Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em&gt; Хеликобактерной</em&gt; Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; В пакетном режиме

Высокий метод доходности для одностадийного отрицательной очистки рекомбинантного Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP) суперэкспрессированный в кишечной палочки с помощью диэтиламиноэтиловыми смол в пакетном режиме описана. HP-NAP очищают с помощью этого метода является полезным для разработки вакцин, лекарств, или для диагностики H. пилори -associated заболеваний.

Аннотация

Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (НР-NAP) является одним из основных факторов вирулентности Helicobacter Pylori (H.). Он играет важную роль в H. пилори индуцированный воспаление желудка путем активации нескольких врожденных лейкоциты , включая нейтрофилы, моноциты, и тучных клеток. Иммуногенные и иммуномодулирующие свойства HP-NAP делают его потенциальной диагностики и вакцины кандидат на H. пилори и новый кандидат препарат для лечения рака. Для того чтобы получить значительные количества очищенного HP-NAP, используемой для его клинического применения, является эффективным способом, чтобы очистить этот белок с высоким выходом и чистотой должна быть установлена.

В этом протоколе, мы описали метод одностадийного отрицательной хроматографической очистки рекомбинантного HP-NAP избыточная экспрессия Escherichia coli (E.coli) с помощью диэтиламиноэтил (DEAE) ионообменной смолы (например., Колонки Sephadex) Iп пакетном режиме. Рекомбинантный НР-NAP составляет почти 70% от общего количества белка в E. палочка и почти полностью восстановилась в растворимой фракции после лизиса клеток при рН 9,0. При оптимальном состоянии при рН 8,0, большинство HP-NAP восстанавливается в несвязанной фракции в то время как эндогенные белки из E. палочка эффективно удаляются с помощью смолы.

Этот метод очистки с использованием отрицательной пакетном режиме хроматографии с DEAE ионообменных смол дает функциональную HP ворсом из E. палочки в своей нативной форме с высоким выходом и чистотой. Очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Введение

Helicobacter Pylori (H.) является основной причиной гастрита и язвенной болезни. Эта бактерия также классифицируется как канцероген в организме человека Международным агентством по изучению рака, часть Всемирной организации здравоохранения, в 1994 году было подсчитано , что распространенность H. инфекции пилори составляет 70% в развивающихся странах и на 30-40% в промышленно развитых странах ^1. Даже при том , что уровень инфицированности H. пилори снижается в промышленно развитых странах, уровень инфицированности H. пилори в развивающихся странах по - прежнему высок ^2. Стандартное лечение искоренить H. Инфекция пилори состоит из введения ингибитора протонной помпы, ИПП и двух антибиотиков, кларитромицин плюс амоксициллин или метронидазол ^3. Тем не менее, повышение резистентности к антибиотикам у H. пилори терапия язвенной болезни о связанных настоятельно призывает к разработке новых стратегий по предотвращению Oг вылечить инфекцию. Разработка профилактических и / или терапевтической вакцинации против H. пилори может обеспечить альтернативный подход к контролю H. пилори инфекции.

Хеликобактерной активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP), одним из основных факторов вирулентности пилори H, был впервые выявлен в водных экстрактов H. пилори с возможностью активировать нейтрофилы придерживаться эндотелиальных клеток и производят активные формы кислорода (ROS) ^4. Нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки желудка обнаружено в H. pylori- инфицированных пациентов с активным гастритом может привести к воспалению и повреждению тканей желудка. Таким образом, НР-NAP может играть патологическую роль при активации нейтрофилов , чтобы вызвать воспаление желудка, которое вызывает дальнейшее язву или Н. пилори -associated заболеваний желудка. Тем не менее, НР-NAP является потенциальным кандидатом для клинического применения ^5,6. В связи с иммуногенной и иммуномодулирующим проperties НР-NAP, этот белок может быть использован для разработки вакцин, терапевтических средств и диагностических инструментов. Клиническое исследование было проведено с использованием рекомбинантного для HP-NAP в качестве одного из компонентов белковой вакцины против H. пилори. Эта вакцина состоит из рекомбинантного HP-NAP, цитотоксин-ассоциированный ген (CagA) и вакуолизирующий цитотоксин А (VacA) белков , сформулированного с гидроксидом алюминия и далее было показано , что безопасность и иммуногенность у человека ^7. Кроме того , НР-NAP действует как мощный иммуномодулятор , чтобы вызвать Т - хелперов типа 1 (Th1) -поляризованым иммунные ответы для лечения рака ⁸ и вниз регулировать Th2-опосредованные иммунные реакции , индуцируемые аллергических реакций и паразитарных инфекций ^9,10. Что касается диагностики, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , был применен для выявления антител сыворотки против HP-NAP в H. пилори -infected пациентов ^11. Одно исследование показало , что уровень HP-NAP-специфических антител в сыворотке крови от H. PYLori -infected пациентов с раком желудка была достоверно выше , чем у пациентов с хроническим гастритом ^12. Другое исследование также показало , что сывороточные антитела против HP-NAP связаны с наличием не-кардии аденокарциномы желудка ^13. Таким образом, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , может быть применен для определения сывороточных антител против HP-NAP для прогноза рака желудка в H. пилори -infected пациентов. Взятые вместе, очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Среди нескольких методов , используемых для очистки рекомбинантного HP-NAP выражается в Escherichia coli (E.coli) в своей нативной форме сообщалось до сих пор, необходим второй этап очистки с участием гель-фильтрационной хроматографии с получением высокочистого НР-NAP ^14-16 , При этом способ с использованием негативного режима пакетной хроматографии сдиэтиламиноэтил (DEAE) ионообменные смолы описана для очистки HP-NAP сверхэкспрессируется в E. палочка с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Этот метод очистки был основан на связывании белков клетки-хозяина и / или других, чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков, кроме HP-NAP извлекают из несвязанной фракции. Такая очистка подход с использованием DEAE ионообменной хроматографии в отрицательном режиме проста и экономии, позволяя очистку рекомбинантного HP-NAP с помощью одностадийной хроматографии путем сбора несвязанной фракции времени. В дополнение к HP-NAP, несколько других биомолекул, таких как вирусы ^17, иммуноглобулин G (IgG) , ^18, гемоглобин ^19, протеинфосфатазы ^20, и фактор вирулентности флагеллином ^21, также , как сообщалось, очищают с помощью ионообменной хроматографии в негативном Режим. Отрицательный режим является предпочтительным для ионообменной хроматографии, если примеси являются незначительнымикомпоненты , присутствующие в образце , подвергнутого быть очищено ^22. Применение отрицательной хроматографии в очистки природных или рекомбинантных биомолекул был недавно рассмотрен ^23.

В настоящем докладе дается шаг за шагом протокола для экспрессии рекомбинантного HP-NAP в E. палочка, лизис клеток и очистки HP-NAP с использованием негативного режима пакетной хроматографии с DEAE ионообменных смол. Если белок желательно для очистки пригоден для ионообменной хроматографии в отрицательном режиме, описанный протокол также может быть адаптирована в качестве отправной точки для разработки способа очистки.

протокол

Человеческая кровь собирали у здоровых добровольцев с предварительного письменного информированного согласия и одобрения Совета по институциональному обзору Национального университета Цинхуа, Синьчжу, Тайвань.

1. Экспрессия рекомбинантных HP-NAP в E. палочки

Приготовьте плазмиду pET42a-NAP , содержащую последовательность ДНК HP-NAP от H. пилори 26695 штамма , как описано выше ^16. Подготовьте плазмиды, содержащие последовательность ДНК HP-NAP с желаемыми точечных мутаций, как описано (см протокол, этап 8).
Преобразование 10 нг вышеуказанных плазмид ДНК в E. палочка BL21 (DE3) компетентные клетки теплового шока в течение 45 секунд при 42 ° С, полоса клетки на лизогении бульона (LB) агаром , содержащих 50 мкг / мл канамицина, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение 16 часов.
Инокулируйте единичные колонии в отдельные пробирки, содержащие 5 мл LB бульона из 50 мкг / мл канамицина, и выращивают их в качестве предварительных культивирований в 37 ° С в течение 16 часов при встряхивании со скоростью 170 оборотов в минуту.
Инокулируйте 2 мл вышеназванного клеток предварительной культуры в 200 мл LB бульона, содержащего 50 мкг / мл канамицина, в колбу емкостью 1 л. Выдержите привит культуры колбы при 37 ° С в течение 2 ч при встряхивании при 170 оборотах в минуту, пока поглощение при 600 нм не достигнет приблизительно 0.4-0.5 детектируется УФ / ВИД спектрофотометр.
Добавляют 80 мкл 1 М изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в указанную выше культуру до конечной концентрации 0,4 мМ, чтобы индуцировать экспрессию HP-NAP. Инкубируйте культуру в течение 3 часов, пока поглощение при 600 нм не достигает приблизительно 1,6-1,7.
Центрифуга клетки при 6000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин, чтобы удалить надосадочную жидкость. Хранить осадок клеток при -70 ° С до очистки.

2. Приготовление фракции растворимого белка, содержащего HP-NAP

Примечание: Все следующие шаги выполняются при температуре 4 ° С.

Ресуспендируют в 50 мл клеточной рellet подготовлен в Протоколе стадии 1.6, в 20 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 9,0, 50 мМ NaCl, содержащего 0,13 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), 0,03 мМ N-альфа-тозил-L-лизинильных-chloromethylketone (TLCK) и 0,03 мМ N-тозил-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (ТРСК) при температуре 4 ° С , как описано ранее ^16.
Разрушени клеток бактерий путем прохождения бактериальной суспензии через гомогенизатор высокого давления, работающие в диапазоне от 15000 до 20000 фунтов на квадратный дюйм в течение 7 раз при 4 ° С.
Центрифуга Клеточный лизат при 30000 х г при температуре 4 ° С в течение 1 часа, чтобы отделить растворимые и нерастворимые фракции белков с помощью ультрацентрифуге. Передача супернатант в качестве фракции растворимого белка в стакан.
Измерение концентрации белка в растворимой фракции белка по методу Бредфорда с использованием коммерческого набора с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в качестве стандарта в соответствии с инструкциями изготовителя.
Добавить 177,6 мкл 1 N HCl в 20 мл йе фракцию растворимого белка, полученный из протокола стадии 2.3, чтобы регулировать его значение рН от рН 9,0 до рН 8,0.
Добавить 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, к указанному выше раствору белка с приведением конечной концентрации белка в 0,5 мг / мл.

3. Очистка рекомбинантного HP-NAP из E. палочки отрицательным Пакетный режим хроматографии с DEAE ионообменных смолах

Приготовьте 15 мл ДЭАЭ смол.
1. Взвешивают 0,6 г сухого порошка ДЭАЭ смол и подвесить его в 30 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 день.
2. Центрифуга смолы при 10000 х г при температуре 4 ° С в течение 1 мин.
3. Удалите и отбросить супернатант.
4. Добавьте 15 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl.
5. Повторите шаги 3.1.2 Протокол 3.1.4 четыре раза больше.
6. Хранить в 15 мл смолы (обосновались 50% суспензии в 30 мл Трис-буфер) при 4 ° С для последующего использования.
  Примечание: Все на следующей стадииs проводят при температуре 4 ° С.
Добавить 45 мл растворимых белков, полученных в стадии протокола от 2,6 до 15 мл смолы и приготовленную суспензию белка / смолы с магнитной мешалкой при температуре 4 ° С в течение 1 часа.
Налить шлам белковый / смолы в колонку с пластиковой или стеклянной, снабженной запорным краном. Дайте смолу селиться под действием силы тяжести.
Откройте запорный кран, чтобы позволить раствору белка бежать через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Соберите проточного как несвязанной фракции, которая содержит очищенный HP-NAP.
Добавьте 15 мл охлажденного льдом 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl в колонку.
Откройте запорный кран, чтобы позволить промывочный буфер для запуска через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Собирают Проточный в качестве промывного фракции.
Повторите шаги Протокол от 3,5 до 3,6 раза четыре больше, чтобы собрать дополнительные фракции мыть.
Добавьте 15 мл охлажденного льдом 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 М NaCl в колонну.
Откройте запорный кран, чтобы позволить элюирующий буфер для запуска через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Соберите проточного как элюирования фракции.
Повторите шаги Протокол от 3,8 до 3,9 раза четыре больше, чтобы собрать дополнительные фракции элюирования.

4. Буфер обмена и эндотоксина Удаление HP-NAP Очищают Negative Пакетный режим хроматографии с DEAE Смолы

Примечание: Очищенный НР-NAP экспрессируется в E. палочка должна быть подвергнута буфер обмена и удаление эндотоксина до начала стимуляции нейтрофилов.

Выполните диализ , чтобы изменить буфер очищенного HP-NAP в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (D-PBS), рН 7,2, при 4 ° С с использованием диализных трубок с пропускания по молекулярному весу 14 кДа , как описано ранее ^24.
Фильтр диализуют HP-NAP через syringе фильтр с положительно заряженной гидрофильной мембраны, прикрепленной к 20 мл одноразового шприца при скорости потока в пределах от 2,5 до 4 мл / мин при 4 ° С для удаления эндотоксина.

5. Определение характеристик молекулярных свойств очищенным рекомбинантным HP-NAP с помощью додецилсульфата натрия-электрофорезом на геле полиакриламида (SDS-PAGE), вестерн-блоттинга, Native-PAGE, гель-фильтрационная хроматография, кругового дихроизма спектроскопии

Анализ очищенного рекомбинантного HP-NAP с помощью SDS-PAGE и вестерн - блоттинга с гибридомной культуры надосадочную жидкость , содержащую моноклональное антитело мыши MAb 16F4 ²⁵ , как описано выше ^24.
Анализ очищенного HP-NAP нативным-PAGE и гель - фильтрационной хроматографии с целью изучения его олигомерного состояния , как описано выше ^26.
Анализ очищенного рекомбинантного HP-NAP с помощью спектроскопии кругового дихроизма для изучения его вторичную структуру , как описано выше ^26.

6. Оценка чистоты HP-NAP серебром окрашиванием геля SDS-PAGE

Подготовить Фиксирующий раствор, сенсибилизации раствор, раствор серебра, разработка решения, стоп-раствор и промывочный раствор в соответствии с инструкцией изготовителя набора для окрашивания серебром.
Выполните серебряное окрашивание геля SDS-PAGE в соответствии с инструкцией изготовителя набора для окрашивания серебром.
Приобретать изображение геля с системой визуализации.

7. Измерение РОС производства нейтрофилами, индуцированный HP-NAP

Изолировать нейтрофилов человека из гепаринизированной крови человека путем осаждени с применением декстрана с последующим центрифугированием в градиенте плотности , как описано выше ^24.
Измерение производства ROS из нейтрофилов, стимулированных HP-NAP с помощью люминолзависимой хемилюминесценции анализа.
1. Включите планшет-ридере и установить температуру при 37 ° С. Разместитьпустой плоское дно 96-луночного белая пластина внутри пластины считывания камеры, позволяя ей нагреваться до 37 ° С.
2. Готовят Стимул смеси в D-PBS, рН 7,2, содержащего 0,9 мМ CaCl _2, 0,5 мМ MgCl _2, и 13,3 мкМ 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион (люминол) с наличием и отсутствием 0,67 мкМ эндотоксинов удаляют HP-NAP, полученного из протокола шага 4.2.
3. Регулировка концентрации нейтрофилах человека , приготовленных из протокола шага от 7,1 до 2 × 10 ⁶ клеток / мл в D-PBS, рН 7,2, содержащем 5 мМ глюкозы.
4. Добавляют 50 мкл суспензии нейтрофилов в каждую лунку 96-луночного в то время как пластины.
5. Добавьте 150 мкл стимулирующих смесей, приготовленных из протокола этапа 7.2.2 в лунку, содержащую нейтрофилы в интервале времени 5 секунд на каждую лунку.
6. Измерьте излучение хемилюминесценции в течение 5 сек на лунку в течение в течение трех часов с использованием планшет-ридера.

8.Конструирование ДНК плазмид укрывательство HP-NAP Мутанты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) основе сайта-прямой мутагенеза

Примечание: ПЦР-сайт-прямой мутагенез был создан в основном , как описано ранее ²⁷ за исключением того, что "молчащие" сайты рестрикции были введены мутагенеза праймеров с помощью сайт-направленного мутагенеза (SDM) -assist программного обеспечения ^28.

Выполнение реакции ПЦР.
1. Добавляют 10 нг плазмиды pET42a-NAP, 1 мкМ пар праймеров мутагенеза , перечисленных в Таблице 1, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатами (дНТФ), и 3 единицы с высокой точностью воспроизведения смеси ферментов ПЦР в ПЦР - пробирку , содержащие деионизированную воду, давая окончательное объем 25 мкл.
2. Инициировать циклов ПЦР при 95 Не ° С в течение 10 мин дл денатурации ДНК - матрицы, и следуют с 12 циклов амплификации при 95 ° С в течение 1 минуты, _{Тпл нет} -5 ° С в течение 1 минуты и 72 ^° С в течение 6 мин.
3. Завершите циклы ПЦР сстадию отжига при Т _{м п.п.} -5 ^° С в течение 1 мин и стадию удлинения при 72 ° С в течение 30 мин.
Treat 15 мкл ПЦР-продукта с 0,4 мкл ДПН I рестриктазы при 37 ° С в течение 2 ч, а затем анализируют по 2 мкл ДПШ I-обработанного продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
мутанты экрана.
1. Transform 2 мкл ПЦР - продукта в E. палочки DH5 & компетентные клетки путем теплового шока в течение 45 секунд при 42 ° C.
2. Распространение трансформированных клеток на пластине LB, содержащей 50 мкг / мл канамицина и инкубируйте при 37 ° C в течение 16 часов.
3. Изолировать плазмидной ДНК из бактериальных колоний с использованием коммерческого набора для щелочного лизиса в соответствии с протоколом производителя.
4. Лечить плазмиды ДНК, выделенной в Протоколе стадии 8.3.3 с XhoI ферментом рестрикции, чтобы проверить наличие желаемых молчащих мутаций в соответствии с протоколом производителя.
5. Выстраивание последовательностиДНК плазмиды уточнена шагом протокола 8.3.4 с промотором Т7 праймера, чтобы подтвердить коррекцию кодирующей последовательности мутантов НР-NAP в соответствии с протоколом производителя.

Результаты

Принципиальная схема экспериментальной процедуры отрицательной очистки рекомбинантного HP-NAP экспрессируется в E. палочка с использованием DEAE ионообменных смол в пакетном режиме, показан на рисунке 1. Этот метод очистки основан на связывании белков клет...

Обсуждение

Отрицательный пакетный режим хроматографии с DEAE анионитов , представленные здесь подходит для очистки рекомбинантного HP-NAP сверхэкспрессируется в E палочки. Значения рН буферов , используемых на стадиях лизиса клеток и очистки очень важно для обеспечения растворимости HP-NAP в E. п...

Раскрытие информации

HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

Благодарности

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
pET42a-NAP	N/A	N/A	prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)	Thermo Fisher Scientific Inc	C6000-03	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin	Amresco	25389-94-0	http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	MD Biomedical Inc	101-367-93-1	http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	10837091001	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)	Sigma-Aldrich	T7254	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)	Sigma-Aldrich	T4376	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	P5619	a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex A-25 chloride form	Sigma-Aldrich	A25120	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing	Spectrum Laboratories	132720	with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane	Pall	MSTG25E3	for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4	N/A	N/A	raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare Life Sciences	28989335	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein	GE Healthcare Life Sciences	17-1150-01	http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17-1440-02	for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate	Thermo Fisher Scientific Inc	236108	http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand long template PCR system	Sigma-Aldrich	11681834001	source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I	New England Biolabs	R0176S	https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I	New England Biolabs	R0146S	https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α	Thermo Fisher Scientific Inc	18265-017	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name	Company	Product Number	Comments
Equipment
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer	Hitachi	N/A	out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer	Avestin Inc	C315320	http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge	Hitachi Koki Co	90106401	for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC	GE Healthcare Life Sciences	18-1900-26	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer	Aviv Biomedical	N/A	out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system	Fujifilm	N/A	discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter	Perkin-Elmer	1420-018	for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018