JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول، ونحن تقديم الإجراءات في تأسيس العضلي ضمور 1 نماذج بالخلايا العضلية الجذعية، بما في ذلك تحسين صيانة C2C12 الخلية، ترنسفكأيشن الجينات / التنبيغ، والتمايز العضلية.

Abstract

العضلي ضمور 1 (DM1) هو شكل شائع من الضمور العضلي. على الرغم من أن وضعت عدة نماذج حيوانية لDM1، ونماذج خلية بالخلايا العضلية الجذعية لا تزال مهمة لأنها توفر بديلا الخلوي فعال لدراسة الأحداث الخلوية والجزيئية. على الرغم من الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية C2C12 استخدمت على نطاق واسع لدراسة تكون العضل، ومقاومة للترنسفكأيشن الجينات، أو تنبيغ الفيروسية، يعيق البحوث في الخلايا C2C12. هنا، نحن تصف بروتوكول الأمثل الذي يتضمن إجراءات الصيانة اليومية، ترنسفكأيشن والتنبيغ لإدخال الجينات إلى myoblasts C2C12 وتحريض التمايز العضلية. بشكل جماعي، وتمكن هذه الإجراءات أفضل الكفاءات ترنسفكأيشن / تنبيغ، فضلا عن نتائج المفاضلة متسقة. بروتوكول صفها في إنشاء DM1 نماذج الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية يمكن أن تستفيد الدراسة من الضمور العضلي، فضلا عن غيرها من أمراض العضلات.

Introduction

العضلي الضمور (DM) هو مرض وراثي جسمي قاهر التي تؤثر على أنظمة متعددة، وأهمها القلب والهيكل العظمي العضلات 1. هناك نوعين من هذا المرض، DM1 وDM2. DM1 هو أكثر شيوعا، ولها مظهر أكثر شدة من DM2 2. الطفرة الوراثية الكامنة DM1 هو التوسع في تكرار ثلاثية CUG تقع في منطقة غير مترجمة 3 '(UTR) من DM بروتين كيناز الجين (DMPK) 3. عدد CUG تكرار في الأفراد تتأثر يختلف من 5 إلى 37. في المقابل، ترتفع إلى أكثر من 50 عاما، وأحيانا تصل إلى الآلاف في المرضى الذين يعانون DM1 4. ونتيجة لذلك، والبروتينات ملزم RNA، مثل muscleblind مثل 1 (MBNL1)، CUGBP، وElav مثل العائلة 1 (Celf1)، هي misregulated. بسبب الحراسة على تكرار CUG الموسعة، MBNL1 يفقد قدرته على تنظيم الربط البديل 5. Celf1، من ناحية أخرى، يصل ينظم 6،7. ويرتبط overexpression من Celf1 مع فقدان العضلاتوالضعف، والتي لا تنسب إلى فقدان وظيفة MBNL1. النماذج الحيوانية محاكاة التعديلات المتعلقة DM1، بما في ذلك DMPK 3'-UTR CUG التوسع، وفقدان MBNL1، وoverexpression من Celf1، أنشئت. ومع ذلك، والنمذجة DM1 في myoblasts يوفر بديلا فعالا، خاصة بالنسبة للتشريح الأحداث الخلوية والجزيئية ذات الصلة DM1.

تم عزل C2C12 خط الخلية بالخلايا العضلية الجذعية أول من أصيب العضلات C3H الماوس وتستخدم على نطاق واسع لدراسة عضلي 8،9 التمايز. خلايا C2C12 تتكاثر بسرعة في مصل بقري جنيني (FBS) المحتوية على وسائل الإعلام وبسهولة الخضوع التمايز عندما يتم استنفاد FBS. بعد، وذلك باستخدام هذا النموذج بالخلايا العضلية الجذعية التمايز يقدم تحديين: خلايا C2C12 مقاومة لترنسفكأيشن الجينات / تنبيغ الفيروسية كثير من الأحيان؛ وهناك اختلافات طفيفة في معالجة الخلايا وإجراء المفاضلة يمكن أن يؤدي إلى تغيرات ملحوظة في تشكيل myotube مركزيا.

مختبرنا يستخدم بشكل روتيني myoblasts C2C12 كما ميلانوقد وضعت الذراع نموذج والبروتوكولات التي تقدم على نحو فعال الجينات ترنسفكأيشن البلازميد، تنبيغ فيروسات، وتنبيغ lentiviral إلى خط الخلية C2C12 10. في الفيديو، ونحن لشرح إجراءات الأمثل لtransfecting / transducing C2C12 الخلايا والحفاظ على التمايز الاتساق في إنشاء DM1 نماذج بالخلايا العضلية الجذعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. C2C12 خلية ثقافة

  1. الحفاظ على myoblasts الماوس C2C12 في لوحة 100 ملم في وسط النمو (المتوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM)) تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين. السماح C2C12 خلايا passaged لتصبح حوالي 50 - 60٪ متموجة.
  2. تجاهل متوسطة النمو وغسل خلايا C2C12 مع المالحة الفوسفات-3 مل درجة حرارة الغرفة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA لفصل الخلايا. وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة لل3-5 دقيقة.
  3. تحييد التربسين بإضافة 3 مل متوسطة النمو. ماصة 6-8 مرات للتعليق الخلايا. إضافة 1 مل من خلية علقت لوحة جديدة 100 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.

2. C2C12 خلية ترنسفكأيشن / تنبيغ والاختيار

  1. C2C12 البلازميد ترنسفكأيشن
    1. 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، صأواخر 7.0 × 10 5 C2C12 الخلايا في بئر واحدة من لوحة ستة جيدا لكل ترنسفكأيشن.
      ملاحظة: هذا يؤدي إلى 50-60٪ التقاء في الوقت ترنسفكأيشن.
    2. السماح للكاشف ترنسفكأيشن أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
    3. إضافة 2 ميكروغرام من البلازميد (GFP-CUG5 أو GFP-CUG200) إلى 200 ميكرولتر قبل تحسنت المصل خالية المتوسطة ودوامة لفترة وجيزة. إضافة 6 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن إلى المتوسطة وخلط فورا لمدة 30 ثانية باستخدام الدوامة. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. تغيير وسائل الإعلام من الخلايا C2C12 إلى 2.5 مل وسائط النمو خالية من المصل. يضاف خليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا بعد الحضانة. العودة لوحات ل5٪ CO 2، 37 درجة مئوية الحاضنة.
    5. إبقاء الخلايا في خليط ترنسفكأيشن / وسائط النمو خالية من المصل لمدة 4 ساعة أو حتى ليلة وضحاها. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام نمو في اليوم التالي أو عندما السمية الخلوية هو واضح.
      ملاحظة: يتم تقييم السمسة عن طريق التفتيش المجهري للمLLS. مراقبة التغييرات في شكل الخلية ومفرزة الخلية. طالما لا يوجد السمية الخلوية العلنية، حضانة بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام نمو المصل خالية يعزز ترنسفكأيشن.
    6. حدد الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن بإضافة 1،2-1،6 ملغ / مل G418 ب ~ 10 أيام حتى لا يكون للثقافة التحكم (transfected دون البلازميدات) الخلايا الحية. تغيير وسائل الاعلام كل يومين مع وسائل الاعلام النمو تستكمل مع G418.
    7. الحفاظ على الخلايا المقاومة G418 في متوسط ​​النمو و 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة تجارب لاحقة.
  2. إعداد الارتجاعي وC2C12 فيروسات تنبيغ
    1. تحضير كلوة 293 مستنبت من خلال استكمال DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز مع 10٪ مصل بقري جنيني، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين.
      1. ما يقرب من 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، لوحة 4.0 × 10 خلايا التعبئة والتغليف كلوة 293 المستندة إلى 6 ecotropic في 100 لوحة ملم (80٪ التقاء في ترنسفكأيشن) جontaining مستنبت الخلية.
    2. السماح للكاشف ترنسفكأيشن أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
    3. خلط 15 ميكروغرام DNA البلازميد (pMSCV-بورو أو pMSCV-Celf1Flag-بورو) في 1 مل متوسطة النمو خالية من المصل. لفترة وجيزة دوامة. إضافة 30 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن من الخطوة 2.2.2 في الحمض النووي المصل خالية أنبوب / متوسطة النمو، وتخلط جيدا باستخدام دوامة. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. إضافة خليط ترنسفكأيشن قطرة قطرة إلى الخلايا التعبئة والتغليف ecotropic كلوة 293 المستندة. دوامة بلطف لوحات والعودة إليها مرة أخرى إلى 5٪ CO 2، 37 درجة مئوية الحاضنة. بعد 24 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام إلى 10 مل قبل تحسنت متوسطة النمو الطازجة.
    5. حصاد طاف (التي تحتوي على الفيروس الارتجاعي) 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن باستخدام ماصة ونقل طاف في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الحارة الجديدة على لوحة وإعادته إلى الحاضنة. إبقاء طاف في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم إضافة وسائل الإعلام بلطف إلى tانه جانب من البئر حتى لا تعطل أحادي الطبقة الخلية.
    6. حصاد الدفعة الثانية من طاف 60 ساعة بعد ترنسفكأيشن وتجمع مع طاف من 2.2.5. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لإزالة الحطام الخلوي.
    7. نقل طاف في 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. استخدام الارتجاعي لتنبيغ الخلايا C2C12 في هذه النقطة من خلال المتابعة إلى الخطوة 2.2.9 أو قسامة وتخزين طاف في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    8. ذوبان الجليد في الارتجاعي من 2.2.7 في درجة حرارة الغرفة، إذا تم استخدام الأوراق المالية المجمدة هنا.
      ملاحظة: تجنب متعددة تجميد أذاب دورات.
    9. لوحة الخلايا C2C12 في نفس اليوم تنبيغ تهدف ل30 - 40٪ من التقاء.
      1. تجاهل متوسطة النمو وغسل خلايا C2C12 مع 3 مل درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 500 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة لل3-5 دقيقة.
      2. تحييد التربسين بإضافة 3 مل ميد النموالبوتاسيوم. ماصة 6-8 مرات للتعليق الخلايا. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإضافة 8.0 × 10 5 C2C12 الخلايا إلى لوحة 60 ملم.
    10. إضافة 0.5 مل الارتجاعي لإصابة واحدة لوحة 60 ملم من الخلايا في 3 وسائل الاعلام مل النمو. العودة إلى لوحة الحاضنة.
    11. استبدال 3 وسائل الإعلام الجديدة مل تستكمل مع المضادات الحيوية التحديد (بوروميسين 1-3 ميكروغرام / مل) 48 ساعة بعد الإصابة. استبدال 3 مل المتوسطة مع المضادات الحيوية كل يوم ل~ 5 أيام حتى تموت الثقافة untransduced السيطرة C2C12 بها.
  3. إعداد الفيروسة البطيئة وC2C12 lentiviral التنبيغ
    ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات المتعلقة الفيروسة البطيئة في السلامة الأحيائية المستوى 2 مجلس الوزراء واتباع إرشادات السلامة البيولوجية. النفايات السائلة التي تحتوي على الفيروس يجب تطهيرها قبل التخلص منها.
    1. لوحة 4.0 × 10 6 293T الخلايا في لوحة 100 ملم (~ 80٪ التقاء في يوم من ترنسفكأيشن) مع كلوة 293 خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM الجلوكوز المرتفع، على أن تستكمل مع 10٪ الجنينالمصل البقري، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و2 مم L-الجلوتامين) 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن.
    2. تدفئة كاشف ترنسفكأيشن إلى درجة حرارة الغرفة. مزيج من ناقلات lentiviral التعبئة والتغليف (4 ميكروغرام pMD2.G و 6 ميكروغرام psPAX2) جنبا إلى جنب مع ناقل 8 ميكروغرام نقل lentiviral (Celf1 shRNA أو مشوشة تحكم shRNA) في 1 مل مصل مستنبت الخلية الحرة. لفترة وجيزة دوامة.
    3. إضافة 36 ميكرولتر قبل تحسنت كاشف ترنسفكأيشن على الحمض النووي / DMEM أنبوب ومزيج جيد من قبل دوامة. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. إزالة الخلايا 293T من الحاضنة وإضافة خليط ترنسفكأيشن إلى اللوحة. دوامة بلطف لوحة والعودة مرة أخرى إلى 5٪ CO 2، 37 درجة مئوية الحاضنة. بعد 24 ساعة، يستعاض عن خليط ترنسفكأيشن مع 10 مل المتوسطة ثقافة جديدة.
    5. جمع طاف تحتوي على الفيروسة البطيئة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 10 وسائل الاعلام الحارة الجديدة مل إلى لوحة وإعادتهإلى الحاضنة. تخزين طاف في 4 درجات مئوية.
    6. جمع الدفعة الثانية من طاف 60 ساعة بعد ترنسفكأيشن والجمع بين ذلك مع طاف من 2.3.5. لفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    7. نقل طاف في 50 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة. في حالة استخدام فيروس جديد، انتقل إلى الخطوة 2.3.9. لاستخدامها في المستقبل، مخزن الفيروس التي تحتوي على طاف في -20 درجة مئوية في aliquots من 10 مل.
    8. ذوبان الجليد الفيروس من 2.3.7 في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، إذا تم استخدام الأوراق المالية المجمدة.
      ملاحظة: تجنب متعددة تجميد أذاب دورات.
    9. لوحة الخلايا C2C12-CUG200 (تم الحصول عليها في القسم 2.1) كما هو موضح في 2.2.9 في نفس اليوم تنبيغ.
      ملاحظة: الهدف عن 30 - 40٪ من التقاء.
    10. إضافة 0.5 مل الفيروس تصيب لوحة 60 ملم من C2C12-CUG200 والعودة إلى لوحة الحاضنة.
    11. استبدال مستنبت مع وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع المضادات الحيوية التحديد (بوروميسين 1-3 ميكروغرام / مل) بعد 72 ساعة تنبيغ.تحديث وسائل الإعلام ثقافة كل يوم مع المضادات الحيوية اختيار ~ 5 أيام حتى تموت كل ثقافة untransduced السيطرة C2C12-CUG200 بها.
    12. استخدام لطخة غربية للتحقق ضربة قاضية Celf1 في الخلايا transfected GFP-CUG200.

3. C2C12 تمايز الخلايا

  1. لوحة 2 × 10 6 خلايا في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا في 2.5 مل سائل الإعلام نمو 24 ساعة قبل بدء التمايز.
    ملاحظة: يمكن تعديل كثافة الطلاء المعدني بحيث يتم التوصل إلى نقطة التقاء الكامل في 24 ساعة.
    1. شطف الخلايا متموجة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2.5 مل من المصل منخفضة التمايز المتوسطة (المعدلة المتوسطة النسر تستكمل مع 2٪ مصل الخيول، و 100 U / البنسلين مل Dulbecco و، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1 ميكرومتر الأنسولين) . استبدال المتوسطة كل يومين.
      ملاحظة: حافظ على الأنسولين الأسهم المجمدة وإضافته إلى وسائل الإعلام في كل تغيير المتوسط.
  2. خلال C2C12 التمايز، وجمع عينات للتشيوانtitative RT-PCR (انظر القسم 4) في النقاط الزمنية التالية: Day0، 1، 2، 4، و 6. عملية الثقافة لالمناعية في يوم 6-8 (انظر القسم 5).

عزل 4. RNA والكمي RT-PCR

  1. استخدام بروتوكول الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي. بعد العزلة، resuspend وبيليه الحمض النووي الريبي في 30 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر والماصة صعودا وهبوطا عدة مرات.
    ملاحظة: عينات يمكن المضي إلى الكمية RT-PCR أو يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. استخدام عدة RT QPCR لالكمي RT-PCR 10 و اتباع تعليمات الشركة المصنعة. تحضير مزيج رد فعل وفقا للجدول 1.
مكون الحجم (ميكرولتر) تركيز النهائي
رد فعل العازلة 2X 10 1X
التمهيدي إلى الأمام 0.5 200 نانومتر
التمهيدي عكسي 0.5 200 نانومتر
مسبار 0.5 200 نانومتر
عكس الناسخ وريبونوكلياز المانع 0.1 0.25 U / مل
قالب 1 100 الحمض النووي الريبي مجموع نانوغرام
ريبونوكلياز المياه مجانا 7.4 NA
إجمالي ميكس 20

الجدول 1. الكمية RT-PCR ماستر تحضير مزيج

  1. تشغيل 20 ميكرولتر RT-QPCR رد فعل باستخدام ملف الحرارية الجدول 2.
خطوة النسخ العكسي 30 دقيقة، 48 ° C
الحمض النووي البوليمرتفعيل بورصة عمان / الناسخ العكسي تعطيل 10 دقيقة، 95 ° C
40 دورات 15 ثانية، 95 ° C
1 دقيقة، 60 ° C

الجدول 2. الكمية RT-PCR ملف الحرارية

5. المناعية

  1. إصلاح الثقافة أحادي الطبقة في 2.5 مل الطازجة 4٪ بارافورمالدهيد / برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  2. Permeabilize العينات في 2.5 مل 0.1٪ تريتون X-100 / برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. نقل العينات إلى غرفة ترطيب. منع عينات في 2.5 مل عازلة تمنع (السطحي 0.1٪ غير أيوني / برنامج تلفزيوني، و 10٪ مصل الماعز العادي) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. تجاهل عازلة تمنع وتطبيق 800 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية ضد سلسلة الميوسين الثقيلة المخفف في عرقلة العازلة (1: 100). احتضان في ليلة وضحاها غرفة مرطب في درجة حرارة الغرفة.
  5. غسل لوحة 3 تيموفاق (10 دقيقة لكل منهما) مع 2.5 مل العازلة غسل (0.1٪ بوليسوربات 20 / PBS) في يوم 2.
  6. إزالة غسل العازلة وتطبيق 800 الضد الثانوية ميكرولتر (الماعز المضادة للمفتش الماوس، 1: 500 المخفف في برنامج تلفزيوني). احتضان في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  7. غسل مرتين (10 دقيقة لكل منهما) مع العازلة 2.5 مل غسل.
  8. احتضان مع 800 دابي ميكرولتر (1 ميكروغرام / مل، مخففة في المقطر منزوع الأيونات H 2 O) لمدة 5 دقائق.
  9. يغسل مع 2.5 مل العازلة يغسل مرة أخرى لمدة 10 دقيقة.
  10. تغيير غسل العازلة إلى 2.5 مل برنامج تلفزيوني واستخدام المجهر الفلورسنت لالتقاط الصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

و transfected خلايا C2C12 مع GFP-CUG5 أو GFP-CUG200. بعد اختيار مقاومة المخدرات، تم إنشاء مجمعات مستقرة، والتي يمكن أن تصور من قبل التعبير GFP (الشكل 1A). تم الكشف عن تشكيل myotube مركزيا في myoblasts متباينة من قبل الميوسين السلسلة الثقيلة المناعية 10 (الشكل 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد تم استخدام خط الخلية C2C12 كنموذج لدراسة تكون العضل 11-14. هذه الخلايا تحتفظ نظرة تشبه الخلايا الليفية، تتكاثر بسرعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ الجنين المصل البقري والتفريق بسهولة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 2٪ مصل الخيول 15. نمو سريع والتمايز ه?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucoseLife Technologies11965-084for culture medium
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)Life Technologies10378-016for culture medium
Insulin from bovine pancreasSigma AldrichI6634-100MGfor differentiation medium
equine serumAtlanta BiologicalsS12150for differentiation medium
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311 for transfection
G418 sulfate Gold Biotechnology G-418-10for drug resistant selection
Puromycin dihydrochlorideSigma Aldrichsc-108071for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 wellLife TechnologiesNP0323BOXfor western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life TechnologiesNP00061for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechnologiesNP0002for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 mGE healthcare life science10600015for western blot
MF 20Developmental Hybridoma BankMF 20primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugateThermo Fisher ScientificT-862secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xfor qRT-PCR
TriPure Isolation ReagentRoche11667165001for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1)santa cruzsc-20003primary Ab western blot
Actin Antibodysanta cruzsc-1615goat polyclonal IgG for loading control
293T EcopackClontech631507cells for retrovirus preparation
pMSCV-puroClontech634401empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-purohouse-constructednot availableretroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2gift from Didier Trononot availablefor lentivirus preparation
pMD2.Ggift from Didier Trononot availablefor lentivirus preparation
GFP-CUG5gift from M.S. Mahadevannot availabledetails in reference 10 
GFP- CUG200gift from M.S. Mahadevannot availabledetails in reference 10 
Triton X-100Sigma AldrichX100for immunostaining
paraformaldehydeSigma AldrichP6148for immunostaining
TWEEN 20Sigma AldrichP9416for immunostaining
DAPISigma AldrichD9542for immunostaining

References

  1. Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
  2. Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
  3. Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
  4. Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
  5. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  6. Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
  7. Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
  8. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  9. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
  10. Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
  11. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
  12. Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
  13. Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
  14. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
  15. Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
  16. Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
  17. Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113 C2C12 Celf1 lentiviral

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved