultados sugerem diferentes estímulos subjacentes para intimai e calcificação da média, há sobreposição nos mecanismos de sinalização que medeiam a ambas as formas de calcificação. ²⁶ múltiplas vias de sinalização tenham sido identificados que contribuem para a calcificação vascular incluindo mediadores inflamatórios tais como factor de necrose tumoral-α e IL-1 e factores pró-osteogénicas tais como Notch, Wnt, e proteína morfogenética do osso (BMP) de sinalização. Estas vias de sinalização ^27,28 aumentar a expressão dos factores de transcrição relacionados com o factor de transcrição enfezado 2 (Runx2) e osterix, que por sua vez aumentar a expressão de proteínas relacionadas com os ossos ( . por exemplo, a osteocalcina, sclerostin, e fosfatase alcalina) na vasculatura que medeiam a calcificação ^28-30 Nós e outros demonstraram que a calcificação vascular observada em ApoE ^{- / -} e de LDLR ^{- / -} ratos alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura e a espontânea calcificação vascular observada em MGP ^{- / -} ratos todos dependem de proteína morfogenética óssea (BMP) signaling, e é esta via que é focado sobre aqui. ^11,25,31 BMPs são potentes factores osteogénicos necessários para a formação óssea e são conhecidos por apresentar um aumento da expressão na aterosclerose humana. ^32-34 Estudos in vitro têm implicado na regulação de sinalização de BMP a expressão de factores osteogénicos, tais como Runx2 ^35-37. a sobre-expressão do ligando BMP, BMP-2, acelera o desenvolvimento da calcificação vascular em ratinhos ApoE-deficient alimentados com uma dieta rica em gordura. ³⁸ Além disso, a utilização de inibidores específicos de BMP tais sinalização como LDN-193189 (LDN) ^39,40 e / ou ALK3-Fc impede o desenvolvimento de calcificação vascular em ambos LDLR ^{- / -} ratos alimentados com uma dieta rica em gordura e ratos MGP-deficientes ^11,25.

Células do músculo liso vascular (VSMC) têm um papel crítico no desenvolvimento da calcificação vascular. ^30,41,42 A calcificação vascular medial que se desenvolve em ratinhos deficientes MGP é caractezado por uma transdiferenciação de VSMC a um fenótipo osteogênico. Perda de MGP resulta na diminuição da expressão de marcadores de VSMC incluindo myocardin e alfa actina de músculo liso, com um aumento concomitante nos marcadores osteogénicas, tais como Runx2 e osteopontina. Estas alterações coincidir com o desenvolvimento de calcificação vascular ^25,43,44.

Calcificação aórtica e inflamação em ratinhos são tipicamente avaliada utilizando técnicas histoquímicas, como atividade de fosfatase alcalina para a calcificação precoce e actividade osteogénica, von Kossa e Alizarina coloração vermelha para o final de calcificação e protocolos de imuno-histoquímica que têm como alvo proteínas marcadores de macrófagos (por exemplo., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). ^9,45 no entanto, estas técnicas de imagiologia convencionais implicam o tratamento de tecidos da aorta em secções transversais, o que é demorado e imperfeito devido à polarização de amostragem, e estão limitados na sua capacidade de quantificar a inflamação e calcificatiônica em toda a aorta. Este protocolo descreve um método para visualizar e quantificar a calcificação arterial aórtica e médias todo e acumulação de macrófagos utilizando fluorescente no infravermelho próximo (NIR) imagiologia molecular ex vivo. Também é fornecido um método para a colheita e a cultura de VSMCs primária da aorta de ratinhos, e induzindo a calcificação de murino e VSMCs humanas in vitro a fim de determinar os mecanismos moleculares subjacentes a calcificação vascular. Estas técnicas proporcionam o investigador com tanto in vivo e in vitro para estudar a doença atherocalcific.

Protocolo

Todos os estudos com ratos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Habitação e todos os procedimentos que envolvem ratos descritos neste estudo foram aprovados pelo Cuidado Institucional Animal e Uso Comitês do Massachusetts General Hospital (Subcomissão de Investigação Animal Care). Todos os procedimentos foram realizados com cuidado para minimizar o sofrimento.

1. Preparação dos Reagentes

1. Near-Infrared fluorescência imagem de todo aortas
   Nota:. Um derivado de bisfosfonato, de infravermelho próximo sonda de imagiologia fluorescente pode ser usado para marcar a actividade osteogénica na vasculatura por ligação a hidroxiapatite ^46,47 Uma sonda de imagem activadas fluorescentes-catepsina pode servir como um marcador para a actividade proteolítica dos macrófagos e, em elastolítico a vasculatura. ⁹ Para permitir a utilização simultânea de ambas as sondas fluorescentes, é importantepara utilizar sondas que são espectralmente distinto. O cálcio notação NIR será usado para indicar o infravermelho próximo sonda de imagem fluorescente e catepsina-NIR específica calcificação para indicar a sonda de imagiologia fluorescente catepsina específico da actividade de infravermelho próximo.
   1. Preparar as soluções de cálcio e catepsina NIR NIR. De acordo com os protocolos do fabricante, adicionar 1,2 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS) para o frasco contendo 24 nmol de cálcio NIR ou catepsina NIR e agitar suavemente.
      Nota: De acordo com o fabricante, uma vez reconstituído com PBS, as soluções de cálcio e NIR NIR catepsina permanecerá estável durante 14 dias quando armazenado no escuro a 2-8 ° C.
2. Isolamento e calcificação de Murino aórtica VSMC
   1. A digestão da aorta Solução:
      1. Prepara-se uma solução fresca (~ 3-5 ml por aorta retirado) com Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) contendo 175 U / ml de tipo 2 e 1,25 U de colagenase / elastase ml. Esterilizar a solução wom de um sistema de filtração de 0,22 um accionado por vácuo e manter a solução em gelo até à sua utilização.
   2. Meios celular:
      1. Suplemento 500 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Aquecer os meios de comunicação a 37 ° C antes da utilização.
   3. Calcificação de mídia:
      1. Calcificação de mídia A (NaPhos; utilizado em linhas de células de rato):
         1. Suplemento 100-500 mL de meio DMEM (volume conforme o necessário) com 10% de soro fetal de bovino, 2 mM de fosfato de sódio, 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Aquecer os meios de comunicação a 37 ° C antes da utilização.
            
            OU
            
      2. Calcificação Mídia B (βGP / Asc / DEX; utilizado em qualquer mouse ou linhas de células humanas):
         1. Suplemento 100-500 mL de meio DMEM (volume conforme o necessário) com 10% de soro fetal bovino, 10 mM de dissódio β-glicerofosfato, 50 ug / ml de ácido L-ascórbico, 10nM dexametasona, 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Aquecer os meios de comunicação a 37 ° C antes da utilização.

2. injecção na veia da cauda

1. Antes da injecção cauda, ​​aquecer os ratos sob uma lâmpada de aquecimento leve para 5 min.
2. Contenha o mouse em um suporte de tubo de roedor. Desinfectar a cauda com um algodão embebido em álcool.
3. Utilizar uma agulha de 30 G para a injecção na veia da cauda. veias da cauda estão localizados lateralmente.
   1. Aplique uma quantidade suave de pressão para a frente da seringa quando a agulha é avançada na cauda. A veia é acedida uma vez que a resistência a injecção não está mais presente.
   2. Injectar um volume de 100 ul de cálcio NIR e / ou 100 ul de catepsina NIR a uma taxa constante. No final da injecção, depois de uma pausa de 5 segundos, retirar a agulha.
4. Colheita das aortas (ver secção 3) 3-24 horas após a injeção.

3. Rato Dissection

1. Euthanize rato com um 200 mg de injeção de pentobarbital / kg intraperitoneal.
2. Coloque o supino animal na placa de dissecção e estabilizar gravando cada pata para o conselho. Usando um microscópio de dissecação e uma tesoura pequena, fazer uma incisão na linha média que se estende desde a parte inferior do abdômen ao tórax superior.
3. Retire a pele com uma pinça e retire o peritônio, revelando os órgãos abdominais. Retirar os órgãos gastrointestinais, tomando cuidado para não transecto da aorta.
4. Adicione uma incisão lateral no diafragma anterior e continuar a incisão através do abdómen. Com uma tesoura de dissecação, libertar a caixa torácica com o corte através dos lados das nervuras e a remoção do tecido mole aderente à parte superior do esterno. Remover a caixa torácica, revelando os pulmões.
5. Deixe o coração no lugar inicialmente (para auxílio na identificação e dissecção da aorta proximal) e retire cuidadosamente os pulmões. Remova o timo, traquéia e esôfago com cuidado, ensuring que a aorta permanece intacta.
6. Utilizando uma pinça reta finas e-dissecando tesoura micro, remover o tecido mole ao redor da aorta da bifurcação ilíaca ao arco aórtico, prestando muita atenção ao retirar o peri-aórtico de gordura (Figura 1A). Retire a gordura e tecido mole permanecendo em torno das grandes ramos do arco aórtico (artérias ou seja, braquiocefálicas, carótida comum e subclávia, Figura 1B).
   Nota: É importante remover a gordura da aorta porque a gordura pode aumentar o sinal de fundo ao realizar imagiologia de fluorescência.
7. Tiraram o coração do interior da cavidade torácica, destacando-o cuidadosamente da aorta proximal, e descartar. Transecto da aorta distal, na bifurcação ilíaca. Usando uma agulha de insulina, injectar solução salina normal para a aorta a partir do arco da aorta para lavar os glóbulos remanescentes. Retire a aorta, juntamente com os vasos do arco aórtico, removê-lo completamentea partir do corpo.
8. Coloque a aorta em solução salina normal em gelo até estarem prontos para imagiologia.

4. aórtica Imagiologia

1. Aortas imagem ex vivo imediatamente após a colheita por imagem de fluorescência de reflectância de infravermelho próximo. ²⁵
   1. Definir o gerador de imagens de fluorescência nos comprimentos de onda adequados para quantificar multicanal intensidades de sinal de fluorescência a partir das aortas de ratos e de cálcio NIR catepsina NIR-injectado, tal como anteriormente descrito. ²⁵ De acordo com o fabricante, NIR de cálcio pode ser excitado por ~ 650-678 nm com luz uma emissão máxima no 680-700 nm gama ~. Catepsina NIR pode ser animado por ~ 745-750 nm de luz com uma emissão máxima em ~ 770 nm.

5. Isolamento de Primário Murino aórtica vasculares células musculares lisas

1. Execute os passos 3,1-3,7 como descrito acima.
2. Coloque aortas em HBSS frio até que as dissecações estão completos. Cortar cuidadosamente qualquer remaining periaórtica gordura e de tecido mole, deixando apenas a aorta.
3. Dentro de uma câmara de cultura de tecido estéril, transferir as aortas para a digestão Solução de aorta no de 35 mm x 10 mm pratos de cultura de tecidos. Coloque dentro de uma incubadora a 37 ° C durante 30 min com agitação intermitente suave. Após a digestão, as aortas exibem uma aparência esticada ou desgastado.
4. Com o microscópio de dissecção e uma pinça estéril, remover a camada adventícia exterior da aorta, mantendo a camada medial intacta. Uma técnica para a remoção da adventícia é para descascar a camada exterior da aorta em uma extremidade e removê-la a partir da camada média subjacente como uma meia poderia ser retirada e removida.
5. Uma vez que a camada adventícia foi removido, colocar os restantes aorta para uma nova placa de cultura de tecidos com meio de cultura celular e armazenamento a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 2-4 horas.
6. Dentro de uma câmara estéril e usando 3 mm estéreis tesoura micro-dissecação, cortados em aorta 1-2 mm de larguraanéis.
7. Colocar estes anéis numa nova placa de cultura de tecidos com aórtica Digestão solução e incubar a 37 ° C com balanço suave intermitente durante 120 min. Pipetar a solução para cima e para baixo várias vezes durante a incubação para ressuspender as células.
8. Adicionar 5 ml de meio de cultura de célula quente para a solução de digestão e transferir para um tubo de 15 ml.
9. Centrifugar o tubo durante 5 min a 200 x g.
10. Aspirar os meios de comunicação e Ressuspender as células no volume desejado de meio de cultura de células (por exemplo, 5 ml).
11. Placa toda a quantidade de células isoladas da aorta em cada uma 25 centímetros frasco de cultura ² de células e incubar a 37 ° C com 5% de CO _2. Propagar células utilizando técnicas padrão, tal como anteriormente descrito. ^25,48 Durante os primeiros 7-10 dias de incubação, alterar o suporte de todas as 72-96 horas. À medida que as células se aproximar confluência, repor a mídia com mais frequência (a cada 48 horas).
    Nota: Pode levar várias semanas para crescer um qua suficiententity de células.
12. Uma vez confluentes, as células de passagem com tripsina, que é aquecido a 37 ^{° C.}
    1. Adicionar 0,5-1,0 ml de tripsina a cada balão de cultura e incuba-se durante 3-5 minutos; bata suavemente a parede lateral do balão a cada 30-60 segundos, conforme necessário para separar as células da superfície.
    2. Uma vez que as células de separar a partir do fundo do frasco, adicionar 10 ml de meio celular para as células em tripsina. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min. Aspirar os meios de comunicação e tripsina a partir do sedimento de células. Ressuspender as células na quantidade desejada de meios de células frescas (por exemplo, 5-10 ml) e transferir para um novo frasco (com algumas células transferidas para uma lâmina de câmara).
13. Na primeira passagem de células, confirmar a linhagem de células do músculo liso com técnicas de imunocitoquímica padrão, como descrito anteriormente, ⁴⁹ utilizando um anticorpo dirigido contra a actina de músculo liso-α.

6. Indução de calcificação do músculo liso Cultivadascélulas

1. células da placa obtido a partir de 5,12 em um formato de 6 poços. Nota: A partir de 1 x 10 ⁵ células / poço num volume total de 2,0 ml de meio de células por poço é recomendado.
2. Permitir que as células crescer em Meio A calcificação ou B, pelo menos, 7 dias num formato de placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO _2.
3. Mudança de mídia celulares a cada 48 horas.

7. Avaliação Calcificação VSMC Usando o método de coloração de von Kossa

Nota:. O método de von Kossa para medir a calcificação da matriz extracelular de tecidos ou células cultivadas é baseado na substituição de iões de cálcio ligados a fosfato com os iões de prata ⁵⁰ Na presença de compostos leves e orgânicas, os iões de prata são reduzidos e visualizada como metálico prata. Qualquer prata que não reagiu é removido por tratamento com tiossulfato de sódio a ⁵⁰ O protocolo para a coloração de von Kossa é como se segue.:

1. media aspirado de cu celularplacas LTURE.
2. Fixar as células, colocando-os em 1 ml de formalina a 10% à temperatura ambiente durante 20 min.
3. Remover o formalina e lavar as células fixadas com água destilada durante 5 minutos.
4. Incubar as células em 1 ml de solução de nitrato de prata a 5% sob uma lâmpada de 60-100 W durante 1-2 horas.
5. Aspirar a solução de nitrato de prata e lava-se com água destilada durante 5 minutos.
6. Remover prata que não reagiu por colocação das células em 1 ml de 5% de tiossulfato de sódio a solução em água destilada durante 5 minutos (v / w).
7. Lavar as células com água destilada durante 5 minutos. Repetir 3x lavagens. A mancha von Kossa está pronto para geração de imagens com microscopia de luz invertida padrão.
8. Passo opcional: contracoloração com 1 mL de vermelho rápido nuclear durante 5 min. Seguir-se com três lavagens com água destilada (5 minutos cada).

OU

8. Avaliar VSMC calcificação com a imagem fluorescente Near-infrared

Nota: Semelhante a sua capacidadepara identificar a calcificação dentro aortas de rato, cálcio NIR prontamente se liga mineral calcificada depositado por células cultivadas. Usando esta técnica, microscopia fluorescente e leitores de placas com filtros de comprimento de onda longos podem imagem e quantificar a calcificação in vitro, respectivamente. O comprimento de onda de emissão longo do cálcio NIR permite a utilização simultânea de fluoróforos que emitem comprimentos de onda mais baixo para detectar outras características. O protocolo para o cálcio NIR coloração é como se segue:

1. Conforme descrito na Seção 1.1.1, adicionar 1,2 ml de 1x PBS para o frasco contendo 24 nmol de cálcio NIR.
2. Diluir o cálcio estoque NIR 1: 100 na calcificação ou de controle de mídia apropriados.
3. meios de células de aspirado de placas de cultura e substituir com o cálcio NIR contendo meio de cultura.
4. Incubar as placas de cultura com meios NIR de cálcio durante a noite a 37 ° C.
5. Aspirar a mídia dos poços e lavar os poços uma vez com PBS.
   Nota: Neste ponto,o meio de cultura original pode ser adicionado aos poços, e as células podem ser trabalhada ao vivo. Caso contrário, continue com os passos abaixo.
6. Fixar as células, colocando-os em 1 ml de formalina a 10% à temperatura ambiente durante 20 min.
7. Remover o formalina e lavar as células fixadas com água destilada durante 5 minutos. Repetir 3x lavagens.
8. Etapa opcional:. Execute imunofluorescência ou outros counterstains para proteínas de interesse ^8,9
9. Imagem ou detectar a mancha NIR de cálcio usando comprimentos de onda de fluorescência apropriado de excitação (por exemplo, NIR de cálcio podem ser excitados por luz 650-678 nm) e filtros de emissão (~ 680-700 nm).

Resultados

Calcificação aórtica em MGP ^{- / -} e murganhos de tipo selvagem foi medida utilizando imagiologia de fluorescência NIR cálcio. Nenhum sinal foi detectado NIR cálcio nas aortas de ratinhos de tipo selvagem, indicando a ausência de calcificação (Figura 2). Um sinal de NIR de cálcio forte foi detectada nas aortas de MGP com deficiência de camundongos, o que é consistente com calcificação vascular avançada. As secções de tecido de aorta a partir de...

Discussão

Calcificação arterial é um importante fator de risco para as doenças cardiovasculares em seres humanos e pode contribuir diretamente para a patogênese de eventos cardiovasculares. ^1,5,52 deposição de cálcio íntima nas calotas fibrosos finos de doença aterosclerótica foi proposto para aumentar o estresse biomecânico local e contribuir para ruptura da placa. ^53,54 impactos calcificação Medial resultados clínicos, aumentando a rigidez arterial, o que pode induzir a hipertrofia cardíaca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tube	Falcon	352096
30 G needle	BD	305106
Alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	SAB2500963
Chamber slide	Nunc Lab-Tek	154461
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004176
Dexamethasone	Sigma	D4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium	Gibco	14190-144
Elastase	Sigma	E1250
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Forceps, fine point	Roboz	RS-4972
Forceps, full curve serrated	Roboz	RS-5138
Formalin (10%)	Electron Microscopy Sciences	15740
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025-092
Human coronary artery smooth muscle cells	PromoCell	C-12511
Insulin syringe with needle	Terumo	SS30M2913
L-ascorbic acid	Sigma	A-7506
Micro-dissecting spring scissors (13 mm)	Roboz	RS-5676
Micro-dissecting spring scissors (3 mm)	Roboz	RS-5610
NIR, cathepsin (ProSense-750EX)	Perkin Elmer	NEV10001EX
NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX)	Perkin Elmer	NEV10020EX
Normal Saline	Hospira	0409-4888-10
Nuclear fast red	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey Imaging System	Li-Cor	Odyssey 3.0
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-001-CI
Silver nitrate (5%)	Ricca Chemical Company	6828-16
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S-9390
Sodium thiosulfate	Sigma	S-1648
ß-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma	G9422
Tissue culture flask, 25 cm2	Falcon	353108
Tissue culture plate (35 mm x 10 mm)	Falcon	353001
Tissue culture plate, six-well	Falcon	353046
Trypsin	Corning	25-053-CI
Tube rodent holder	Kent Scientific	RSTR551
Vacuum-driven filtration system	Millipore	SCGP00525