דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

Summary

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.

Abstract

Myotonic ניוון 1 (DM1) היא צורה נפוצה של ניוון שרירים. למרות במודלים של בעלי חיים כמה הוקמו DM1, מודלי תא myoblast הם עדיין חשובים משום שהם מציעים אלטרנטיבה הסלולר ביותר ללימוד אירועים תאיים ומולקולריים. למרות תאים myoblast C2C12 כבר בשימוש נרחב ללמוד myogenesis, עמידות transfection הגן, או התמרה ויראלית, מעכבת מחקר בתאי C2C12. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה הכולל תחזוקה יומית, נהלי transfection התמר להציג גנים לתוך myoblasts C2C12 ואת האינדוקציה של בידול myocyte. ביחד, נהלים אלה לאפשר יעילות transfection / תמרה הטובות ביותר, כמו גם תוצאות בידול עקביות. הפרוטוקול המתואר בהקמת מודלי תא myoblast DM1 ירוויח לחקר ניוון myotonic, כמו גם מחלות שרירים אחרות.

Introduction

ניוון Myotonic (DM) הוא מחלה דומיננטית אוטוזומלית המשפיעה מערכות מרובות, בעיקר שרירי לב שלד ^1. ישנם שני תת סוגים של המחלה הזאת, DM1 ו DM2. DM1 נפוץ יותר ויש לו ביטוי חמור יותר DM2 ^2. המוטציה הגנטית הבסיסית DM1 היא רחבה של חזרות שלישיית CUG הממוקמות באזור המתורגם '3 (UTR) של גן החלבון קינאז DM (DMPK) ^3. מספר חוזרי CUG אצל אנשים לא מעושה משתנה בין 5 ל 37. לעומת זאת, היא מגדילה ליותר מ -50, ולפעמים עד אלף בחולי DM1 ^4. כתוצאה מכך, חלבונים קושרי RNA, כגון muscleblind דמוי 1 (MBNL1), CUGBP, ו Elav-כמו משפחה 1 (Celf1), הם misregulated. בשל התפיסה על חזרות CUG המורחבות, MBNL1 מאבד את יכולתו לווסת שחבור חלופי ^5. Celf1, ומצד שני, הוא למעלה מוסדר ^6,7. התבטאות יתר של Celf1 קשורה לאובדן שרירחולשה, אשר אינן מיוחסות אובדן תפקוד MBNL1. במודלים של בעלי חיים לדמות שינויים הקשורים DM1, ובכלל זה, הרחבת DMPK 3'-UTR CUG, אובדן MBNL1, ואת יתר של Celf1, הוקמו. עם זאת, דוגמנות DM1 ב myoblasts מציעה אלטרנטיבה יעילה, במיוחד עבור לנתח הקשורות DM1 אירועים תאיים ומולקולריים.

C2C12 שורת תאי myoblast בודד לראשונה מ שריר עכבר C3H נפצע בשימוש נרחב ללמוד ^8,9 בידול myogenic. תאי C2C12 להתרבות במהירות בסרום שור עובר (FBS) המכיל תקשורת לעבור התמיינות בקלות כאשר FBS ייגמר. עם זאת, באמצעות מודל בידול myoblast זה מציג שני אתגרים: תאי C2C12 הם בדרך כלל עמידים בפני transfection גן / תמרה ויראלית; ו שינויים קלים טיפול תא הליך בידול יכולים להוביל לשינויים חדים בהשקעות myotube.

המעבדה שלנו באופן שגרתי משתמש myoblasts C2C12 כמו acell מודל פתח פרוטוקולים להעברת גנים ביעילות על ידי transfection פלסמיד, תמרת retroviral, תמרת lentiviral לתוך תא C2C12 קו ^10. בסרטון, אנחנו מדגימים את הנהלים אופטימיזציה עבור transfecting / transducing C2C12 תאים ושמירה על עקביות בידול בהקמת מודלים myoblast DM1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תרבית תאי C2C12

1. לשמור myoblasts העכבר C2C12 בצלחת 100 מ"מ במדיום הגידול (המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)) בתוספת 20% בסרום שור עוברית, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ"מ L- גלוטמין. אפשר תאי passaged C2C12 להיות כ 50 - 60% ומחוברות.
2. מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ"ל בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA כדי לנתק את התאים. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך 3 - 5 דקות.
3. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת מדיום הגידול 3 מ"ל. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. הוסף 1 מ"ל של תאים מושעה לצלחת 100 מ"מ חדש לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

2. Transfection Cell C2C12 / התמרה בחירה

1. transfection פלסמיד C2C12
   1. 24 שעות לפני transfection, עמ '7.0 מאוחר x 10 ⁵ C2C12 תאים לתוך אחד טוב של צלחת שש היטב עבור כל transfection.
      הערה: זה מוביל 50 - 60% מפגש ידי בזמן transfection.
   2. אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   3. הוסף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (GFP-CUG5 או GFP-CUG200) לתוך 200 μl מחומם מראש בינוני חופשי בסרום ו מערבולת בקצרה. הוסף מגיב transfection 6 μl למדיום ומערבבים מיד למשך 30 שניות בעזרת מערבולת. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. שנה את התקשורת של תאי C2C12 2.5 מ"ל מדיה סרום ללא צמיחה. מוסיפים את תערובת transfection לתאים לאחר דגירה. החזר את הצלחות על 5% CO _2, 37 ° C חממה.
   5. שמור את התאים ב תערובת transfection / מדיה סרום ללא צמיחה עבור 4 שעות או עד הלילה. שינוי תקשורת חזרה תקשורת הצמיחה למחרת או כאשר cytotoxicity ניכר.
      הערה: Cytotoxicity נבחנת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של ceLLS. בוחן את שינויי מורפולוגיה תאי ניתוק תא. כל עוד אין cytotoxicity גלויה, דגירה לילה במדיה סרום ללא צמיחה משפרת transfection.
   6. בחר את התאים 48 שעות לאחר transfection ידי הוספת 1.2 - G418 1.6 מ"ג / מ"ל ​​עבור ~ 10 ימים עד שהתרבות מלאה (טרנספקציה ללא פלסמידים) אין תאים חיים. שנה את התקשורת כל יומיים עם התקשורת צמיחה בתוספת G418.
   7. לשמור על התאים G418 עמידים במדיום הגידול ו 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס במשך הניסויים הבאים.
2. הכנת רטרו-וירוס תמרת retroviral C2C12
   1. הכן בינוני תרבות HEK 293 על ידי השלמת גלוקוז DMEM גבוהה עם 10% בסרום שור עוברית, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
      1. כ 24 שעות לפני transfection, צלחת 4.0 x 10 ⁶ ecotropic HEK תאי אריזת 293 מבוססים בבית (מפגש 80% ב transfection) 100 מ"מ צלחת גתרבית תאים בינוני ontaining.
   2. אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   3. מערבבים 15 מיקרוגרם DNA פלסמיד (pMSCV-Puro או pMSCV-Celf1Flag-Puro) ב 1 בינוני מ"ל סרום ללא צמיחה. בקצרה וורטקס. הוסף 30 מגיבים transfection μl משלבים 2.2.2 לתוך צינור מדיום גידול DNA / סרום ללא, ומערבבים בעזרת מערבולת היטב. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   4. הוסף dropwise תערובת transfection אל HEK ecotropic מבוסס 293 תאי האריזה. מערבולת בעדינות את הצלחות ולהחזיר אותם בחזרה 5% CO _2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, לשנות את התקשורת עד 10 מיליליטר מחומם מראש מדיום גידול טרי.
   5. קציר supernatant (המכיל רטרו-וירוס) 48 שעות לאחר transfection בעזרת פיפטה ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת החמה החדשה לצלחת ולהחזיר אותו אל האינקובטור. שמור את supernatant על 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: התקשורת מתווספת בעדינות כדי לאהוא בצד של הבאר כדי לא לשבש את monolayer התא.
   6. קציר את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection וברכה זה עם supernatant מ 2.2.5. צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
   7. מעבירים את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חדש. השתמש רטרו-וירוס כדי transduce תאים C2C12 בשלב זה על ידי שתמשיך לשלב 2.2.9 או aliquot ולאחסן את supernatant ב -20 ° C לשימוש עתידי.
   8. ההפשרה רטרו-וירוס מ 2.2.7 בטמפרטורת החדר, אם מניה קפוא משמש כאן.
      הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים.
   9. פלייט תאי C2C12 באותו היום של התמרה המכוונת במשך 30 - 40% של מפגש.
      1. מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ"ל בטמפרטורת החדר PBS. הסר את PBS, להוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA, דגירה צלחת ₂ באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO עבור 3 - 5 דקות.
      2. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל med צמיחהium. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף 8.0 x 10 ⁵ C2C12 תאים לצלחת 60 מ"מ.
   10. הוסף 0.5 מ"ל רטרו-וירוס להדביק צלחת אחת 60 מ"מ של תאים בתקשורת צמיחה 3 מ"ל. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור.
   11. החלף עם 3 מ"ל התקשורת טריים בתוספת אנטיביוטיקה הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מ"ל) 48 שעות לאחר ההדבקה. החלף 3 מ"ל בינוני עם אנטיביוטיקה כל יום במשך ~ 5 ימים עד שהתרבות מלאה C2C12 untransduced גוועת.
3. הכנת Lentivirus ו התמר lentiviral C2C12
   הערה: בצע את כל ההליכים הקשורים lentivirus ב בטיחות ביולוגית רמה 2 ארון ולפעול בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגיות. פסולת נוזלית בעלת הנגיף יש לחטא לפני סילוק.
   1. פלייט 4.0 x 10 ⁶ 293T תאים בצלחת 100 מ"מ (~ 80 מפגש% ביום של transfection) עם תרבית תאים בינוניים HEK 293 (גלוקוז DMEM גבוהה, בתוספת 10% עובריתבסרום שור, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ"מ L- גלוטמין) 24 שעות לפני transfection.
   2. מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר. מערבבים את וקטורים אריזה lentiviral (4 מיקרוגרם pMD2.G ו -6 מיקרוגרם psPAX2) יחד עם וקטור העברת 8 מיקרוגרם lentiviral (Celf1 shRNA או מקושקשות shRNA שליטה) ב 1 בינוני מ"ל תרבית תאים חופשית בסרום. בקצרה וורטקס.
   3. להוסיף 36 μl מגיב transfection מחומם מראש ל הצינור DNA / DMEM ומערבבים היטב על ידי מערבולת. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   4. הסרת תאי 293T מן החממה ולהוסיף לתערובת transfection לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה 5% CO _2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, להחליף את תערובת transfection עם המדיום תרבות טרי 10 מ"ל.
   5. אסוף את lentivirus supernatant המכיל 48 שעות לאחר transfection ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הוסף 10 מדיה חמה חדשה מיליליטר לצלחת ולהחזירוחממה. אחסן את supernatant על 4 מעלות צלזיוס.
   6. אסוף את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection, ולשלב אותו עם supernatant מ 2.3.5. בקצרה צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
   7. מעבירים את supernatant לתוך צינור 50 מ"ל צנטריפוגות טריים. אם אתה משתמש וירוס טרי, המשך לשלב 2.3.9. לשימוש עתידי, חנות וירוס המכילים supernatant ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של 10 מ"ל.
   8. להפשיר מהווירוס 2.3.7 בטמפרטורת החדר לפני השימוש, אם מניה קפוא משמש.
      הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים.
   9. פלייט תאי C2C12-CUG200 (המתקבלים בסעיף 2.1) כמתואר 2.2.9 באותו היום של תמרה.
      הערה: כוון 30 - 40% של מפגש.
   10. הוסף 0.5 מ"ל וירוס להדביק צלחת 60 מ"מ של C2C12-CUG200 ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור.
   11. החלף את מדיום התרבות עם תקשורת טריה בתוספת אנטיביוטיקת הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר) 72 שעות לאחר תמרה.רענן היומיום תקשורת והתרבות עם אנטיביוטיקת הבחירה ~ 5 ימים עד שכל התרבות מלאת C2C12-CUG200 untransduced גוועת.
   12. השתמש כתם מערבי לאמת מציאת Celf1 בתאי transfected GFP-CUG200.

3. התמיינות תאים C2C12

1. פלייט 2 x 10 ⁶ תאים אחד טוב של צלחת 6-היטב 2.5 מיליליטר תקשורת צמיחת 24 שעות לפני תחילת הבידול.
   הערה: צפיפות הציפוי עשויה להיות מותאמת כך מפגש מלא הוא הגיע ב -24 שעות.
   1. יש לשטוף את התאים ומחוברות עם PBS ולהוסיף 2.5 מ"ל של מדיום בידול נמוכה בסרום (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 2% נסיוב סוס, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1 מיקרומטר אינסולין) . החלף את המדיום כל יומיים.
      הערה: שמור אינסולין המניות קפוא ולהוסיף אותו בתקשורת בכל שינוי בינוני.
2. במהלך התמיינות C2C12, לאסוף דגימות עבור קוואןtitative RT-PCR (ראה סעיף 4) בנקודות הזמן הבאות: יום 0, 1, 2, 4, ו -6 תהליך ההתרבות עבור immunostaining ביום 6 - 8 (ראה סעיף 5).

בידוד RNA 4. וכמותי RT-PCR

1. השתמש פרוטוקול של היצרן עבור בידוד RNA. לאחר בידוד, resuspend גלולה רנ"א 30 מים μl RNase ללא ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים.
   הערה: הדוגמות תהיינה רשאיות להמשיך כמוני RT-PCR או יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס.
2. השתמש ערכת qPCR RT עבור כמותי RT-PCR ¹⁰ ובצע את ההוראות של היצרן. מכינים את תערובת התגובה על פי טבלה 1.

רְכִיב	נפח (μl)	ריכוז סופי
מאגר התגובה 2x	10	1x
פריימר קדימה	0.5	200 ננומטר
פריימר הפוך	0.5	200 ננומטר
בְּדִיקָה	0.5	200 ננומטר
הפוך transcriptase & RNase אינהיביטור	0.1	0.25 U / ml
תבנית	1	100 RNA סך ng
מים חינם RNase	7.4	NA
מערבבים סה"כ	20

טבלה 1. כמותי RT-PCR מיקס מאסטר הכנה

3. הפעל תגובת 20 μl RT-qPCR באמצעות טבלה 2 פרופיל תרמית.

צעד שעתוק הפוך	30 דקות, 48 ° C
פולימר DNAאיון ASE הפעלה / הפוך transcriptase	10 דקות, 95 ° C
40 מחזורים	15 שניות, 95 ° C
	1 דק ', 60 ° C

טבלה 2. כמותי פרופיל תרמי RT-PCR

5. Immunostaining

1. תקן את התרבות monolayer ב 2.5 מ"ל מוכן טרי 4% paraformaldehyde / PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
2. Permeabilize דגימות 2.5 מ"ל 0.1% Triton X-100 / PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. העברת דגימות בתא humidified. חסום את דגימות 2.5 מ"ל חסימת חיץ (0.1% nonionic פעילי שטח / PBS, 10% נסיוב עז רגיל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. בטל חסימת חיץ ולהחיל 800 μl נוגדן ראשוני נגד שרשרת שרירן כבד מדולל חסימת חיץ (1: 100). מדגירים לילה בתא humidified בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את הצלחת 3 times (10 דקות כל אחד) עם חיץ 2.5 מ"ל לשטוף (0.1% polysorbate 20 / PBS) ביום 2.
6. הסר את החיץ לשטוף ולהחיל 800 נוגדנים משני μl (IgG אנטי העכבר העז, 1: 500 בדילול מלא PBS). דגירה בתא humidified בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
7. לשטוף פעמיים (10 דקות כל אחד) עם חיץ לשטוף 2.5 מ"ל.
8. דגירה עם 800 μl DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל, בדילול מלא O H ₂ deionized מזוקקים) במשך 5 דקות.
9. לשטוף עם חיץ 2.5 מ"ל לשטוף שוב למשך 10 דקות.
10. שנה את חיץ כביסה 2.5 מ"ל PBS ולהשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ללכוד תמונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תאי C2C12 היו transfected עם GFP-CUG5 או GFP-CUG200. לאחר בחירת התרופה-התנגדות, ברכות יציבות הוקמו, אשר ניתן דמיינו ידי ביטוי של GFP (איור 1 א). היווצרות Myotube ב myoblasts הבדיל זוהה על ידי שרירן שרשרת כבדה immunostaining ¹⁰ (איור 1 ב). כימות של היווצרות myotube הראו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שורת תאים C2C12 נוצל בעבר כמודל ללמוד myogenesis ^11-14. תאים אלה לשמור על המראה כמו-פיברובלסטים, להתרבות במהירות מדיה המכילה 20% בסרום שור העובר ולבדל בקלות מדיה המכילה 2% נסיוב סוס ^15. הצמיחה וההתבדלות מהר הם מאפייני יתרון מודל תא myogenesis. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש פל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-084	for culture medium
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Life Technologies	10378-016	for culture medium
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I6634-100MG	for differentiation medium
equine serum	Atlanta Biologicals	S12150	for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	for transfection
G418 sulfate	Gold Biotechnology	G-418-10	for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride	Sigma Aldrich	sc-108071	for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well	Life Technologies	NP0323BOX	for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)	Life Technologies	NP00061	for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	NP0002	for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m	GE healthcare life science	10600015	for western blot
MF 20	Developmental Hybridoma Bank	MF 20	primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate	Thermo Fisher Scientific	T-862	secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix	AnaSpec	05-QPRT-032X	for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent	Roche	11667165001	for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1)	santa cruz	sc-20003	primary Ab western blot
Actin Antibody	santa cruz	sc-1615	goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack	Clontech	631507	cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro	Clontech	634401	empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro	house-constructed	not available	retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2	gift from Didier Trono	not available	for lentivirus preparation
pMD2.G	gift from Didier Trono	not available	for lentivirus preparation
GFP-CUG5	gift from M.S. Mahadevan	not available	details in reference 10
GFP- CUG200	gift from M.S. Mahadevan	not available	details in reference 10
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	for immunostaining
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148	for immunostaining
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P9416	for immunostaining
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	for immunostaining