Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em Modo Batch

Resumo

Um método de alto rendimento para um passo de purificação negativa recombinante de Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP) sobre-expresso em Escherichia coli usando resinas dietilaminoetilo no modo de lote é descrito. HP-NAP purificada por este método é benéfico para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos, ou diagnóstico de H. pylori -associated doenças.

Resumo

Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP) é um importante fator de virulência de Helicobacter pylori (H. pylori). Ela desempenha um papel crítico em H. pylori induzida por inflamação gástrica, activando vários leucócitos inatas, incluindo neutrófilos, monócitos, mastócitos e células. As propriedades imunogênicas e imunomoduladores da HP-NAP torná-lo um candidato potencial de diagnóstico e vacinas para H. pylori e uma nova droga candidatos para a terapia do cancro. A fim de obter quantidades substanciais de HP-NAP purificada utilizada para as suas aplicações clínicas, um método eficiente para purificar esta proteína com elevado rendimento e grau de pureza deve ser estabelecida.

Neste protocolo, nós descrevemos um processo para um passo de purificação cromatográfica negativa recombinante de HP-PNA sobre-expresso em Escherichia coli (E. coli) usando dietilaminoetilo resinas de permuta iónica (DEAE) (por ex., Sephadex) iModo lote n. Recombinante HP-NAP constitui quase 70% do total de proteínas em E. coli e é quase totalmente recuperada na fracção solúvel após a lise celular, a pH 9,0. Sob a condição óptima a pH 8,0, a maioria dos HP-NAP é recuperada na fracção não ligada enquanto as proteínas endógenas da E. coli são eficientemente removida pela resina.

Este método de purificação utilizando cromatograf ia em lotes modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE produz funcional HP-NAP a partir de E. coli, na sua forma nativa com elevado rendimento e pureza. A HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.

Introdução

Helicobacter pylori (H. pylori) é uma das principais causas de gastrite e úlcera péptica. Esta bactéria também foi classificado como cancerígeno em humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, parte da Organização Mundial da Saúde, em 1994. Estima-se que a prevalência de H. pylori é de 70% nos países em desenvolvimento e 30-40% nos países industrializados ^1. Mesmo que a taxa de infecção de H. pylori está diminuindo nos países industrializados, a taxa de infecção de H. pylori em países em desenvolvimento ainda é alto ^2. O tratamento padrão para erradicar H. pylori consiste na administração de um inibidor da bomba de protões, IPP, e dois antibióticos, amoxicilina ou claritromicina mais metronidazole ^3. No entanto, o aumento da resistência aos antibióticos em H. pylori relacionados com a terapia de úlcera insta o desenvolvimento de novas estratégias para prevenir oR curar a infecção. O desenvolvimento de vacina preventiva e / ou terapêutica contra o H. pylori pode proporcionar uma abordagem alternativa para controlar H. pylori.

Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP), um importante fator de virulência do H. pylori, foi identificado pela primeira vez em extratos aquosos de H. pylori com a capacidade de activar os neutrófilos a aderir às células endoteliais e produzem espécies reactivas de oxigénio (ROS) ^4. A infiltração de neutrófilos na mucosa gástrica encontrada em H. pylori pacientes infectados com gastrite ativa pode resultar em inflamação e danos nos tecidos do estômago. Assim, HP-PNA pode desempenhar um papel patológico através da activação de neutrófilos para induzir a inflamação gástrica, o que provoca ainda mais úlcera ou H. pylori -associated doenças gástricas. No entanto, HP-NAP é um candidato potencial para aplicações clínicas ^5,6. Devido à pró imunogénica e imunomoduladorpriedades de HP-PNA, esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de vacinas, agentes terapêuticos, e ferramentas de diagnóstico. Um ensaio clínico foi conduzido para a utilização recombinante HP-NAP como um dos componentes de uma vacina contra a proteína H. pylori. Esta vacina consiste de recombinante HP-PNA, associado citotoxina-gene A (CagA), e proteínas citotoxina vacuolar A (VacA) formulado com hidróxido de alumínio e ainda tem sido demonstrado ser segura e imunogénica em humanos ^7. Além disso, a HP-NAP actua como um potente imunomodulador para desencadear T auxiliar tipo 1 (Th1) -polarized respostas imunitárias para a terapia do cancro e ⁸ para regular negativamente as respostas imunitárias mediadas por Th2 provocadas por reacções alérgicas e infecções parasitárias ^9,10. Como para o diagnóstico, com base ELISA-HP-NAP recombinante tem sido utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA em H. pylori pacientes infectados ^11. Um estudo mostrou que o nível de anticorpos específicos de HP-NAP em soros de H. pyLori pacientes infectados com carcinoma gástrico foi significativamente mais elevada do que a partir de pacientes com gastrite crónica ^12. Outro estudo também mostrou que os anticorpos séricos contra HP-PNA estão associados com a presença de não-cárdia adenocarcinoma gástrico ^13. Assim, ELISA baseado em HP-NAP recombinante pode ser utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA para o prognóstico do cancro gástrico em H. pylori pacientes infectados. Tomados em conjunto, o HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.

Entre os vários métodos utilizados para a purificação do HP-NAP recombinante expressa em Escherichia coli (E. coli) na sua forma nativa relatados até agora, uma cromatograf ia de filtração em gel segundo passo de purificação envolvendo é necessária para se obter elevada pureza HP-NAP ^14-16 . Aqui, um método utilizando a cromatografia modo descontínuo com negativodietilaminoetilo (DEAE) resinas de permuta iónica é descrito para a purificação do HP-PNA sobre-expresso em E. coli com elevado rendimento e elevada pureza. Esta técnica de purificação foi baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP são recuperados a partir da fracção livre. Esta abordagem purificação utilizando cromatografia de troca iônica DEAE no modo negativo é simples e economia de tempo, permitindo a purificação do recombinante HP-NAP através de cromatografia de uma etapa, através da recolha da fracção livre. Além de HP-PNA, várias outras biomoléculas, tais como vírus ^17, Imunoglobulina G (IgG) ^18, hemoglobina ^19, fosfatase de proteína ^20, e factor de virulência flagelina ^21, também tem sido relatado para ser purificado por cromatografia de permuta iónica em negativo modo. O modo negativo é o preferido para a cromatografia de permuta iónica se as impurezas são o menorcomponentes presentes na amostra submetida a ser purificada ^22. A aplicação de cromatografia negativa em purificação de biomoléculas naturais ou recombinantes foi recentemente revista ^23.

O presente relatório fornece um passo a passo de protocolo para a expressão de recombinante HP-NAP em E. coli, a lise das células, e a purificação do HP-PNA utilizando cromatografia lote modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE. Se uma proteína desejada para a purificação é adequada para cromatografia de permuta iónica em modo negativo, o protocolo descrito também pode ser adaptado como um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.

Protocolo

O sangue humano foi coletado de voluntários saudáveis ​​com o consentimento informado por escrito antes e aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Nacional Tsing Hua, Hsinchu, Taiwan.

1. Expressão Recombinante de HP-PNA em E. coli

1. Prepara-se o plasmídeo pET42a-PNA contendo a sequência de ADN de HP-NAP de H. pylori 26695 estirpe como descrito anteriormente ^16. Prepare os plasmídeos contendo a sequência de ADN de HP-NAP com as mutações pontuais desejadas como descrito (ver protocolo, passo 8).
2. Transformar 10 ng dos plasmídeos de DNA acima referidas em E. coli BL21 (DE3) células competentes por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C, as células raia no caldo de lisogenia (LB) agar contendo 50 ug / ml de canamicina, e incubar as placas a 37 ° C durante 16 horas.
3. Inocular colónias individuais em tubos individuais contendo 5 ml de caldo de LB com 50 ug / ml de canamicina e crescem-los como pré-culturas em três7 ° C durante 16 horas com agitação a 170 rpm.
4. Inocular 2 ml de células de pré-cultura acima em 200 ml de caldo LB contendo 50 ug / ml de canamicina num balão de 1 L. Incubar o balão de cultura inoculado a 37 ° C durante 2 horas com agitação a 170 rpm até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 0,4-0,5 detectado por um UV / VIS.
5. Adicionar 80 ul de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura acima, para uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão de HP-NAP. Incubar a cultura durante 3 h até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 1,6-1,7.
6. Centrifugar as células a 6000 xg, a 4 ° C durante 15 minutos para remover o sobrenadante. Armazenar o sedimento de células à temperatura de -70 ° C até à purificação.

2. Preparação da fracção de proteína solúvel contendo HP-NAP

Nota: Todos os passos seguintes são realizados a 4 ° C.

1. Ressuspender 50 ml da célula pEllet preparado no protocolo passo 1.6 em 20 mL de Tris-HCl a 20, pH 9,0, NaCl 50 mM contendo 0,13 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM de N-alf a-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK), e 0,03 mM de N-tosil-L-f enilalaninil-clorometilcetona (TPCK), a 4 ° C como previamente descrito ^16.
2. À dissociação das células das bactérias fazendo passar a suspensão bacteriana por meio de um homogeneizador de alta pressão operado a uma gama de 15.000 a 20.000 psi durante 7 vezes a 4 ° C.
3. Centrifugar o lisado celular a 30000 x g a 4 ° C durante 1 h para separar as fracções proteicas solúveis e insolúveis usando uma ultracentrífuga. Transferir o sobrenadante como a fracção de proteína solúvel para uma proveta.
4. Medir a concentração de proteína da fracção da proteína solúvel pelo método de Bradford, utilizando um kit comercial, com albumina de soro de bovino (ASB) como o padrão de acordo com as instruções do fabricante.
5. Adicionar 177,6 mL de HCl 1 N em 20 ml de the fracção de proteína solúvel obtida a partir de 2,3 protocolo passo para ajustar o valor de pH a partir de pH 9,0 para pH 8,0.
6. Adicionar Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à solução de proteína acima para fazer a concentração de proteína final seja 0,5 mg / ml.

3. A purificação do recombinante HP-NAP a partir de E. coli por Cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas de permuta iónica

1. Preparar 15 ml de resinas DEAE.
   1. Pesar 0,6 g de pó seco de resinas DEAE e suspendê-lo em 30 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à temperatura ambiente durante pelo menos 1 dia.
   2. Centrifugar a resina a 10.000 x g a 4 ° C durante 1 min.
   3. Retirar e descartar o sobrenadante.
   4. Adicionar 15 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM.
   5. Repita os passos Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 quatro vezes mais.
   6. Armazenar as 15 ml de resina assente (pasta a 50% em 30 ml de tampão de Tris) a 4 ° C para utilização subsequente.
      Nota: Todo o passo seguintes são realizados a 4 ° C.
2. Adicionar 45 ml de as proteínas solúveis preparadas de protocolo passo 2,6-15 ml da resina e agita-se a pasta de proteína / resina com um agitador magnético a 4 ° C durante 1 h.
3. Verter a pasta de proteína / resina para uma coluna de plástico ou de vidro equipado com uma torneira de passagem. Permitir que a resina se contentar por gravidade.
4. Abrir a torneira para permitir que a solução de proteína para correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção não ligada, que contém o HP-NAP purificada.
5. Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 50 mM para a coluna.
6. Abrir a torneira para permitir que o tampão de lavagem para ser executado através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de lavagem.
7. Repita Protocolo passos 3.5 a 3.6 mais quatro vezes para recolher as fracções de lavagem adicionais.
8. Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 1 M em uma coluna.
9. Abrir a torneira para permitir que o tampão de eluição de correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de eluição.
10. Repita os passos Protocolo de 3.8 a 3.9 mais quatro vezes para recolher as fracções de eluição adicionais.

4. Tampão do Exchange e endotoxina remoção do HP-NAP purificado por cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas

Nota: O purificada HP-NAP expressa em E. coli tem de ser sujeita a troca de tampão e a remoção de endotoxina antes de estimular os neutrófilos.

1. Executar a diálise para mudar o tampão do HP-NAP purificada a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C utilizando tubo de diálise com corte de peso molecular de 14 kDa, tal como previamente descrito ^24.
2. Filtrar a HP-NAP dialisada através de uma syringe filtro com uma membrana carregada positivamente, hidrófila ligada a uma seringa descartável de 20 ml com caudais que vão de 2,5 a 4 ml / minuto a 4 ° C para remover a endotoxina.

5. Caracterização das propriedades moleculares do Purificada Recombinante HP-NAP por Sodium Dodecyl de poliacrilamida eletroforese em gel (SDS-PAGE), Western Blot, Native-PAGE, Gel Filtration Chromatography, e Dicroísmo Circular Spectroscopy

1. Analisar o HP-NAP recombinante purificada por SDS-PAGE e Western blotting com sobrenadantes de cultura de hibridoma contendo anticorpo monoclonal de rato MAb 16F4 ²⁵ como previamente descrito ^24.
2. Analisar o HP-NAP purificada por PAGE nativa e cromatografia de filtração em gel para examinar o seu estado oligomérico como descrito anteriormente ^26.
3. Analisar o recombinante HP-NAP purificada por espectroscopia de dicroísmo circular para examinar a sua estrutura secundária, como anteriormente descrito ^26.

6. Avaliação da Pureza de HP-NAP por coloração com prata de um gel de SDS-PAGE

1. Preparar a solução de fixação, solução, solução de prata, a solução de desenvolvimento de sensibilização, solução de paragem, e a solução de lavagem de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata.
2. Realização da coloração de prata de um gel de SDS-PAGE de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata.
3. Obter a imagem do gel com um sistema de imagem.

7. Medição de ROS produção a partir de neutrófilos induzida por HP-NAP

1. Isolar os neutrófilos humanos a partir de sangue humano heparinizado por sedimentação de dextrano seguido por centrifugação em gradiente de densidade, como previamente descrito ^24.
2. Medição da produção de ROS por neutrófilos estimulados com HP-NAP usando um ensaio de quimioluminescência dependente de luminol.
   1. Ligar um leitor de placas e ajustar a temperatura a 37 ° C. coloque umplaca vazia de fundo plano de 96 poços branca dentro da câmara de leitor de placas, permitindo-a aquecer até 37 ° C.
   2. Preparar as misturas de estímulo em D-PBS, pH 7,2, contendo 0,9 mM de CaCl _2, MgCl ₂ 0,5, e 13,3 uM de 5-amino-2,3-di-hidro-1,4-phthalazinedione (luminol), com a presença e ausência de 0,67 mM removido-endotoxina HP-NAP preparada a partir de protocolo passo 4.2.
   3. Ajustar a concentração de neutrófilos humanos preparados a partir de protocolo passo 7.1 a 2 x 10 ⁶ células / ml em D-PBS, pH 7,2, contendo 5 mM de glucose.
   4. Adicionar 50 ul de suspensão de neutrófilos em cada cavidade de 96 poços enquanto o prato.
   5. Adicionar 150 ul das misturas preparadas a partir de estímulo Protocolo passo 7.2.2 em neutrófilos bem contendo em um intervalo de tempo de 5 segundos por poço.
   6. Medir a emissão da quimioluminescência durante 5 segundos por poço durante um período de três horas, utilizando um leitor de placas.

8.Construção de DNA plasmídeos contendo HP-NAP Mutantes por Polymerase Chain Reaction (PCR) à base de mutagênese Site-direta

Nota: mutagénese sítio-directa baseada em PCR foi gerado, basicamente, como descrito anteriormente ^27, excepto que os locais de restrição "silenciosas" foram introduzidas para os iniciadores de mutagénese por mutagénese dirigida (SDM) de software -assist ^28.

1. Realizar a reacção de PCR.
   1. Adiciona-se 10 ng de plasmídeo pET42a-PNA, 1 | iM de pares iniciadores de mutagénese listados na Tabela 1, 200 uM de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), e 3 unidades de alta fidelidade-PCR mistura de enzima para um tubo de PCR contendo água desionizada, dando uma última volume de 25 ul.
   2. Iniciar os ciclos de PCR a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturar o ADN modelo, e seguir com 12 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 1 minuto, a T _{m nenhum} -5 ° C durante 1 minuto, e 72 ^° C durante 6 min.
   3. Terminar os ciclos de PCR comum passo de recozimento a T _{m pp} -5 ^° C durante 1 minuto e um passo de extensão a 72 ° C durante 30 min.
2. Tratar 15 ul do produto de PCR com 0,4 ul de enzima de restrição Dpnl a 37 ° C durante 2 h e, em seguida, analisar 2 uL do produto de PCR Dpnl-tratada por electroforese em gel de agarose.
3. mutantes tela.
   1. Transformar 2 uL do produto de PCR em E. coli DH5a células competentes por choque térmico para 45 seg a 42 ° C.
   2. Espalhe as células transformadas em uma placa de LB contendo 50 ug / ml de canamicina e Incubar a placa a 37 ° C durante 16 horas.
   3. Isolar o ADN plasmídico a partir das colónias bacterianas utilizando um kit comercial de lise alcalina de acordo com o protocolo do fabricante.
   4. Tratar o DNA de plasmídeo isolado no passo 8.3.3 Protocolo com a enzima de restrição Xhol para verificar a presença das mutações silenciosas desejado de acordo com o protocolo do fabricante.
   5. sequência doDNA do plasmídeo verificada por passo 8.3.4 Protocolo com o iniciador do promotor de T7 para confirmar a correcção das sequências de codificação mutantes de HP-NAP de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

O diagrama esquemático do processo experimental de purificação negativa recombinante de HP-NAP expressa em E. coli, usando resinas de permuta iónica em DEAE em modo de lote é mostrado na Figura 1. Esta técnica de purificação é baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP na sua forma nativa são recuperados a partir da fracção não...

Discussão

A cromatografia em lote modo negativo com resinas de permuta aniónica DEAE aqui apresentado é adequado para a purificação do recombinante HP-NAP sobre-expressos em E. coli. Os valores dos tampões utilizados nos passos de lise de células e purificação de pH são muito crítica para assegurar a solubilidade de HP-PNA em E. Os lisados ​​de E. coli e a separação eficiente de recombinante HP-NAP a partir de impurezas da célula hospedeira, respectivamente. As células bacterianas lisa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
pET42a-NAP	N/A	N/A	prepared as described in Supplementary data of Refernce 15  http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)	Thermo Fisher Scientific Inc	C6000-03	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin	Amresco	25389-94-0	http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	MD Biomedical Inc	101-367-93-1	http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	10837091001	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)	Sigma-Aldrich	T7254	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)	Sigma-Aldrich	T4376	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	P5619	a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form	Sigma-Aldrich	A25120	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing	Spectrum Laboratories	132720	with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane	Pall	MSTG25E3	for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4	N/A	N/A	raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare Life Sciences	28989335	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein	GE Healthcare Life Sciences	17-1150-01	http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17-1440-02	for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate	Thermo Fisher Scientific Inc	236108	http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system	Sigma-Aldrich	11681834001	source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I	New England Biolabs	R0176S	https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I	New England Biolabs	R0146S	https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α	Thermo Fisher Scientific Inc	18265-017	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name	Company	Product Number	Comments
Equipment
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer	Hitachi	N/A	out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer	Avestin Inc	C315320	http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge	Hitachi Koki Co	90106401	for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC	GE Healthcare Life Sciences	18-1900-26	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer	Aviv Biomedical	N/A	out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system	Fujifilm	N/A	discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter	Perkin-Elmer	1420-018	for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018