Une étape négative de purification chromatographique<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En mode batch

Résumé

Procédé à rendement élevé pour une étape de purification du recombinant négatif Helicobacter pylori protéine d' activation des neutrophiles (HP-NAP) surexprimé dans Escherichia coli en utilisant des résines de diéthylaminoéthyle en mode discontinu est décrit. HP-NAP purifié par cette méthode est bénéfique pour le développement de vaccins, de médicaments ou de diagnostic pour H. pylori -Associated maladies.

Résumé

Helicobacter pylori neutrophiles-activating protein (HP-NAP) est un facteur de virulence majeur de Helicobacter pylori (H. pylori). Elle joue un rôle crucial dans H. pylori gastrique induite par l' inflammation en activant les leucocytes plusieurs innés incluant les neutrophiles, les monocytes et les mastocytes. Les propriétés immunogènes et immunomodulatrices de HP-NAP en font un candidat vaccin potentiel diagnostique et H. pylori et un nouveau candidat médicament pour le traitement du cancer. Afin d'obtenir des quantités importantes de HP-NAP purifié utilisé pour ses applications cliniques, une méthode efficace pour purifier cette protéine avec un rendement élevé et la pureté doit être établie.

Dans ce protocole, nous avons décrit un procédé en une étape négative purification chromatographique de HP-NAP recombinante surexprimée dans Escherichia coli (E. coli) en utilisant diéthylaminoéthyle (DEAE) des résines échangeuses d' ions (par ex., Sephadex®) , ile mode de traitement par lots n. HP-NAP recombinante constitue près de 70% de la protéine totale dans E. coli et est presque entièrement récupérée dans la fraction soluble après lyse cellulaire à un pH de 9,0. Sous la condition optimale à un pH de 8,0, la majorité des HP-NAP est récupéré dans la fraction non liée , tandis que les protéines endogènes de E. coli sont efficacement éliminés par la résine.

Cette méthode de purification par chromatographie négative par lots de mode avec DEAE résines échangeuses d' ions donne de HP-NAP fonctionnel à partir de E. coli sous sa forme native avec un rendement élevé et de pureté. Le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer.

Introduction

Helicobacter pylori (H. pylori) est une cause majeure de la gastrite et de l' ulcère gastro - duodénal. Cette bactérie a également été classé comme cancérogène chez l' homme par le Centre international de recherche sur le cancer, une partie de l'Organisation mondiale de la Santé, en 1994. Il a été estimé que la prévalence de H. infection pylori est de 70% dans les pays en développement et 30-40% dans les pays industrialisés ^1. Même si le taux de H. infection pylori diminue dans les pays industrialisés, le taux de H. infection pylori dans les pays en développement est encore élevé ^2. Le traitement standard pour l' éradication de H. pylori infection consiste en l'administration d'un inhibiteur de la pompe à protons, IPP et deux antibiotiques, la clarithromycine ou le métronidazole et amoxicilline ^3. Toutefois, l'augmentation de la résistance aux antibiotiques chez H. pylori la PI thérapie de l' ulcère exhorte le développement de nouvelles stratégies pour prévenir or guérir l'infection. Développement de la vaccination prophylactique et / ou thérapeutique contre H. pylori pourrait fournir une approche alternative pour contrôler H. infection pylori.

Helicobacter pylori protéine d' activation des neutrophiles (HP-NAP), un facteur de virulence majeur de H pylori, a été identifié dans les extraits d'eau de H. pylori avec la possibilité d'activer les neutrophiles adhérer aux cellules endothéliales et produire des espèces réactives de l' oxygène (ROS) ^4. L' infiltration des neutrophiles de la muqueuse gastrique trouvée dans H. pylori patients infectés par gastrite active peuvent provoquer une inflammation et des dommages aux tissus de l'estomac. Ainsi, HP-NAP peut jouer un rôle pathologique par l' activation des neutrophiles pour induire une inflammation de l' estomac, ce qui provoque en outre l' ulcère ou H. pylori -Associated maladies gastriques. Néanmoins, HP-NAP est un candidat potentiel pour des applications cliniques ^5,6. En raison de la pro immunogène et immunomodulateurspriétés de HP-NAP, cette protéine pourrait être utilisée pour développer des vaccins, des agents thérapeutiques et des outils de diagnostic. Un essai clinique a été mené à l' aide de HP-NAP recombinante comme l' un des composants d'un vaccin contre la protéine H. pylori. Ce vaccin se compose de HP-NAP recombinant associé à la cytotoxine gène A (CagA), et des protéines Une cytotoxine vacuolisante (VacA) formulé avec de l' hydroxyde d'aluminium et il a en outre été démontrée comme étant sans danger et immunogène chez l'être humain ^7. En outre, HP-NAP agit comme un immunomodulateur puissant pour déclencher T auxiliaires de type 1 (Th1) multipolarisé réponses immunitaires pour le traitement du cancer et de ⁸ à réguler à la baisse des réponses immunitaires médiées par Th2 induites par des réactions allergiques et d' infections parasitaires ^9,10. En ce qui concerne le diagnostic recombinant ELISA basé sur HP-NAP a été appliqué pour détecter des anticorps sériques contre la HP-NAP de H. pylori patients infectés par le ^11. Une étude a montré que le niveau d'anticorps spécifiques HP-NAP dans le sérum de H. pylori patients infectés par le cancer gastrique était significativement plus élevé que chez les patients souffrant de gastrite chronique ^12. Une autre étude a également montré que les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP sont associées à la présence de non-cardia ¹³ adénocarcinomes gastriques. Ainsi, recombinant ELISA à base de HP-NAP peut être appliqué pour détecter les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP pour le pronostic du cancer gastrique chez H. pylori patients infectés par l . Pris ensemble, le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer.

Parmi les différentes méthodes utilisées pour la purification de recombinant HP-NAP exprimé dans Escherichia coli (E. coli) sous sa forme native rapporté jusqu'à présent, une chromatographie sur gel de filtration deuxième étape de purification impliquant est nécessaire pour obtenir de haute pureté HP-NAP ^14-16 . Ici, une méthode utilisant la chromatographie négative mode batch avecdiéthylaminoéthyle (DEAE) résines échangeuses d' ions est décrit pour la purification de HP-NAP surexprimé dans E. coli avec un rendement élevé et une grande pureté. Cette technique de purification a été basée sur la liaison des protéines et / ou des impuretés autres que HP-NAP à la résine cellule hôte. A pH 8,0, presque pas d'autres protéines à l'exception de HP-NAP sont récupérés à partir de la fraction non liée. Cette approche de purification utilisant la chromatographie par échange d'ions DEAE en mode négatif est simple et économiser en permettant la purification de HP-NAP recombinante par Chromatographie en une seule étape par la collecte de la fraction non liée du temps. En plus de HP-NAP, plusieurs autres biomolécules, tels que les virus ^17, immunoglobuline G (IgG) ^18, l' hémoglobine ^19, la protéine phosphatase ^20, et le facteur de virulence flagelline ^21, ont également été rapportés d'être purifiée par chromatographie échangeuse d' ions en négatif mode. Le mode négatif est préféré pour la chromatographie échangeuse d'ions, si des impuretés sont mineuresles composants présents dans l'échantillon soumis à purifier ^22. L'application de la chromatographie négative dans la purification de biomolécules naturelles ou recombinantes a été récemment examiné ^23.

Le présent rapport fournit une étape par le protocole d'étape pour l' expression de HP-NAP recombinante dans E. coli, la lyse des cellules et la purification de HP-NAP utilisant une Chromatographie en discontinu en mode négatif par DEAE résines échangeuses d' ions. Si une protéine souhaitée pour la purification est adaptée à la chromatographie d'échange d'ions en mode négatif, le protocole décrit pourrait également être adapté comme point de départ pour le développement d'un procédé de purification.

Protocole

Le sang humain a été recueilli chez des volontaires sains avec le consentement écrit préalable éclairé et l'approbation du Conseil institutionnel d'examen de la National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan.

1. Expression du recombinant HP-NAP dans E. coli

1. Préparer le plasmide pET42a-PNA contenant la séquence d'ADN de la HP-NAP de H. pylori 26695 souche comme décrit précédemment ^16. Préparer les plasmides contenant la séquence d'ADN de la HP-NAP avec les mutations ponctuelles souhaitées telles que décrites (voir protocole, étape 8).
2. Transformer 10 ng des plasmides d'ADN ci - dessus dans E. coli BL21 (DE3) des cellules compétentes par choc thermique pendant 45 secondes à 42 ° C, strie les cellules sur le bouillon de lysogénie (LB) des plaques de gélose contenant 50 pg / ml de kanamycine, et incuber les plaques à 37 ° C pendant 16 heures.
3. Inoculer des colonies isolées dans des tubes individuels contenant 5 ml de bouillon LB avec 50 ug / ml de kanamycine et de croître comme des précultures à 37 ° C pendant 16 heures avec agitation à 170 tours par minute.
4. Inoculer 2 ml des cellules pré-culture ci-dessus dans 200 ml de bouillon LB contenant 50 pg / ml de kanamycine dans un flacon de 1 litre. Incuber le flacon de culture inoculé à 37 ° C pendant 2 heures sous agitation à 170 tours par minute jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteint environ 0,4 à 0,5 détectée par un spectrophotomètre UV / VIS.
5. Ajouter 80 ul de 1 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) à la culture ci-dessus à une concentration finale de 0,4 mM pour induire l'expression de la HP-NAP. Incuber la culture pendant 3 heures jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteint environ 1/6 à 1/7.
6. Centrifuger les cellules à 6000 x g à 4 ° C pendant 15 min pour éliminer le surnageant. Stocker le culot cellulaire à -70 ° C jusqu'à la purification.

2. Préparation de la protéine de la fraction soluble contenant de HP-NAP

Remarque: Toutes les étapes suivantes sont effectuées à 4 ° C.

1. Remettre en suspension 50 ml de la cellule pEllet préparé dans le protocole étape 1.6 dans 20 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 9,0, NaCl 50 mM contenant 0,13 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,03 mM de N-alpha-tosyl-L-lysinyle-chlorométhylcétone (TLCK) et 0,03 mM de N-tosyl-L-phénylalaninyle-chlorométhylcétone (TPCK) à 4 ° C comme décrit précédemment ^16.
2. Rompre les cellules bactériennes en faisant passer la suspension bactérienne à travers un homogénéiseur à haute pression fonctionnant à une gamme de 15 000 à 20 000 psi pendant 7 heures à 4 ° C.
3. Centrifuger le lysat cellulaire à 30 000 x g à 4 ° C pendant 1 heure pour séparer les fractions de protéines solubles et insolubles à l'aide d'une ultracentrifugeuse. Transférer le surnageant comme la fraction protéique soluble dans un bêcher.
4. Mesurer la concentration en protéine de la fraction de protéine soluble par la méthode de Bradford en utilisant un kit commercial avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme étalon, selon les instructions du fabricant.
5. Ajouter 177,6 ul de HCl 1 N dans 20 ml d'ee soluble dans la fraction protéique obtenue à partir de l'étape 2.3 Protocole pour ajuster sa valeur de pH allant de pH 9,0 à pH 8,0.
6. Ajouter 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à la solution de protéine ci-dessus pour obtenir une concentration finale en protéine soit 0,5 mg / ml.

3. La purification du recombinant HP-NAP à partir de E. coli par Chromatographie négative mode batch avec DEAE résines échangeuses d' ions

1. Préparer 15 ml de résines DEAE.
   1. Peser 0,6 g de poudre sèche de résine DEAE et de le suspendre dans 30 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à la température ambiante pendant au moins 1 jour.
   2. Centrifuger la résine à 10.000 x g à 4 ° C pendant 1 min.
   3. Retirer et jeter le surnageant.
   4. Ajouter 15 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM.
   5. Répéter les étapes 3.1.2 Protocole à 3.1.4 quatre fois plus.
   6. Stocker les 15 ml réglées résine (50% suspension dans 30 ml de tampon Tris) à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
      Note: Toutes les étapes suivantess sont effectuées à 4 ° C.
2. Ajouter 45 ml de protéines solubles préparés dans l'étape Protocole de 2,6 à 15 ml de la résine et on agite la suspension de protéine / résine avec un agitateur magnétique à 4 ° C pendant 1 h.
3. Verser la suspension de protéines / résine dans une colonne en matière plastique ou en verre muni d'un robinet d'arrêt. Laisser la résine régler par gravité.
4. Ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre à la solution de protéine à courir à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement de la fraction non liée, qui contient le HP-NAP purifiée.
5. Ajouter 15 ml d'glacé 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM dans la colonne.
6. Ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre au tampon de lavage pour fonctionner à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement comme la fraction de lavage.
7. Répéter les étapes Protocole 3.5 à 3.6 quatre fois plus pour recueillir les fractions de lavage supplémentaires.
8. Ajouter 15 ml d'glacé 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 M de NaCl dans une colonne.
9. Ouvrir le robinet d'arrêt pour permettre au tampon d'élution à courir à travers la colonne par écoulement par gravité jusqu'à ce que le niveau de liquide dans la colonne juste au-dessus de la résine. Recueillir l'écoulement de la fraction d'élution.
10. Répéter les étapes protocole de 3,8 à 3,9 quatre fois plus pour recueillir les fractions d'élution supplémentaires.

4. Buffer Exchange et endotoxines Suppression de HP-NAP Purifié par Chromatographie négative mode batch avec DEAE Résines

Remarque: Le HP-NAP purifiée exprimé dans E. coli doit être soumis à un échange de tampon et l' élimination d'endotoxine avant de stimuler neutrophiles.

1. Effectuer une dialyse pour changer le tampon du HP-NAP purifiée pour tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, à 4 ° C en utilisant un tube de dialyse à coupure de poids moléculaire de 14 kDa tel que décrit précédemment ^24.
2. Filtrer le HP-NAP dialysée à travers une seringueFiltre électronique avec une charge positive, d'une membrane hydrophile fixée à une seringue jetable de 20 ml à des débits allant de 2,5 à 4 ml / minute à 4 ° C pour éliminer l'endotoxine.

5. Caractérisation des propriétés moléculaires de la recombinante purifiée HP-NAP par dodécylsulfate de sodium-gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), Western blot, Native-PAGE, Gel Filtration Chromatographie et dichroïsme circulaire Spectroscopy

1. Analyser le HP-NAP recombinante purifiée par SDS-PAGE et transfert de Western avec des surnageants de culture d'hybridomes contenant un anticorps monoclonal de souris MAb ²⁵ 16F4 ²⁴ comme décrit précédemment.
2. Analyser le HP-NAP a été purifié par PAGE natif et la Chromatographie par filtration sur gel pour examiner son état ​​oligomère tel que décrit précédemment ^26.
3. Analyser le HP-NAP recombinante purifiée par spectroscopie de dichroïsme circulaire pour examiner sa structure secondaire comme décrit précédemment ^26.

6. Evaluation de la pureté de la HP-NAP par coloration à l'argent d'un gel SDS-PAGE

1. Préparer la solution de fixation, solution, solution d'argent, solution de développement sensibilisation, la solution d'arrêt, et une solution de lavage selon les instructions d'un kit de coloration à l'argent du fabricant.
2. Effectuer coloration à l'argent d'un gel SDS-PAGE selon les instructions d'un kit de coloration à l'argent du fabricant.
3. Acquérir l'image du gel avec un système d'imagerie.

7. Mesure de la production d'ERO induite par les neutrophiles par HP-NAP

1. Isoler neutrophiles humains à partir de sang hépariné humain par sédimentation dextran suivi par gradient de densité centrifugation comme décrit précédemment ^24.
2. Mesure de la production de radicaux libres à partir de neutrophiles stimulés avec HP-NAP à l'aide d'un dosage de chimioluminescence luminol-dépendante.
   1. Tourner sur un lecteur de plaque et régler la température à 37 ° C. Placer unevide fond plat plaque de 96 puits blanche à l'intérieur de la chambre de lecteur de plaque, ce qui lui permet de se réchauffer à 37 ° C.
   2. Préparer les mélanges de stimulation dans le D-PBS, pH 7,2, contenant 0,9 mM de _CaCl2, 0,5 mM de _MgCl2 et 13,3 pM de 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione (luminol) avec la présence et l' absence de 0,67 uM endotoxine retirée HP-NAP préparé à partir de l'étape 4.2 Protocole.
   3. Ajuster la concentration en neutrophiles humains préparés à partir de protocole étape 7.1 à 2 x 10 ⁶ cellules / ml dans du D-PBS, pH 7,2, contenant 5 mM de glucose.
   4. Ajouter 50 pl de neutrophiles suspension dans chaque puits de la plaque de 96 puits tout.
   5. Ajouter 150 pi des mélanges de relance préparés à partir de protocole étape 7.2.2 dans les neutrophiles et contenant à un intervalle de temps de 5 secondes par puits.
   6. Mesurer l'émission de la chimioluminescence pendant 5 secondes par puits sur une période de trois heures en utilisant un lecteur de plaque.

8.Construction d'ADN Plasmides hébergeant HP-NAP Mutants par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à base de mutagenèse directe

Remarque: la mutagénèse site direct à base de PCR a été généré essentiellement ²⁷ comme décrit précédemment , sauf que les sites de restriction "silencieuses" ont été introduits dans les amorces de mutagenèse par une mutagenèse dirigée (SDM) logiciel -aider ^28.

1. Effectuer la réaction PCR.
   1. Ajouter 10 ng du plasmide pET42a-PNA, 1 uM de mutagénèse paires d'amorces énumérées dans le tableau 1, 200 uM de désoxynucléosides triphosphates (dNTP), et 3 unités de haute fidélité par PCR mélange d' enzymes dans un tube PCR contenant de l' eau déminéralisée, ce qui donne une finale volume de 25 ul.
   2. Initier les cycles de PCR à 95 ° C pendant 10 minutes pour dénaturer l'ADN matrice, et suivre avec 12 cycles d'amplification à 95 ° C pendant 1 minute, T _{m pas} -5 ° C pendant 1 minute, et 72 ^° C pendant 6 min.
   3. Terminer les cycles de PCR avecune étape de recuit à T _{m p} -5 ^° C pendant 1 minute et une étape d'extension à 72 ° C pendant 30 min.
2. Traiter 15 ul du produit de PCR avec 0,4 ul d'Dpn I enzyme de restriction à 37 ° C pendant 2 heures, puis on analyse 2 ul du produit de PCR Dpn I traité par électrophorèse sur gel d'agarose.
3. mutants d'écran.
   1. Transformer 2 ul du produit de PCR dans E. coli DH5a cellules compétentes par choc thermique pendant 45 sec à 42 ° C.
   2. Répartir les cellules transformées sur une plaque LB contenant 50 pg / ml de kanamycine et incuber la plaque à 37 ° C pendant 16 heures.
   3. Isoler l'ADN de plasmide à partir des colonies bactériennes en utilisant un kit commercial de la lyse alcaline selon le protocole du fabricant.
   4. Traiter l'ADN de plasmide isolé dans l'étape 8.3.3 Protocole avec l'enzyme de restriction Xhol pour vérifier la présence des mutations silencieuses souhaitées selon le protocole du fabricant.
   5. séquence dul'ADN plasmidique a vérifié par l'étape 8.3.4 Protocole avec l'amorce promoteur T7 pour confirmer la correction des séquences codantes des mutants HP-NAP selon le protocole du fabricant.

Résultats

Le schéma de principe du mode opératoire de purification négative de HP-NAP recombinante exprimée dans E. coli en utilisant DEAE résines échangeuses d' ions en mode discontinu est représenté sur la figure 1. Cette technique de purification est basée sur la liaison des protéines et / ou des impuretés autres que HP-NAP à la résine cellule hôte. A pH 8,0, presque pas d' autres protéines à l' exception de HP-NAP sous sa forme native sont ...

Discussion

La Chromatographie discontinue en mode négatif par DEAE résines échangeuses d' anions présenté ici est approprié pour la purification de HP-NAP recombinante surexprimée dans E. coli. Les valeurs de pH des tampons utilisés dans les étapes de lyse des cellules et la purification sont très critiques pour assurer la solubilité du HP-NAP dans E. Les lysats coli et une séparation efficace de HP-NAP recombinante à partir d' impuretés de cellules hôtes, respectivement. Les cellu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
pET42a-NAP	N/A	N/A	prepared as described in Supplementary data of Refernce 15  http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)	Thermo Fisher Scientific Inc	C6000-03	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
Kanamycin	Amresco	25389-94-0	http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	MD Biomedical Inc	101-367-93-1	http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	10837091001	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW
N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)	Sigma-Aldrich	T7254	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW
N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)	Sigma-Aldrich	T4376	protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW
Protein standard (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	P5619	a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW
DEAE–Sephadex  A-25 chloride form	Sigma-Aldrich	A25120	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW
Spectrum/Por dialysis tubing	Spectrum Laboratories	132720	with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Acrodisc® units with Mustang® E membrane	Pall	MSTG25E3	for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mouse monoclonal antibody MAb 16F4	N/A	N/A	raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;  A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare Life Sciences	28989335	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
PlusOne silver staining kit, protein	GE Healthcare Life Sciences	17-1150-01	http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17-1440-02	for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002
Flat bottom 96-well white plate	Thermo Fisher Scientific Inc	236108	http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW
Expand  long template PCR system	Sigma-Aldrich	11681834001	source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW
Dpn I	New England Biolabs	R0176S	https://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho I	New England Biolabs	R0146S	https://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5α	Thermo Fisher Scientific Inc	18265-017	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name	Company	Product Number	Comments
Equipment
U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer	Hitachi	N/A	out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer	Avestin Inc	C315320	http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge	Hitachi Koki Co	90106401	for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
ÄKTA FPLC	GE Healthcare Life Sciences	18-1900-26	for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD spectrophotometer	Aviv Biomedical	N/A	out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php
LAS-3000 imaging system	Fujifilm	N/A	discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter	Perkin-Elmer	1420-018	for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018