Modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes

Résumé

Dans ce protocole, nous présentons les procédures pour établir la dystrophie 1 modèles de myoblastes myotonique, y compris la maintenance optimisée C2C12 cellulaire, la transfection de gènes / transduction, et la différenciation des myocytes.

Résumé

La dystrophie myotonique 1 (DM1) est une forme courante de dystrophie musculaire. Bien que plusieurs modèles animaux ont été établis pour DM1, les modèles de cellules myoblastes sont encore importants, car ils offrent une alternative cellulaire efficace pour étudier les événements cellulaires et moléculaires. Bien que les cellules de myoblastes C2C12 ont été largement utilisés pour étudier la myogenèse, la résistance à la transfection de gènes, ou une transduction virale, empêche la recherche dans des cellules C2C12. Ici, nous décrivons un protocole optimisé comprenant des procédures d'entretien quotidien, la transfection et de transduction pour introduire des gènes dans des myoblastes C2C12 et l'induction de la différenciation des myocytes. Collectivement, ces procédés permettent de meilleurs rendements de transfection / transduction, ainsi que des résultats de la différenciation cohérente. Le protocole décrit dans l'établissement de modèles de cellules myoblastes DM1 bénéficierait l'étude de la dystrophie myotonique, ainsi que d'autres maladies musculaires.

Introduction

La dystrophie myotonique (DM) est une maladie autosomique dominante qui affecte plusieurs systèmes, plus particulièrement les muscles cardiaques et squelettiques ^1. Il existe deux sous-types de cette maladie, DM1 et DM2. DM1 est plus fréquente et a une manifestation plus sévère que DM2 ^2. La mutation génétique sous - jacente DM1 est une expansion de répétitions de triplets CUG situées dans la région 3 'non traduite (UTR) du gène de la protéine kinase de DM (DMPK) ^3. Le nombre de répétitions CUG dans les individus non affectés varie de 5 à 37. En revanche, elle augmente à plus de 50, et parfois jusqu'à des milliers de patients DM1 ^4. En conséquence, les protéines liant l'ARN, tels que muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP et Elav comme la famille 1 (Celf1), sont misregulated. En raison de la séquestration des répétitions CUG expansées, MBNL1 perd sa capacité à réguler ⁵ l' épissage alternatif. Celf1, d'autre part, est régulée à la hausse de ^6,7. La surexpression de Celf1 est associée à la perte de muscleet la faiblesse, qui ne sont pas attribués à la perte de la fonction MBNL1. Les modèles animaux simulant des altérations DM1-connexes, y compris DMPK 3'-UTR extension CUG, la perte de MBNL1, et la surexpression de Celf1, ont été établis. Cependant, la modélisation DM1 dans les myoblastes offre une alternative efficace, en particulier pour disséquer les événements cellulaires et moléculaires DM1 liées.

C2C12 lignée cellulaire de myoblastes a été isolé à partir du muscle de souris C3H blessés et largement utilisé pour étudier la différenciation myogénique ^8,9. les cellules C2C12 prolifèrent rapidement dans le sérum de fœtus bovin (FBS) contenant des médias et facilement subissent une différenciation lorsque FBS est épuisée. Pourtant, l'utilisation de ce modèle de différenciation des myoblastes présente deux difficultés: Des cellules C2C12 sont souvent résistantes aux gènes de transfection / transduction virale; et de légères variations dans la manipulation des cellules et de la procédure de différenciation peut conduire à des changements marqués dans la formation de myotubes.

Notre laboratoire utilise régulièrement myoblastes C2C12 comme acmodèle et ell a développé des protocoles qui fournissent efficacement des gènes par transfection plasmidique, la transduction rétrovirale et lentiviral transduction en C2C12 lignée cellulaire ^10. Dans la vidéo, nous démontrons les procédures optimisées pour la transfection / transduction C2C12 cellules et le maintien de la cohérence de la différenciation dans l'établissement de modèles de myoblastes DM1.

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Protocole

1. C2C12 Culture cellulaire

1. Maintenir les myoblastes de souris C2C12 dans une plaque de 100 mm dans du milieu de croissance (milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)) supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 20%, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Laisser les cellules C2C12 à des passages à devenir environ 50 - 60% de confluence.
2. Jeter le milieu de croissance et laver les cellules C2C12 avec une solution saline 3 ml température ambiante tamponnée au phosphate (PBS). Retirer le PBS et on ajoute 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA pour détacher les cellules. Placer la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant 3 - 5 min.
3. Neutraliser la trypsine en ajoutant 3 ml de milieu de croissance. Pipeter 6 - 8 fois de suspendre les cellules. Ajouter 1 ml de cellules en suspension dans une nouvelle plaque de 100 mm et incuber à 37 ° C, 5% de CO _2.

2. C2C12 cellulaire Transfection / transduction et sélection

1. C2C12 transfection plasmidique
   1. 24 h avant la transfection, pfin 7,0 x 10 ⁵ cellules C2C12 dans un puits d'une plaque à six puits pour chaque transfection.
      Note: Ceci conduit à 50 - 60% de confluence au moment de la transfection.
   2. Laisser le réactif de transfection à venir à la température ambiante avant utilisation.
   3. Ajouter 2 pg d'ADN plasmidique (GFP-CUG5 ou GFP-CUG200) dans 200 ul préchauffé milieu sans sérum et vortex brièvement. Ajouter 6 ul réactif de transfection au milieu et mélanger immédiatement pendant 30 secondes en utilisant un vortex. Laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante.
   4. Changer les médias de cellules C2C12 à 2,5 ml de milieu de croissance sans sérum. Ajouter le mélange de transfection aux cellules après incubation. Retourner les plaques à 5% de _CO2, 37 ° C incubateur.
   5. Maintenir les cellules dans le mélange de transfection / milieu de croissance exempt de sérum pendant 4 heures ou jusqu'à la nuit. Changer les médias vers les médias de croissance le lendemain ou lorsque cytotoxicité est apparente.
      Remarque: La cytotoxicité est évaluée par inspection microscopique de la CElls. Observer les modifications de la morphologie cellulaire et le détachement des cellules. Tant qu'il n'y a pas de cytotoxicité manifeste, une nuit d'incubation dans un milieu de croissance sans sérum améliore la transfection.
   6. Sélectionner les cellules 48 h après la transfection par l'addition de 1,2 à 1,6 mg / ml de G418 pendant environ 10 jours jusqu'à ce que la culture témoin (sans transfecté les plasmides) n'a pas de cellules vivantes. Changer les médias tous les deux jours avec un milieu de croissance supplémenté en G418.
   7. Maintenir les cellules résistantes au G418 dans un milieu de croissance et de 5% de _CO2 à 37 ° C pour les expériences ultérieures.
2. Préparation de retrovirus et la transduction rétrovirale C2C12
   1. Préparer HEK 293 du milieu de culture en la complétant DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine.
      1. Environ 24 heures avant la transfection, la plaque 4,0 x 10 cellules d'emballage à base de 293 HEK ⁶ écotropes dans une plaque de 100 mm (80% de confluence à la transfection) contenant milieu de culture cellulaire.
   2. Laisser le réactif de transfection à venir à la température ambiante avant utilisation.
   3. Mélanger 15 pg d'ADN de plasmide (ou pMSCV-Puro-pMSCV Celf1Flag-Puro) dans 1 ml de milieu de croissance sans sérum. brièvement Vortex. Ajouter 30 ul de réactif de transfection de l'étape 2.2.2 dans le / milieu de croissance tubes sans sérum d'ADN, et bien mélanger à l'aide vortex. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min.
   4. Ajouter goutte à goutte le mélange de transfection aux cellules d'emballage à base de écotrope 293 HEK. Agiter doucement les plaques et les retourner à la 5% de CO _2, 37 ° C incubateur. Après 24 heures, changer les médias à moyen 10 ml préchauffée croissance frais.
   5. Récolter le surnageant (contenant les retrovirus) 48 heures après transfection en utilisant une pipette et transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Ajouter 10 ml de nouveaux médias chauds à la plaque et le retourner à l'incubateur. Gardez le surnageant à 4 ° C.
      Note: Le support est ajouté doucement à til côté du puits de manière à ne pas perturber la monocouche cellulaire.
   6. Récolter le deuxième lot de surnageant 60 h après la transfection et la piscine avec le surnageant de 2.2.5. Centrifuger à 500 x g, 4 ° C pendant 7 min pour éliminer les débris cellulaires.
   7. Transférer le surnageant dans un nouveau 50 ml tube de centrifugeuse. Utilisez retrovirus pour transduire des cellules C2C12 à ce point en procédant à l'étape 2.2.9 ou aliquote et stocker le surnageant à -20 ° C pour une utilisation future.
   8. Décongeler le retrovirus de 2.2.7 à la température ambiante, si un stock congelé est utilisé ici.
      Remarque: évitez de multiples cycles de gel-dégel.
   9. Plaquer les cellules C2C12 le même jour de la transduction visant à 30-40% de confluence.
      1. Jeter le milieu de croissance et laver les cellules C2C12 avec 3 ml température ambiante PBS. Retirez le PBS, ajouter 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA, et incuber la plaque dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant 3 - 5 min.
      2. Neutraliser la trypsine en ajoutant 3 ml med de croissanceium. Pipeter 6 - 8 fois de suspendre les cellules. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et ajoutez 8,0 x 10 ⁵ C2C12 cellules à une plaque de 60 mm.
   10. Ajouter 0,5 ml retrovirus pour infecter une plaque de 60 mm de cellules dans 3 ml de milieu de croissance. Remettre la plaque dans l'incubateur.
   11. Remplacez-le par 3 ml de milieu frais additionné de sélection antibiotique (puromycine 1-3 pg / ml) 48 heures après l'infection. Remplacer 3 ml de milieu avec des antibiotiques tous les jours pour ~ 5 jours jusqu'à ce que la culture de contrôle de C2C12 non transduites meurt.
3. préparation lentivirus et C2C12 lentiviral transduction
   Remarque: Effectuez toutes les procédures liées à lentivirus en niveau de biosécurité 2 cabinet et suivre les directives de sécurité biologique. Les déchets liquides contenant le virus doit être désinfecté avant leur élimination.
   1. Plaque 4,0 x 10 ⁶ cellules 293T dans une plaque de 100 mm (~ 80% de confluence au jour de la transfection) avec HEK 293 du milieu de culture cellulaire (DMEM riche en glucose, supplémenté avec 10% du foetussérum bovin, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine) 24 h avant la transfection.
   2. Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante. Mélanger les vecteurs d'emballage lentiviral (4 pg pMD2.G et 6 pg psPAX2) avec vecteur de transfert lentiviral 8 pg (Celf1 shRNA ou brouillés contrôle shRNA) dans 1 ml de sérum milieu de culture cellulaire libre. brièvement Vortex.
   3. Ajouter 36 ul préchauffée réactif de transfection à l'ADN / tube de DMEM et bien mélanger par vortex. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min.
   4. Éliminer les cellules 293T de l'incubateur et ajouter le mélange de transfection à la plaque. Agiter doucement la plaque et le retourner à 5% de CO _2, 37 ° C incubateur. Après 24 heures, remplacer le mélange de transfection avec 10 ml de milieu de culture frais.
   5. Recueillir le surnageant contenant lentivirus 48 h après la transfection et le transférer dans un tube de 50 ml de centrifugeuse. Ajouter 10 ml nouveaux médias chauds à la plaque et le retournerdans l'incubateur. Stocker le surnageant à 4 ° C.
   6. Recueillir le deuxième lot de surnageant 60 h après la transfection et les combiner avec le surnageant de 2.3.5. brièvement Centrifuger à 500 xg, 4 ° C pendant 7 min.
   7. Transférer le surnageant dans un 50 ml tube frais de centrifugeuse. Si vous utilisez le virus frais, passez à l'étape 2.3.9. Pour une utilisation ultérieure, magasin contenant le virus surnageant à -20 ° C en aliquotes de 10 ml.
   8. Décongeler le virus de 2.3.7 à la température ambiante avant de l'utiliser, si un stock congelé est utilisé.
      Remarque: évitez de multiples cycles de gel-dégel.
   9. cellules C2C12 Plate-CUG200 (obtenus dans la section 2.1), comme décrit dans 2.2.9 le jour même de la transduction.
      Note: But pour 30 - 40% de confluence.
   10. Ajouter 0,5 ml virus pour infecter une plaque de 60 mm de C2C12-CUG200 et retourner la plaque dans l'incubateur.
   11. Remplacer le milieu de culture avec du milieu frais supplémenté avec l'antibiotique de sélection (puromycine: 1 - 3 pg / ml) 72 h après transduction.Actualiser les milieux de culture tous les jours avec l'antibiotique de sélection pour ~ 5 jours jusqu'à ce que toute la culture de contrôle C2C12-CUG200 non transduites meurt.
   12. Utilisez Western blot pour vérifier knockdown Celf1 dans les cellules transfectées GFP-CUG200.

3. C2C12 Différenciation Cellulaire

1. Plate 2 x 10 ⁶ cellules dans un puits d'une plaque à 6 puits dans 2,5 ml de milieu de croissance 24 heures avant l' initiation de la différenciation.
   Note: La densité de placage peut être ajustée de telle sorte que toute la confluence est atteinte en 24 h.
   1. Rincer les cellules confluentes avec du PBS et on ajoute 2,5 ml de milieu de différenciation à faible sérum (milieu modifié d'Eagle supplémenté avec 2% de sérum équin, 100 U / ml de pénicilline de Dulbecco, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1 pM d'insuline) . Remplacer le milieu tous les deux jours.
      Remarque: Conservez l'insuline stocks congelés et l'ajouter aux médias à chaque changement de milieu.
2. Au cours de la différenciation C2C12, prélever des échantillons pour quantitatif RT-PCR (voir la section 4) aux points de temps suivants: Day0, 1, 2, 4 et 6. Procédé pour la culture immunocoloration au jour 6 - 8 (voir la section 5).

4. Isolement de l'ARN et RT-PCR quantitative

1. Utiliser le protocole du fabricant pour isoler l'ARN. Après isolement, resuspendre le culot d'ARN dans 30 l'eau libre de RNase-ul et pipeter monter et descendre plusieurs fois.
   Note: Les échantillons peuvent procéder à RT-PCR quantitative ou peuvent être conservés à -80 ° C.
2. Utilisez un kit RT qPCR pour RT-PCR quantitative ¹⁰ et suivre les instructions du fabricant. Préparer le mélange réactionnel selon le Tableau 1.

Composant	Volume (ul)	La concentration finale
2 x tampon de réaction	dix	1 fois
amorce sens	0,5	200 nm
amorce antisens	0,5	200 nm
Sonde	0,5	200 nm
Transcriptase inverse et RNase Inhibitor	0,1	0,25 U / ml
Modèle	1	100 ng d'ARN total
RNase eau libre	7.4	N / A
Mix total	20

Tableau 1. RT-PCR quantitative Master Mix Préparation

3. Exécuter un 20 pi réaction de RT-qPCR utilisant le profil thermique Tableau 2.

étape de transcription inverse	30 mn, 48 ° C
polymère d'ADNactivation ase / transcriptase inverse inactivation	10 mn, 95 ° C
40 cycles	15 s, 95 ° C
	1 min, 60 ° C,

Tableau 2. RT-PCR quantitative profil thermique

5. immunocoloration

1. Fixer la culture monocouche dans 2,5 ml fraîchement préparé paraformaldehyde à 4% / PBS à température ambiante pendant 10 min.
2. Perméabiliser les échantillons dans 2,5 ml de 0,1% de Triton X-100 / PBS pendant 30 min à température ambiante.
3. Transférer les échantillons à une chambre humidifiée. Bloquer les échantillons dans 2,5 ml de tampon de blocage (tensioactif non ionique 0,1% / PBS, 10% de sérum de chèvre normal) pendant 30 min à 37 ° C.
4. Jeter un tampon de blocage et d'appliquer 800 anticorps primaire ul contre Chain myosine lourd dilué dans un tampon de blocage (1: 100). Incuber pendant une nuit dans une chambre humidifiée à température ambiante.
5. Laver la plaque 3 times (10 min chacun) avec 2,5 ml de tampon de lavage (0,1% de polysorbate 20 / PBS) le jour 2.
6. Retirer le tampon de lavage et appliquer 800 pi d'anticorps secondaire (chèvre anti-IgG de souris, 1: 500 dilué dans du PBS). Incuber dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 1 h.
7. Laver deux fois (10 min chacun) avec un tampon de 2,5 ml de lavage.
8. Laisser incuber avec 800 ul de DAPI (1 pg / ml, diluée dans distillée H ₂ O déminéralisée) pendant 5 min.
9. Laver avec 2,5 ml de tampon de lavage à nouveau pendant 10 minutes.
10. Changer le tampon de lavage dans 2,5 ml de PBS et en utilisant un microscope à fluorescence pour capturer des images.

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Résultats

les cellules C2C12 ont été transfectées avec GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Après la sélection de résistance aux médicaments, les pools stables ont été établies, qui peut être visualisée par l' expression de GFP (figure 1A). La formation de myotubes dans les myoblastes différenciés a été détectée par la myosine chaîne lourde immunocoloration ¹⁰ (figure 1B). La quantification de la formation de myotubes ont démontré que les in...

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Discussion

Lignée cellulaire C2C12 a été utilisé comme modèle pour étudier la myogenèse ^11-14. Ces cellules conservent un aspect fibroblaste, prolifèrent rapidement dans les milieux contenant 20% de sérum fœtal bovin et facilement différencier dans un milieu contenant 2% de sérum équin ^15. La croissance rapide et la différenciation sont des caractéristiques avantageuses dans un modèle cellulaire de la myogenèse. Ici, nous démontrons l'utilisation du plasmide, rétroviral et vecteurs lent...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-084	for culture medium
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Life Technologies	10378-016	for culture medium
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I6634-100MG	for differentiation medium
equine serum	Atlanta Biologicals	S12150	for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	for transfection
G418 sulfate	Gold Biotechnology	G-418-10	for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride	Sigma Aldrich	sc-108071	for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well	Life Technologies	NP0323BOX	for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)	Life Technologies	NP00061	for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	NP0002	for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m	GE healthcare life science	10600015	for western blot
MF 20	Developmental Hybridoma Bank	MF 20	primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate	Thermo Fisher Scientific	T-862	secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix	AnaSpec	05-QPRT-032X	for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent	Roche	11667165001	for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1)	santa cruz	sc-20003	primary Ab western blot
Actin Antibody	santa cruz	sc-1615	goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack	Clontech	631507	cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro	Clontech	634401	empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro	house-constructed	not available	retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2	gift from Didier Trono	not available	for lentivirus preparation
pMD2.G	gift from Didier Trono	not available	for lentivirus preparation
GFP-CUG5	gift from M.S. Mahadevan	not available	details in reference 10
GFP- CUG200	gift from M.S. Mahadevan	not available	details in reference 10
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	for immunostaining
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148	for immunostaining
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P9416	for immunostaining
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	for immunostaining