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要約

このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。

要約

筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、筋ジストロフィーの一般的な形式です。いくつかの動物モデルは、DM1のために確立されてきたが、彼らは細胞および分子事象を研究するための効率的な細胞の代替を提供するので、筋芽細胞モデルは依然として重要です。 C2C12筋芽細胞は広く遺伝子トランスフェクション、またはウイルス形質導入に筋形成、抵抗性を研究するために使用されているが、C2C12細胞の研究を妨げています。ここでは、C2C12筋芽細胞および筋細胞分化の誘導に遺伝子を導入するために日常のメンテナンス、トランスフェクションおよび形質導入手順が含まれて最適化されたプロトコルを記述します。まとめると、これらの手順は、最高のトランスフェクション/形質導入効率を可能にするだけでなく、一貫性の分化の結果。筋緊張性ジストロフィーの研究だけでなく、他の筋肉疾患に利益をもたらすDM1筋芽細胞モデルの確立に記載されているプロトコル。

概要

筋強直性ジストロフィー（DM）は、複数のシステム、最も特に心臓および骨格筋1に影響を与える常染色体優性疾患です。この病気、DM1とDM2の2つのサブタイプがあります。 DM1は、より一般的であり、DM2 2よりも深刻な症状を持っています。 DM1の根底にある遺伝的変異は、DMプロテインキナーゼ遺伝子（DMPK）3の3 '非翻訳領域（UTR）に位置するCUGトリプレットリピートの拡大です。影響を受けていない個体でのCUG繰り返し数は対照的に、5から37まで変化し、それが50以上に、そして時にはDM1患者4で数千にまで増加します。その結果、のようなRNA結合タンパク質、マッスルのような1（MBNL1）、CUGBP、及びELAV様ファミリー1（Celf1）、誤調節されています。拡大CUGリピート上の隔離に、MBNL1は、選択的スプライシング5を調節する能力を失います。 Celf1が、一方、6,7アップレギュレートされています。 Celf1の過剰発現は、筋肉の損失に関連付けられていますMBNL1機能の喪失に起因しておらず、衰弱、。 DMPK 3'-UTR CUG拡張、MBNL1の損失、およびCelf1の過剰発現を含むDM1​​関連の変化をシミュレートする動物モデルは、確立されています。しかし、筋芽細胞にDM1をモデル化することは、特にDM1に関連する細胞および分子事象を解剖するために、効率的な代替手段を提供しています。

C2C12筋芽細胞株は、最初に負傷したC3Hマウスの筋肉から単離され、広く筋原性分化8,9を研究するために使用しました。 C2C12細胞は急速にウシ胎児血清（FBS）培地を含有して増殖し、容易にFBSが枯渇したとき分化を受けます。しかし、この筋芽細胞分化モデルを使用して2つの課題を提示する：C2C12細胞は、多くの場合、遺伝子導入/形質導入、ウイルスに対して耐性です。および細胞取り扱いおよび分化手順のわずかな変動は、筋管形成の著しい変化につながることができます。

私たちの研究室では、日常的に交流としてC2C12筋芽細胞を使用していますエル・モデルと効果的C2C12細胞株10へのプラスミドのトランスフェクション、レトロウイルス形質導入、およびレンチウイルス形質導入によって遺伝子を送達プロトコルを開発しました。ビデオでは、我々は/トランスフェクトC2C12細胞に形質導入​​し、DM1の筋芽細胞モデルの確立に分化一貫性を維持するための最適化された手順を示しています。

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プロトコル

1. C2C12細胞培養

  1. 20％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充した増殖培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中で100mMのプレートでC2C12マウス筋芽細胞を維持します。 60％コンフルエント - C2C12継代細胞が約50になることを許可します。
  2. 増殖培地を廃棄3 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でC2C12細胞を洗浄します。 PBSを削除し、細胞を剥離するために、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 5分- 37°C、3、5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。
  3. 3mlの増殖培地を添加することによりトリプシンを中和します。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。新規の100mmプレートに懸濁させ、細胞1 mlを加え、37℃、5％CO 2でインキュベートします。

2. C2C12細胞トランスフェクション/形質導入および選択

  1. C2C12のプラスミドトランスフェクション
    1. トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。
      注：これは50につながる - トランスフェクションの時点で60％コンフルエンス。
    2. トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。
    3. 簡単に予熱した無血清培地と渦を200μlにプラスミドDNA（GFP-CUG5またはGFP-CUG200）2μgのを追加します。培地に6μlのトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスを用いて30秒間、すぐに混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。
    4. 2.5ミリリットルの無血清増殖培地にC2C12細胞のメディアを変更します。インキュベーション後、細胞にトランスフェクション混合物を追加します。 5％CO 2、37℃のインキュベーターにプレートを返します。
    5. 4時間または一晩までのトランスフェクション混合物/無血清増殖培地中で細胞を保管してください。翌日バック増殖培地へのメディアを変更するか、または細胞傷害性は明らかであるとき。
      注：細胞毒性は、CEの顕微鏡検査によって評価されますLLS。細胞の形態と細胞の剥離の変化を観察します。限り、明白な細胞毒性がないように、無血清増殖培地中で一晩インキュベートし、トランスフェクションを増強します。
    6. （プラスミドなしでトランスフェクト）コントロール培養物は、生細胞を持っていないまで、10日〜のために1.6mg / mlのG418 - 1.2を追加することによって、細胞をトランスフェクション後48時間を選択します。 G418を補充した成長培地で2日毎に培地を変更します。
    7. その後の実験のために、37℃で増殖培地および5％CO 2でG418耐性細胞を維持します。
  2. レトロウイルスの調製およびC2C12レトロウイルス形質導入
    1. 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM高グルコースを補充することによりHEK 293培地を準備します。
      1. 約24時間のトランスフェクションの前に、100ミリメートルプレート（トランスフェクション80％コンフルエンス）に4.0×10 6エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞をプレートContaining細胞培養培地。
    2. トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。
    3. 1ミリリットルの無血清増殖培地中で15μgのプラスミドDNA（のpMSCV-PuroのかのpMSCV-Celf1Flag-プーロ）を混ぜます。簡単にボルテックス。 DNA /無血清増殖培地チューブにステップ2.2.2から30μlのトランスフェクション試薬を追加し、ボルテックスを用いてよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。
    4. エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。静かにプレートを旋回し、5％CO 2、37℃のインキュベーターに戻し、それらを返します。 24時間後、10ミリリットル予め温めた新鮮な増殖培地にメディアを変更します。
    5. 上清（含むレトロウイルス）ピペットを用いてトランスフェクションの48時間後に収穫し、50mlの遠心チューブに上清を移します。プレートに新しい暖かいメディアの10ミリリットルを加え、インキュベーターに戻します。 4℃で上清を保管してください。
      注：メディアはトンに静かに追加されます彼は井戸の側細胞単層を破壊しないように。
    6. トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収穫し、2.2.5からの上清と、それをプールします。細胞破片を除去するために7分間500×gで、4℃で遠心分離します。
    7. 新しい50ミリリットルの遠心管に上清を移します。 2.2.9またはアリコートに進み、将来の使用のために-20℃で上清を保存するために進むことによって、この時点でC2C12細胞を形質導入するためにレトロウイルスを使用してください。
    8. 凍結ストックがここで使用されている場合、室温で2.2.7からレトロウイルスを解凍します。
      注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。
    9. 合流の40％ - 30を目指し伝達の同じ日にC2C12細胞をプレート。
      1. 増殖培地を捨て、3ミリリットルの室温PBSでC2C12細胞を洗います。 PBSを削除し、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加し、37°C、3、5％CO 2インキュベーター内でプレートをインキュベートする- 5分。
      2. 3ミリリットルの成長MEDを追加することにより、トリプシンを中和イウム。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。血球計数器を用いて細胞を数え、60ミリメートルプレートに8.0×10 5 C2C12細胞を追加します。
    10. 3ミリリットル成長培地中の細胞の1 60ミリメートルプレートを感染させるために0.5ミリリットルレトロウイルスを追加します。インキュベーターにプレートを返します。
    11. （ - 3 / mlのピ​​ューロマイシン1）感染後48時間で3ミリリットル選択抗生物質を補った新鮮な培地と交換してください。形質導入されていないC2C12制御文化が出て死ぬまで〜5日間、毎日抗生物質を含む培地3ミリリットルを交換してください。
  3. レンチウイルスの調製およびC2C12のレンチウイルス形質導入
    注：バイオセーフティレベル2キャビネット内のすべてのレンチウイルス関連の手順を実行し、生物学的安全性のガイドラインに従ってください。ウイルスを含有する液体廃棄物は、廃棄前に消毒する必要があります。
    1. 10％の胎児を補充したHEK 293細胞培地（DMEM高グルコース100ミリメートルプレート（〜トランスフェクションの日に80％コンフルエント）でプレート4.0×10 6個の293T細胞を、ウシ血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン）トランスフェクション前に24時間。
    2. 室温へのトランスフェクション試薬を温めます。 8μgのレンチウイルス導入ベクターと一緒にレンチウイルスパッケージングベクター（4μgのpMD2.Gと6μgのpsPAX2）ミックス（Celf1のshRNAをまたは対照shRNAをスクランブル）1ミリリットルの無血清細胞培養培地中。簡単にボルテックス。
    3. DNA / DMEMチューブに36μlの予熱したトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスでよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。
    4. インキュベーターから293T細胞を除去し、プレートにトランスフェクション混合物を追加します。静かにプレートを旋回し、戻って5％CO 2、37℃インキュベーターにそれを返します。 24時間後、10ミリリットルの新鮮な培地でトランスフェクション混合物を交換してください。
    5. トランスフェクション後にレンチウイルスの48時間を含む上清を収集し、50ミリリットルの遠心分離管にそれを転送します。プレートに10ミリリットル新しい暖かいメディアを追加し、それを返しますインキュベーターへ。 4℃で上清を保管してください。
    6. トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収集し、2.3.5からの上清とそれを組み合わせます。 7分間500×gで、4℃で遠心分離簡単。
    7. 新しい50ml遠心管に上清を移します。新鮮なウイルスを使用している場合は、2.3.9に進みます。将来の使用のために、店舗の10ミリリットルの分注して-20℃で上清をウイルス含有。
    8. 凍結ストックが使用される場合、使用前に室温2.3.7からウイルスを解凍。
      注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。
    9. （2.1節）で得られたプレートC2C12-CUG200細胞の形質導入の同じ日に2.2.9で説明したように。
      注：30を目指して - コンフルエンスの40％。
    10. C2C12-CUG200の60ミリメートルプレートに感染し、インキュベーターにプレートを返すために、0.5ミリリットルのウイルスを追加します。
    11. 形質導入後72時間 - 選択抗生物質（3 / mlのピ​​ューロマイシン1）を補った新鮮な培地と培養液を交換してください。すべての形質導入されていないC2C12-CUG200制御文化が出て死ぬまで〜5日間の選択抗生物質で培養培地を毎日更新します。
    12. GFP-CUG200トランスフェクションした細胞でCelf1ノックダウンを確認するために、ウエスタンブロットを使用してください。

3. C2C12細胞の分化

  1. プレート分化の開始前に、2.5ミリリットルの増殖培地24時間で6ウェルプレートの1ウェル中の2×10 6個の細胞。
    注：完全なコンフルエンスが24時間で達成されるように、プレーティング密度を調整することができます。
    1. PBSでコンフルエント細胞をリンスし、低血清分化培地2.5 mLを加え（2％ウマ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1μMインスリン） 。 2日毎に培地を交換してください。
      注：凍結ストックのインスリンを保持し、各培地交換時にメディアに追加します。
  2. C2C12分化の間に、泉のためのサンプルを収集titative以下の時点でのRT-PCR（セクション4を参照してください）​​：Day0、1、2、4、6日目に免疫染色のための培養6.プロセス - 8（第5節参照）。

4. RNAの単離および定量的RT-PCR

  1. RNA単離のために、製造業者のプロトコルを使用してください。単離後、30μlのRNaseフリー水でRNAペレットを再懸濁し、上下に数回をピペットと。
    注：サンプルは、定量的RT-PCRに進むか、または-80℃で保存することができます。
  2. 定量的RT-PCR 10のためのRT定量PCRキットを使用し、製造元の指示に従ってください。 表1に従って反応ミックスを調製します。
成分 容量（μL） 最終濃度
2×反応緩衝液 10 1倍
フォワードプライマー 0.5 200 nMの
リバースプライマー 0.5 200 nMの
プローブ 0.5 200 nMの
転写酵素＆RNアーゼ阻害剤を逆に 0.1 0.25 U / mlの
テンプレート 1 100 ngの全RNA
RNaseを含まない水 7.4 NA
合計ミックス 20

表1定量的RT-PCRマスターミックス調製

  1. 熱プロファイルの表2を用いて、20μlのRT-qPCRの反応を実行します。
逆転写ステップ 30分間、48°C
DNAポリマーアーゼ活性化/逆転写酵素の不活化 10分間、95°C
40サイクル 15秒、95°C
1分、60°C

表2の定量的RT-PCR温度プロファイル

5.免疫染色

  1. たて10分間室温で4％パラホルムアルデヒド/ PBSを用意し2.5ミリリットルで単層培養を修正しました。
  2. 室温で30分間、2.5 mlの0.1％トリトンX-100 / PBSで試料を透過。
  3. 加湿チャンバーにサンプルを転送します。 37℃で30分間、緩衝液（0.1％の非イオン性界面活性剤/ PBS、10％正常ヤギ血清）でブロッキング2.5 ml中にサンプルを遮断します。
  4. ブロッキングバッファーを捨て、バッファ（1：100）をブロックで希釈したミオシン重鎖に対して800μlの一次抗体を適用します。室温で一晩加湿チャンバー内でインキュベートします。
  5. プレート3ティムを洗います2日目に2.5ミリリットルの洗浄緩衝液（0.1％ポリソルベート20 / PBS）とエス（各10分）。
  6. 洗浄バッファーを削除し、800μlの二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、1：PBSで希釈した500）を適用します。 1時間室温で加湿チャンバー内でインキュベートします。
  7. 2.5ミリリットル洗浄緩衝液で2回（各10分）を洗浄します。
  8. 5分間（1μgの/ mlの蒸留脱イオンH 2 Oで希釈）800μlのDAPIと共にインキュベートします。
  9. 10分間再び2.5ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄します。
  10. 2.5ミリリットルのPBSに洗浄緩衝液を変更し、イメージをキャプチャするために、蛍光顕微鏡を使用しています。

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結果

C2C12細胞を、GFP-CUG5またはGFP-CUG200でトランスフェクトしました。薬剤耐性の選択の後、安定したプールは、GFP発現（ 図1A）によって可視化することができる、確立しました。分化した筋芽細胞における筋管形成は、10（ 図1B）を免疫染色重鎖ミオシンによって検出しました。筋管形成の定量化は、融合指数は2.6±1.1％に35.4±4.1％から減...

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ディスカッション

C2C12細胞株は、筋形成11-14を研究するためのモデルとして使用されてきました。これらの細胞は、線維芽細胞様の外観を保持し、20％ウシ胎児血清を含む培地中で急速に増殖し、容易に2％ウマ血清15を含む培地中で分化します。速い増殖および分化は、筋形成細胞モデルにおいて有利な特性です。ここでは、C2C12細胞にcDNAを、3'-UTR、およびshRNAをを導入するプラスミド、レ?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, high glucoseLife Technologies11965-084for culture medium
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)Life Technologies10378-016for culture medium
Insulin from bovine pancreasSigma AldrichI6634-100MGfor differentiation medium
equine serumAtlanta BiologicalsS12150for differentiation medium
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311 for transfection
G418 sulfate Gold Biotechnology G-418-10for drug resistant selection
Puromycin dihydrochlorideSigma Aldrichsc-108071for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 wellLife TechnologiesNP0323BOXfor western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life TechnologiesNP00061for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechnologiesNP0002for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 mGE healthcare life science10600015for western blot
MF 20Developmental Hybridoma BankMF 20primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugateThermo Fisher ScientificT-862secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xfor qRT-PCR
TriPure Isolation ReagentRoche11667165001for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1)santa cruzsc-20003primary Ab western blot
Actin Antibodysanta cruzsc-1615goat polyclonal IgG for loading control
293T EcopackClontech631507cells for retrovirus preparation
pMSCV-puroClontech634401empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-purohouse-constructednot availableretroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2gift from Didier Trononot availablefor lentivirus preparation
pMD2.Ggift from Didier Trononot availablefor lentivirus preparation
GFP-CUG5gift from M.S. Mahadevannot availabledetails in reference 10 
GFP- CUG200gift from M.S. Mahadevannot availabledetails in reference 10 
Triton X-100Sigma AldrichX100for immunostaining
paraformaldehydeSigma AldrichP6148for immunostaining
TWEEN 20Sigma AldrichP9416for immunostaining
DAPISigma AldrichD9542for immunostaining

参考文献

  1. Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
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