JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وهناك طريقة العائد المرتفع على خطوة واحدة تنقية السلبية المؤتلف هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) overexpressed في القولونية باستخدام راتنجات diethylaminoethyl في دفعة واسطة يوصف. HP-NAP تنقيته بواسطة هذه الطريقة هو مفيد لتطوير اللقاحات والعقاقير، أو تشخيص له. بيلوري -associated الأمراض.

Abstract

هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) هو عامل الفوعة الرئيسي للهيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري). انها تلعب دورا حاسما في ه. -induced بيلوري التهاب المعدة عن طريق تنشيط الكريات البيض عدة الفطرية بما فيها العدلات، وحيدات، والخلايا البدينة. الخصائص المناعية والمناعية من HP-NAP تجعل منه مرشحا محتملا التشخيص واللقاحات له. بيلوري ومرشح دواء جديد لعلاج السرطان. من أجل الحصول على كميات كبيرة من تنقية HP-NAP المستخدمة في التطبيقات السريرية لها، وسيلة فعالة لتنقية هذا البروتين مع ارتفاع العائد ونقاء يحتاج إلى أن تنشأ.

في هذا البروتوكول، ونحن قد وصفت طريقة لخطوة واحدة تنقية الكروماتوغرافي السلبية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية (إي كولاي) باستخدام diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني (على سبيل المثال، باستخدام Sephadex) طدفعة واسطة ن. يشكل المؤتلف HP-NAP ما يقرب من 70٪ من البروتين الكلي في E. يتم استرداد القولونية وبشكل كامل تقريبا في جزء قابل للذوبان على تحلل الخلايا في درجة الحموضة 9.0. تحت الظروف المثلى في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد معظم HP-NAP في جزء غير منضم في حين أن البروتينات الذاتية من E. تتم إزالة القولونية بكفاءة من الراتنج.

هذه طريقة تنقية باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني غلة وظيفية HP-NAP من E. القولونية في شكل الأصلي مع ارتفاع العائد والنقاء. المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.

Introduction

هيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري) هو أحد الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والقرحة الهضمية. كما تم تصنيفها هذه البكتيريا كمادة مسرطنة في البشر من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان، وهي جزء من منظمة الصحة العالمية، في عام 1994. وتشير التقديرات إلى أن معدل انتشار ه. العدوى بيلوري 70٪ في البلدان النامية، و30-40٪ في البلدان الصناعية 1. على الرغم من أن معدل إصابة ه. بيلوري يتناقص في البلدان الصناعية، فإن معدل إصابة ه. بيلوري في البلدان النامية لا يزال مرتفعا 2. العلاج القياسي للقضاء على ه. يتكون العدوى بيلوري من إدارة مضخة البروتون مثبط، مؤشر أسعار المنتجين، واثنين من المضادات الحيوية، كلاريثروميسين بالإضافة إلى أموكسيسيلين أو ميترونيدازول 3. ومع ذلك، وصعود المقاومة للمضادات الحيوية في H. ذات الصلة ب بيلوري العلاج قرحة يحث على وضع استراتيجيات جديدة لمنع سص علاج العدوى. تطوير لقاح وقائي و / أو العلاجية ضد ه. بيلوري يمكن أن توفر نهجا بديلا للسيطرة على ه. العدوى بيلوري.

هيليكوباكتر بيلوري تم تحديد-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP)، وهو عامل الفوعة كبير من H بيلوري، للمرة الأولى في المستخلصات المائية من H. بيلوري مع القدرة على تفعيل العدلات على الانضمام إلى الخلايا البطانية وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 4. تسلل العدلة من الغشاء المخاطي في المعدة وجدت في H. pylori- المرضى المصابين مع التهاب المعدة قد تسهم في التهاب وتلف الأنسجة المعدة. وبالتالي، قد HP-NAP تلعب دورا المرضية من خلال تفعيل العدلات للحث على التهاب المعدة، مما يسبب المزيد من قرحة أو H. بيلوري -associated الأمراض المعدية. ومع ذلك، HP-NAP هو مرشح محتمل للتطبيقات السريرية 5،6. نظرا للمحترفين مناعة والمناعيةperties من HP-NAP، هذا البروتين يمكن أن تستخدم لتطوير لقاحات، وكلاء العلاجية، وأدوات التشخيص. وقد أجريت تجربة سريرية لاستخدام المؤتلف HP-NAP واحدة من مكونات لقاح بروتين ضد ه. بيلوري. يتكون هذا اللقاح المؤتلف HP-NAP، المرتبط سامة للخلية جين ألف (CagA)، والبروتينات المفجي سامة للخلية ألف (فاكا) وضعت مع هيدروكسيد الألومنيوم، وكذلك ثبت أن تكون آمنة ومناعة لدى البشر (7). أيضا، HP-NAP بمثابة مناعي قوي لتحريك T نوع المساعد 1 (TH1) -polarized الاستجابات المناعية لعلاج السرطان 8 وأسفل تنظيم الاستجابات المناعية بوساطة TH2-التي تسببها الحساسية والالتهابات الطفيلية 9،10. أما بالنسبة للتشخيص، وقد تم تطبيق المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP في H. -infected بيلوري المرضى 11. وأظهرت إحدى الدراسات أن مستوى الأجسام المضادة HP-NAP الخاصة في الأمصال من H. السنة التحضيرية-infected وري المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة وكان أعلى بكثير من تلك التي من المرضى الذين يعانون من التهاب المعدة المزمن 12. وأظهرت دراسة أخرى أيضا أن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP ترتبط مع وجود غير الفؤاد-المعدة غدية 13. وهكذا، يمكن تطبيقها المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP لتشخيص سرطان المعدة في H. -infected بيلوري المرضى. مجتمعة، المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.

من بين العديد من الطرق المستخدمة لتنقية المؤتلف HP-NAP أعرب في القولونية (إي كولاي) في شكله الأصلي ذكرت حتى الآن، هناك حاجة إلى الثانية خطوة تنقية تنطوي اللوني هلام الترشيح للحصول نقية للغاية HP-NAP 14-16 . هنا، وطريقة استخدام سلبي اللوني دفعة واسطة معيوصف diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني لتنقية HP-NAP overexpressed في E. القولونية مع ارتفاع العائد ودرجة نقاوة عالية. واستندت هذه التقنية تنقية على الربط للبروتينات الخلية المضيفة و / أو غيرها من الشوائب من HP-NAP إلى الراتنج. في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد أي ما يقرب من البروتينات الأخرى باستثناء HP-NAP من الكسر غير منضم. هذا النهج تنقية باستخدام DEAE التبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي بسيط وتوفير الوقت من خلال السماح تنقية المؤتلف HP-NAP عبر خطوة واحدة اللوني من خلال مجموعة من الكسر غير منضم. بالإضافة إلى HP-NAP، والعديد من الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الفيروسات 17، المناعي G (مفتش) 18، الهيموجلوبين 19، بروتين الفوسفاتيز 20، وعامل الفوعة فلاجيلين 21، كما تم الإبلاغ عن أن يطهر التبادل الأيوني اللوني في سلبية واسطة. ويفضل وضع سلبي للالتبادل الأيوني اللوني إذا الشوائب هي قاصرالمكونات الموجودة في العينة تعرضوا ليتم تنقيته 22. وقد استعرضت تطبيق اللوني سلبي في تنقية الجزيئات الحيوية الطبيعية أو المؤتلف مؤخرا 23.

ويقدم هذا التقرير خطوة بروتوكول خطوة للتعبير عن المؤتلف HP-NAP في E. القولونية، تحلل الخلايا، وتنقية HP-NAP باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني. إذا كان البروتين المطلوب لتنقية مناسبة للالتبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي، ويمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول صفها كنقطة انطلاق لتطوير عملية تنقية.

Protocol

وقد تم جمع الدم البشري من المتطوعين الأصحاء للموافقة المسبقة عن خطية مسبقة وموافقة من مجلس المؤسسي استعراض جامعة تسينغ هوا الوطنية، هسينشو، تايوان.

1. التعبير عن المؤتلف HP-NAP في E. القولونية

  1. إعداد البلازميد pET42a-NAP التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي من HP-NAP من H. بيلوري 26695 سلالة كما هو موضح سابقا (16). إعداد البلازميدات التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي من HP-NAP مع الطفرات نقطة المطلوبة كما هو موضح (انظر البروتوكول، خطوة 8).
  2. تحويل 10 نانوغرام من البلازميدات الحمض النووي أعلاه إلى E. القولونية BL21 (DE3) الخلايا المختصة عن طريق الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية، خط الخلايا على مرق استذابة (LB) أجار لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
  3. تطعيم المستعمرات واحد في أنابيب الفردية التي تحتوي على 5 مل من مرق LB مع 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين وزراعتها كما precultures في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع اهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة.
  4. تطعيم 2 مل من الخلايا ما قبل ثقافة أعلاه إلى 200 مل من مرق LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين في قارورة 1 لتر. احتضان القارورة ثقافة تلقيح عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع اهتزاز عند 170 دورة في الدقيقة حتى الامتصاصية في 600 نانومتر تصل إلى حوالي 0،4-0،5 الكشف عن طريق الأشعة فوق البنفسجية / VIS معمل.
  5. إضافة 80 ميكرولتر من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في الثقافة أعلاه لتركيز النهائي من 0.4 ملم للحث على التعبير عن HP-NAP. احتضان الثقافة لمدة 3 ساعة حتى الامتصاصية في 600 نانومتر تصل إلى حوالي 1،6-1،7.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 6000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة طاف. تخزين بيليه خلية في -70 درجة مئوية حتى تنقية.

2. إعداد جزء البروتين القابلة للذوبان التي تحتوي على HP-NAP

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية للخروج في 4 درجات مئوية.

  1. و resuspend 50 مل من خلية صellet أعد بروتوكول خطوة 1.6 في 20 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم التي تحتوي على 0.13 ملي phenylmethylsulfonyl فلوريد (PMSF)، 0.03 مم N-ألفا-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)، و 0.03 ملي N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) في 4 درجات مئوية كما سبق وصفها 16.
  2. تعطيل خلايا البكتيريا عن طريق تمرير تعليق البكتيرية من خلال الخالط ارتفاع ضغط تعمل على مجموعة من 15،000 إلى 20،000 رطل لمدة 7 مرات في 4 درجات مئوية.
  3. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا المحللة في 30000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لفصل أجزاء البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان باستخدام نابذة. نقل طاف باعتبارها جزء من البروتين القابلة للذوبان في كوب.
  4. قياس تركيز البروتين في جزء البروتين القابلة للذوبان باستخدام طريقة برادفورد باستخدام طقم التجارية مع زلال المصل البقري (BSA) كمعيار وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. إضافة 177.6 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك إلى 20 مل من الالبريد ذوبان جزء من البروتين الحصول عليها من بروتوكول خطوة 2.3 إلى ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني من درجة الحموضة 9.0 إلى 8.0 درجة الحموضة.
  6. إضافة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم إلى محلول البروتين المذكور أعلاه لجعل تركيز البروتين النهائي ليكون 0.5 ملغ / مل.

3. تنقية المؤتلف HP-NAP من E. القولونية التي كتبها Negative اللوني دفعة واسطة مع DEAE الراتنجات التبادل الأيوني

  1. إعداد 15 مل من راتنجات DEAE.
    1. تزن من 0.6 غرام من مسحوق جاف من راتنجات DEAE وتعليقه في 30 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 في اليوم على الاقل.
    2. أجهزة الطرد المركزي الراتنج في 10000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. إزالة والتخلص من طاف.
    4. إضافة 15 مل من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم.
    5. كرر بروتوكول الخطوات 3.1.2 إلى 3.1.4 أربع مرات أكثر.
    6. تخزين 15 مل استقر الراتنج (50٪ الطين في 30 مل العازلة تريس) في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: كل من الخطوة التاليةتتم الصورة من عند 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 45 مل من البروتينات القابلة للذوبان التي أعدت في بروتوكول خطوة 2،6 حتي 15 مل من الراتنج وتحريك الطين بروتين / الراتنج مع محرك مغناطيسي في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. صب الطين بروتين / الراتنج في عمود من البلاستيك أو الزجاج مزودة محبس. تسمح الراتنج ليستقر تحت الجاذبية.
  4. فتح محبس للسماح الحل البروتين لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع التدفق من خلال مثل جزء غير منضم، الذي يحتوي على تنقية HP-NAP.
  5. إضافة 15 مل من الجليد الباردة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم في العمود.
  6. فتح محبس للسماح للغسل العازلة لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع التدفق من خلال مثل جزء غسل.
  7. كرر بروتوكول الخطوات 3،5-3،6 أربع مرات أكثر لجمع الكسور غسل إضافية.
  8. إضافة 15 مل من الجليد الباردة 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 M كلوريد الصوديوم في عمود.
  9. فتح محبس للسماح للشطف العازلة لتشغيل من خلال العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى مستوى السائل في العمود أعلاه هو مجرد الراتنج. جمع من خلال تدفق كما الكسر شطف.
  10. كرر بروتوكول الخطوات 3،8-3،9 أربع مرات أكثر لجمع الكسور شطف إضافية.

4. تبادل العازلة وإزالة الذيفان الداخلي من HP-NAP تنقية كتبها Negative اللوني دفعة واسطة مع DEAE الراتنجات

ملاحظة: أعرب النقي HP-NAP في E. يحتاج القولونية يتعرضون للتخفيف الصرف وإزالة الذيفان الداخلي السابقة لتحفيز العدلات.

  1. أداء غسيل الكلى لتغيير المخزن المؤقت للتنقية HP-NAP إلى Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS)، ودرجة الحموضة 7.2، في 4 درجات مئوية باستخدام أنابيب غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 14 كيلو دالتون كما هو موضح سابقا (24).
  2. تصفية مدال HP-NAP من خلال سيرينجالبريد فلتر مع موجبة الشحنة، غشاء ماء تعلق على 20 الحقنة مل في معدلات تدفق تتراوح 2،5-4 مل / دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الذيفان الداخلي.

5. توصيف خصائص الجزيئية لتنقية المؤتلف HP-NAP من الصوديوم دوديسيل كبريتات-إس دي إس بايج (SDS-PAGE)، ويسترن التنشيف، الأم-PAGE، جل الترشيح اللوني، والتعميم ازدواج اللون الطيفي

  1. تحليل المنقى المؤتلف HP-NAP بواسطة SDS-PAGE والغربية النشاف مع supernatants ثقافة هجين يحتوي الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ماب 16F4 25 كما سبق وصفه (24).
  2. تحليل المطهرون HP-NAP التي كتبها الأم-PAGE وهلام الترشيح اللوني لدراسة وضعها بلازميدة قليلة القسيمات كما هو موضح سابقا (26).
  3. تحليل المنقى المؤتلف HP-NAP من ازدواج اللون الطيفي دائري لدراسة هيكلها الثانوي كما هو موضح سابقا (26).

6. تقييم الطهارة من HP-NAP من الفضة تلطيخ من هلام SDS-PAGE

  1. إعداد الحل وتحديد وتوعية حل، حل الفضة، ووضع حل، والتوقف عن الحل، والحل غسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للمجموعة الفضية تلطيخ.
  2. أداء تلطيخ الفضة من هلام SDS-PAGE وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لعدة تلطيخ الفضة.
  3. الحصول على صورة من هلام مع نظام التصوير.

7. قياس ROS الإنتاج من العدلات المستحث بواسطة HP-NAP

  1. عزل العدلات الإنسان من الدم heparinized البشري عن طريق الترسيب ديكستران تليها الطرد المركزي كثافة التدرج كما هو موضح سابقا (24).
  2. قياس الإنتاج ROS من العدلات حفز مع HP-NAP باستخدام التوهج الفحص تعتمد على مينول.
    1. تشغيل قارئ لوحة وضبط درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. وضعفارغة مسطحة القاع لوحة 96-جيدا بيضاء داخل الغرفة لوحة القارئ، والسماح لها الدافئة إلى 37 درجة مئوية.
    2. تحضير مخاليط التحفيز في مد برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، التي تحتوي على 0.9 ملي CaCl 2، 0.5 ملي MgCl 2، و 13.3 ميكرومتر 5-أمينو-2،3-ثنائي هيدرو-1،4-phthalazinedione (مينول) مع وجود وغياب 0.67 ميكرومتر-إزالة الذيفان الداخلي HP-NAP أعدت من بروتوكول خطوة 4.2.
    3. ضبط تركيز العدلات الإنسان أعدت من الخطوة بروتوكول 7،1-2 × 10 6 خلية / مل في مد برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، تحتوي على 5 ملي الجلوكوز.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق العدلة في كل بئر من 96-بشكل جيد في حين طبق من ذهب.
    5. إضافة 150 ميكرولتر من خليط من الحوافز التي أعدت من بروتوكول خطوة 7.2.2 في العدلات تحتوي جيدا في فترة زمنية من 5 ثوان لكل بئر.
    6. قياس الانبعاثات من التوهج لمدة 5 ثوان لكل بئر على مدى ثلاث ساعات باستخدام قارئ لوحة.

8.بناء الحمض النووي البلازميدات ايواء HP-NAP المسوخ التي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) القائم على الطفرات الموقع المباشرة

ملاحظة: تم إنشاء PCR القائم الطفرات المباشر الموقع في الأساس كما هو موضح سابقا 27 إلا أن أدخلت المواقع قيود "الصامتة" لالاشعال الطفرات التي كتبها الطفرات موقع الموجه (SDM) برنامج -assist 28.

  1. أداء PCR رد الفعل.
    1. إضافة 10 نانوغرام البلازميد pET42a-NAP، 1 ميكرومتر من أزواج التمهيدي الطفرات المدرجة في الجدول 1، 200 ميكرومتر من triphosphates deoxynucleoside (dNTPs)، و 3 وحدات من مزيج انزيم عالية الدقة PCR في أنبوب PCR يحتوي على ماء منزوع الأيونات، وإعطاء النهائي حجم 25 ميكرولتر.
    2. بدء دورات PCR في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتفسد الحمض النووي القالب، وتابع مع ​​12 دورات التضخيم في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، T م لم -5 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
    3. الانتهاء من دورات PCR معخطوة الصلب في T م ص -5 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وخطوة التمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. علاج 15 ميكرولتر من الناتج PCR مع 0.4 ميكرولتر من DPN أنا انزيم التقييد عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وبعد ذلك تحليل 2 ميكرولتر من الناتج PCR تعامل I-DPN من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز.
  3. المسوخ الشاشة.
    1. تحويل 2 ميكرولتر من الناتج PCR إلى E. القولونية DH5α الخلايا المختصة عن طريق الصدمة الحرارية لمدة 45 ثانية في 42 درجة مئوية.
    2. نشر الخلايا تحولت على لوحة LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    3. عزل DNA البلازميد من المستعمرات البكتيرية باستخدام عدة تحلل القلوية التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. علاج DNA البلازميد معزولة في بروتوكول خطوة 8.3.3 مع انزيم التقييد XhoI للتحقق من وجود الطفرات الصامتة المطلوبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    5. تسلسلDNA البلازميد التحقق من قبل بروتوكول خطوة 8.3.4 مع التمهيدي T7 المروج لتأكيد تصحيح تسلسل الترميز من المسوخ HP-NAP وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

النتائج

أعرب الرسم التخطيطي للإجراء التجريبي لتنقية السلبية المؤتلف HP-NAP في E. ويرد القولونية باستخدام DEAE راتنجات التبادل الأيوني في دفعة واسطة في الشكل 1. وتقوم هذه التقنية تنقية على الربط للبروتينات الخلية المضيفة و / أو غيرها من الشوائب...

Discussion

وضع دفعة اللوني السلبي مع DEAE راتنجات أنيون الصرف المقدمة هنا هي مناسبة لتنقية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية E. قيم الرقم الهيدروجيني للمخازن المستخدمة في خطوات تحلل الخلايا وتنقية هي حيوية للغاية لضمان ذوبان HP-NAP في E. لست] القولونية والفصل الفعال للا...

Disclosures

HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

Acknowledgements

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
pET42a-NAP N/AN/Aprepared as described in Supplementary data of Refernce 15 
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)Thermo Fisher Scientific IncC6000-03https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
KanamycinAmresco25389-94-0http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)MD Biomedical Inc101-367-93-1http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich10837091001protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)Sigma-AldrichT7254protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)Sigma-AldrichT4376protease inhibitor
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin)Sigma-AldrichP5619 a standard protein for Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride formSigma-AldrichA25120http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubingSpectrum Laboratories132720with molecular weight cutoff of 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membranePallMSTG25E3for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4N/AN/Araised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare Life Sciences28989335for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, proteinGE Healthcare Life Sciences17-1150-01http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare Life Sciences17-1440-02for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Flat bottom 96-well white plateThermo Fisher Scientific Inc236108http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
LuminolSigma-AldrichA8511protected from light
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR systemSigma-Aldrich11681834001source of High Fidelity PCR enzyme mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn INew England BiolabsR0176Shttps://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho INew England BiolabsR0146Shttps://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5αThermo Fisher Scientific Inc18265-017https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
NameCompanyProduct NumberComments
Equipment
 
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometerHitachi N/Aout of market and upgraded to a new model
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizerAvestin IncC315320http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifugeHitachi Koki Co90106401for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLCGE Healthcare Life Sciences18-1900-26for gel filtration chromatography
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometerAviv BiomedicalN/Aout of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging systemFujifilmN/Adiscontinued and replaced
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counterPerkin-Elmer1420-018for chemiluminescence detection
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018

References

  1. Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112 HP NAP DEAE E

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved